老化参池刺参腐皮综合征致病原的分离与鉴定

从患病刺参体表病灶组织分离出菌株060330B,其优势度高达90%,人工回接感染试验证实其具有较强的致病性,可导致健康刺参出现与自然患病刺参相同的症状。通过形态学观察、API半自动化鉴定和常规生理生化试验的结果表明,菌株060330B具有假单胞菌属的特征,其表型特征与恶臭假单胞菌相似。对该菌株进行16SrRNA基因序列分析和构建系统发育树,结果显示其与恶臭假单胞菌的亲缘关系最近,相似率达到99.5%。菌株060330B可鉴定为恶臭假单胞菌,并视为养殖刺参腐皮综合征的致病原之一。通过对多起不同来源患病刺参的研究表明,使用年限长、淤泥层厚呈黑色并伴有腥味的养殖池塘在该时期容易导致刺参腐皮综合征的发生。     

福州地区大黄鱼变形假单胞菌的分离与鉴定

为研究2013年春夏之际罗源湾海区网箱养殖大黄鱼(Pseudosciaena crocea)内脏出现白点症状的病原,从具有临床症状的大黄鱼内脏中分离到优势菌,经回接感染试验证实该菌为病原菌;分析该病原菌的形态特征、理化特性、分类地位及药物敏感性等特性,结合16S r DNA序列构建的进化树与假单胞菌属恶臭群中的变形假单胞菌同源性最高,在99%以上,并通过看家基因gyr B序列分析进一步验证该菌为变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida);该菌对强力霉素、诺氟沙星、恩诺沙星3种抗生素敏感,对奥氟沙星、左氟沙星、四环素3种抗生素中度敏感。     

网箱养殖青石斑鱼的溃疡病病原

2002年夏季厦门同安湾一带气候炎热,降雨量少,海水盐度偏高,同安湾刘五店的网箱养殖石斑鱼大面积暴发溃疡病.本研究调查了石斑鱼溃疡病暴发的特征和症状,主要表现为肌肉溃疡坏死、眼球脱落、鱼骨暴露等.从病鱼体表及内脏分离出优势菌群命名为TS-628,经回归感染证实TS-628就是引发本次石斑鱼溃疡病的病原菌.对病原菌进行鉴定发现,该菌革兰氏染色呈阴性,电镜下观察菌体呈短杆状,极端单鞭毛,综合研究该菌在形态、生理生化、16S rDNA同源性及药物敏感性等方面的特性,基本确认分离到的病原菌为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi),该菌对氯霉素、壮观霉素等多种抗生素敏感,对万古霉素、青霉素G等抗生素不敏感.哈维氏弧菌是水产养殖病害常见病原菌,但作为养殖石斑鱼的病原菌在国内属首次报道.     

养殖刺参溃疡病杀鲑气单胞菌的分离、致病性及胞外产物特性分析

从患溃疡病的养殖刺参(Apostichopus japonicus)病灶处分离出1株优势菌H1,以浸浴、创伤浸浴、体腔注射和体壁肌肉注射等方式进行感染实验,证实菌株H1为养殖刺参溃疡病病原菌,并证明该菌通过体表创伤侵入的方式感染刺参,以创伤浸浴和体壁肌肉注射感染的LD50(半数致死量)分别为2.26×107CFU/尾和1.80×107CFU/尾。经形态学观察、生理生化特性分析和mini API系统鉴定,确定菌株H1为杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种(Aeromonas salmonicida ma-soucida)。提取菌株H1的胞外产物(ECP)进行致病性实验,结果表明ECP可导致刺参死亡,其对刺参的LD50为5.24μg蛋白/g体质量。H1-ECP具有酪蛋白酶、明胶蛋白酶、几丁质酶和淀粉酶活性,并具有溶血素活性;对底物偶氮酪蛋白(Azocasin)作用的酶比活力可达到674.5活力单位/mg蛋白,最适作用温度为50℃;对热不稳定,70℃作用30 min时,酪蛋白酶活性降到0;100℃作用30 min,ECP对刺参的毒性消失;ECP酶活可被10 mmol/L EDTA完全抑制,可被5 mmol/L PMSF抑制98.8%,Ca2 和Mg2 可使酶活性分别提高约9%和4%。结论认为,该病原菌通过体表创伤侵入方式感染宿主刺参,菌株H1胞外产物是其对刺参致病的因子之一。     

网箱养殖大黄鱼内脏白点病病原菌分离鉴定及致病性研究

为探究宁德市网箱养殖大黄鱼内脏白点病及其病原菌的致病性,通过宏基因组分析及对比,初步判定内脏白点病病原菌为假单胞菌属细菌。将分离纯化后的菌株ND2018对健康大黄鱼进行腹腔注射回归感染试验,证实菌株ND2018为大黄鱼内脏白点病病原菌。结合菌株ND2018的全基因测序结果,最终确定菌株ND2018为变形假单胞菌。试验结果显示,变形假单胞菌ND2018为条件病原菌,菌液密度高于1×10~4 cfu/mL时,大黄鱼内脏出现白色结节症状,变形假单胞菌ND2018致病性得到体现。对白色结节内脏进行组织病理学观察,结果显示,病鱼的肝脏、脾脏和肾脏组织均发生炎性病变,含铁血黄素沉积,变性或坏死组织细胞与菌体形成肉芽肿组织结节,即为肉眼可见的"白点"。该菌株对新霉素、卡那霉素、呋喃唑酮、环丙沙星、复方磺胺以及多黏菌素B敏感,对恩诺沙星、庆大霉素、氟苯尼考等20种抗生素耐药。本试验结果可为该地区网箱大黄鱼健康养殖和内脏白点病防预及治疗工作提供基础理论参考。     

半滑舌鳎皮肤溃疡病病原研究

为了对半滑舌鳎皮肤溃疡病的病原进行研究, 从患有严重皮肤溃疡病的半滑舌鳎病灶中分离病原菌, 并经人工感染确认病原。对引起此次疾病的病原菌的形态特征、理化特性、胞外产物酶活性与溶血活性及其对抗菌类药物的敏感性等生物学特性进行了研究和分析, 还测定了16 S rRNA、gyrB基因序列, 分析了相应序列的同源性并构建了系统发育树。结果从病灶中分离得到4株优势菌, 经人工注射感染证实菌株A3为引起养殖半滑舌鳎皮肤溃疡病的病原菌, 其半数致死量LD50为1.5×104.2 CFU/mL。其中, 16 S rRNA、gyrB在GenBank中的登录号分别是JN391271、JN168881。从基于16 S rRNA与gyrB基因序列构建的系统发育树看, 分离筛选出来的病原菌与哈维氏弧菌同源性最高, 结合生理生化特征和16 S rRNA、gyrB基因序列分析结果, 认为该病原菌为哈维氏弧菌。胞外产物酶活性及溶血活性检测结果表明,该病原菌具有淀粉酶、尿素酶、脂肪酶、蛋白酶和卵磷脂酶活性而不具有明胶酶活性, 在4%羊血TSA平板上呈β溶血活性。病原菌的药物敏感性试验结果显示, 该菌对四环素、强力霉素、诺氟沙星、磺胺异恶唑等敏感, 而对其他用于试验的抗生素敏感度低或具有一定的抗性。     

中草药对刺参腐皮综合征病原菌的体外抑菌试验

用改良二倍稀释法和抑菌圈法测定了24种单方中草药和9种复方中草药对刺参腐皮综合征4种重要病原菌灿烂弧菌、假交替单胞菌、哈维氏弧菌和恶臭假单胞菌的体外抑菌活性。结果显示,不同中草药对特定病原菌抑菌效果差异较大,单方中草药最低抑菌浓度（MIC）为1.56mg/ml,中草药水煎剂H-5和H-9对假交替单胞菌的抑菌圈最大,达22mm。单方中草药中穿心莲、大青叶、金银花和川芎4种中草药对4株病原菌抑菌效果最好,其水煎剂对4株病原菌平均抑菌浓度分别为6.25、7.81、5.86和3.52mg/ml;平均抑菌圈直径分别是17.5、11.3、14.0和11.5mm。将筛选的4种单方中草药组成9种复方,复方MIC和抑菌圈均显著好于单方,最低MIC降低到0.20mg/ml。其中复方HC-G和HC-D抑菌浓度最低,效果最好,平均抑菌浓度分别降低为0.54和0.64mg/ml;平均抑菌圈直径分别为15.3mm和16.3mm。试验结果显示,复方最佳配比为穿心莲、大青叶、金银花和川芎=2∶1∶3∶2。该复方可为生产高效专用中草药,以替代抗生素,为刺参健康养殖提供技术保障。     

DGGE分析不同盐度仿刺参养殖环境中菌群多样性

采用16S rDNA的PCR-DGGE基因指纹技术对不同盐度仿刺参养殖水环境中的菌群多样性进行了分析。试验设置了22、26、30、34,4个盐度梯度,每隔10 d采样1次,通过PCR-DGGE指纹分析发现,仿刺参养殖环境存在着丰富多样的细菌。其中大多属于非可培养细菌,变形菌门和CFB门的种类是水体中的优势菌群,交替假单胞菌属是报道过的腐皮综合征的致病菌。根据DGGE指纹图谱的聚类分析发现,同等盐度条件下的样品之间存在一定的菌群相似性,并在聚类分析图中分别各自成簇。样品的多样性指数为1.7～2.3,不同盐度条件下,样品的多样性指数随着时间的推移变化不大。     

刺参池塘养殖系统中1株副干酪乳杆菌的分离及其生物学特性研究

本研究利用MRS培养基，从山东东营刺参(Apostichopus japonicus)养殖池塘环境中分离到56株乳酸菌。以刺参腐皮综合征2种重要致病菌灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为指示菌，采用牛津杯法测定所分离的乳酸菌对2株致病菌的抑制效果，筛选出1株具有较强抑菌活性的乳酸菌CSND-6，并对该细菌的形态、胞内产物和胞外产物的抑菌活性、生理生化实验、16S rDNA序列分析、菌株生长特性及对刺参安全性进行了研究。结果显示，菌株CSND-6对灿烂弧菌和假交替单胞菌的生长具有较好的抑制作用。其中，胞内产物的抑菌圈分别为17、22 mm，胞外产物的抑菌圈分别为25、31 mm。该菌株对刺参的高浓度浸浴胁迫实验结果表明，所分离的菌株对刺参是安全的。通过生理生化和16S rDNA序列分析表明，CSND-6属于乳杆菌科(Lactobacillaceae)，与副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei JCM1171)的相似性为99.83%。菌株CSND-6在30℃~44℃、pH 为6~8范围内生长较快，24 h后进入对数生长期，28~32 h时达到生长高峰，最高值达2.10×109 CFU/ml。本研究筛选的副干酪乳杆菌属于刺参池塘养殖环境中土著益生菌，对刺参的主要病原菌抑制效果较好，并表现出了较好的生长特性，可为养殖池塘刺参疾病的生态防控和乳酸菌开发提供参考。     

河蟹细菌病病原分离与鉴定

1999～2004年对安徽省巢湖市境内8个乡镇的1300 hm2池塘、稻田养殖的中华绒螯蟹细菌性疾病进行了研究。结果表明:中华绒螯蟹细菌性疾病主要出现“颤抖”、“黑鳃”、“肝腺糊化”、“腹水”和“烂肢或腐壳”等5种常见病症;从患病蟹体内分离、鉴定出嗜水气单胞菌、粪产碱菌、少动假单胞菌、反硝化产碱菌、产吲哚黄杆菌、产碱假单胞菌和苏云金芽孢杆菌等7株病原菌。     

福建海区网箱养殖刺参“腐皮综合症”病原分析与鉴定

2011年冬季,福建省宁德市霞浦县海区网箱养殖刺参发生"腐皮综合症",并伴有死亡现象出现。刺参的发病症状表现为:厌食、排脏、身体萎缩、体表局部溃烂乃至大面积溃烂。从患病刺参病灶处分离得到两种优势细菌CS1和CS2。经人工回接感染实验证明两种菌对健康刺参都具有较强的感染性,且感染病参的症状与自然发病刺参的症状相同。通过生理生化试验、16S rDNA序列分析及系统进化树分析,结果表明两株菌分别与灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)相似。菌株CS1与灿烂弧菌的亲缘关系最近,相似率达到99%,菌株CS2与假交替单胞菌的亲缘关系最近,相似率达到95%。菌株CS1可鉴定为灿烂弧菌,菌株CS2可鉴定为假交替单胞菌。另外,在患病刺参呼吸树膜和腔体内发现大量后口虫(Boveria sp.)。所以导致本次刺参"腐皮综合症"的原因可能是致病性细菌和寄生虫共同作用的结果。本文首次揭示了该地区"腐皮综合症"导致养成刺参大规模死亡的致病原因,对刺参病害防治和健康养殖具有重要的指导意义。     

养殖刺参“腐皮综合征”致病菌——灿烂弧菌的原位杂交检测方法的建立与应用

以养殖刺参“腐皮综合征”的重要致病菌——灿烂弧菌Vibrio splendidus的16S~23S间隔区序列,设计特异性引物,用PCR方法制备地高辛(DIG)标记探针,建立了原位杂交技术检测感染刺参体内灿烂弧菌的技术方法,并利用该方法对人工感染刺参和健康刺参各组织进行检测。结果显示,感染刺参的体壁结缔组织、肌肉组织、肠粘膜上皮、辐水管等组织的原位杂交检测呈阳性,而与健康刺参组织无交叉反应。在感染组织中,阳性信号（显色）强弱清晰,能准确反映出灿烂弧菌的侵染部位及感染程度,这为探明灿烂弧菌的感染途径、感染病程等致病机理研究奠定了基础,也为养殖刺参疾病预防和健康管理提供了技术支撑。     

Biological characteristics and pathogenicity of a highly pathogenic Shewanella marisflavi infecting sea cucumber, Apostichopus japonicus

Shewanella marisflavi isolate AP629 is described as a novel pathogen of sea cucumber. The LD(50) values (14 days) in sea cucumber, mice and swordtail fish were 3.89 × 10(6) , 6.80 × 10(4) and 4.85 × 10(4) CFU g(-1) body weight, respectively. Studies on S. marisflavi were conducted, including morphology, physiological and biochemical characteristics, haemolysis, whole-cell protein and 16S rDNA gene sequence. Colonies of S. marisflavi appeared faint red on marine agar and green on thiosulphate-citrate-bile salt-sucrose media. Shewanella marisflavi had polar flagella. The cells were Gram-negative, oxidase- and catalase-positive and not sensitive to O/129. The bacterium exhibited β-haemolysis on sheep blood agar and produced H(2) S. Shewanella marisflavi survived and grew at 4-35°C, pH 6.0-9.2 and in the presence of 0-8% NaCl. The whole-cell proteins included 13 discrete bands, and proteins of molecular weight 87, 44 and 39 kDa were found in all five strains of Shewanella spp. The difference in 16S rDNA gene sequences in S. marisflavi was at the 446 bp site: S. marisflavi (KCCM 41822) - G, isolate AP629 - A. This is the first report that Shewanella is pathogenic to sea cucumber.     

仿刺参幼体烂胃病及其致病原鉴定

山东、辽宁两省在仿刺参（Apostichopus japonicus）苗种培育期间的5-7月，耳状幼体易发生一种以胃壁增厚、萎缩、溃烂为主要特征的“烂胃病”。从患烂胃病的耳状幼体中分离到1株细菌LW-1，人工回接感染实验证实其具有较强的致病性，并与自然发病症状相同。通过API半自动化鉴定和常规的生理生化试验的结果表明，LW-1具有弧菌属的特征，其表型特征与灿烂弧菌（Vibrio splendidus）相似。对该菌株16S rRNA基因序列分析和构建系统发生树。结果显示，菌株LW-1与灿烂弧菌的亲缘关系最近，相似率达到99．8％。菌株LW-1可鉴定为灿烂弧菌，并视为耳状幼体烂胃病的致病原之一。通过对多起仿刺参苗期烂胃病的调查研究表明，烂胃病病原也具有多样性和复杂性，并与投喂老化腐败的单胞藻饵料有关。     

刺参(Apostichopus japonicus)保苗期“肠炎病”及其治疗方法

对2014年3月山东省蓬莱某刺参(Apostichopus japonicus)保苗场患“肠炎病”的刺参进行了临床症状和组织病理学观察以及病原菌分离与鉴定,利用氟苯尼考为治疗药品,以脏壁比、增重率和特定生长率为评判指标,探讨了3种不同用药方式(口服、药浴、口服+药浴)对刺参保苗期“肠炎病”的治疗效果.结果显示,刺参“肠炎病”症状表现为体色发黑,附着能力弱,摄食和活动能力差,解剖后可见肠道内食物不连续,肠腔内有大量黄白色粘液或浓状物质,肠道壁变脆、韧性差且易断裂,显微镜下观察到肠道存在大量细菌;组织病理学显示,患病刺参肠道绒毛膜散乱、粘膜层溃散,结缔组织散乱,且与肌肉层分离较明显.自刺参肠道处分离出优势度最高的细菌In-1菌株,人工感染实验证实,该菌为刺参“肠炎病”致病菌,该致病菌主要来源于饲料藻粉.利用细菌形态观察、生理生化和分子生物学方法(16S rDNA和gyrB)鉴定该菌株为哈维氏弧菌(Vibrioharveyi).该菌株对头孢三嗪、阿奇霉素、强力霉素和氟苯尼考等12种药物高度敏感.不同用药方式的治疗效果显示,使用氟苯尼考药浴可获得最佳治疗效果,刺参经药浴治疗后增重率达(24.23±0.41)％,特定生长率达(0.77±0.01)％/d.本研究可为刺参疾病防控和健康养殖提供理论依据和技术参考.     

Ultraviolet light disinfection of shellfish hatchery sea water: I. Elimination of five pathogenic bacteria

Filtered sea water was seeded with one of five oyster-pathogenic bacteria to obtain a final concentration of 10⁵ cells/ml. UV irradiation at a dose of 93 312–155 520 μW s^?1 cm^?2 rendered the contaminated sea water safe for rearing fertilized eggs of Crassostrea virginica. Fertilized oyster eggs were reared until the larvae began to set in filtered, UV-irradiated sea water and in filtered, non-UV-treated sea water. The data suggest that when a pathogenic bacterium is present the potential for disease is much greater in non-UV-treated sea water.     

池塘养殖刺参腐皮综合征发病环境因素分析

通过对2014年7—8月山东省青岛市红岛邵哥庄(SGZ)和宿流(SL)两个社区的发生刺参腐皮综合征和未发病刺参养殖池的环境因子跟踪监测和对比,解析发病的原因。从发病前至发病后,分别监测了两地多个池塘水体中的4类可培养细菌(总异养菌、弧菌、硝化细菌和硫化细菌)和6项理化参数(温度、p H、盐度、溶解氧、无机氮、COD),以及沉积环境中6类可培养细菌(总异养菌、弧菌、硝化细菌、硝酸盐还原菌、硫化细菌、硫酸盐还原菌)和4项理化参数(pH、氧化还原电位、硫化物、有机碳)。结果表明,刺参发病时,邵哥庄发病池(SGZ-1~#)环境中细菌数量与未发病对照池(SGZ-2~#)无显著差异,但温度高达25.94℃,盐度低至24.47,均超过刺参耐受限度。水体NO_2-N含量为79.56μg/L,沉积物中硫化物含量为221.1 mg/g,均高于对照池;宿流发病池SL-南2弧菌数量(1.85×10~4 CFU/mL)在发病当日明显升高,高于对照池SL-北1和邵哥庄社区的发病池,而发病池的理化指标反而好于对照池。由此推断,邵哥庄社区的刺参发病与池塘理化指标突变有密切关系,而宿流的刺参发病与病原菌数量激增有密切关系。因此,应从理化指标和病害生物两方面对刺参病害进行预警及采取防治措施。     

两种海洋寡糖对仿刺参免疫活性的影响

研究了褐藻酸钠寡糖(AOS)和壳寡糖(COS)对仿刺参(Apostichopus japonicus)生长及免疫功能的影响。实验分为对照组、COS组和AOS组,对照组投喂企业常规饲料,COS组在对照组饲料基础上添加壳寡糖(1 g·kg~(-1)),AOS组在对照组饲料基础上添加褐藻酸钠寡糖(1 g·kg~(-1))。在第30、60、90天,测定各组仿刺参的质量,并在第90天随机采集50 ind仿刺参的体腔液,测定酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、过氧化氢酶和一氧化氮合酶等免疫酶的活力。结果表明,AOS组和COS组仿刺参体质量分别比对照组增长16.4%和18.2%;AOS组仿刺参的酸性、碱性磷酸酶活性分别提高了75.1%和67.3%;而COS组仿刺参的过氧化氢酶和一氧化氮合酶的活性分别提高了190.3%和55.6%。海洋寡糖COS和AOS作为仿刺参的免疫增强剂,可有效提高幼参的生长性能和免疫力,其中COS的作用效果优于AOS。     

养殖刺参“化板症”病原菌的分离与鉴定

本研究对辽宁4家刺参育苗场患“化板症”的稚参进行了病原学分析,从患有“化板症”的稚参体表病灶处分离得到一株优势菌Aj2010072802A90.人工回接感染试验证实,该细菌能使稚参发生厌食、萎缩、降低附着力、溃烂、死亡等现象,具有较强的致病性,为此次“化板病”的病原菌.在此基础上,利用细菌形态观察、生理生化及16S rDNA分子生物学方法对该菌株进行了鉴定,结果显示,该菌为副溶血弧菌Vibrio parahaemol yticus.这是副溶血孤菌导致海参感染的首次报道.此外,本研究针对该病原菌进行了药敏学测试,证实所分离的副溶血弧菌菌株对氟苯尼考等药物高度敏感,相关研究结果将为刺参疾病防控和健康养殖提供了理论依据和技术支撑.     

刺参(Apostichopus japonicus)大水面养殖池塘环境中优势益生菌筛选及其特性分析

2014年12月-2015年12月,在大连地区刺参(Apostichopus japonicus)大水面养殖池塘进行了春、夏、秋、冬四季有益菌分离筛选,从其水体和底泥中共分离得到66株细菌.以刺参“腐皮综合征”主要病原菌——灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为指示菌进行拮抗作用实验,利用选择培养基对菌株产淀粉酶和蛋白酶的能力进行测定,最后通过安全性实验得到潜在益生菌株YQ-2.结果显示,该菌株对灿烂弧菌和假交替单胞菌有较强的抑制作用,抑菌圈分别达到22 mm和24 mm;对淀粉和蛋白选择培养基水解圈的直径达到22 mm和36mm.安全性实验显示,该菌株无论是在108 CFU/ml浸浴还是投喂108 CFU/g的粉末饲料感染,30 d内供试刺参没有发病和死亡现象,健康程度好,且相对于对照组的体重明显增长,108 CFU/g粉末饲料投喂组的相对增长率达到39.31％.此外,本研究对YQ-2菌株的生理生化指标、16S rDNA序列进行了分析,其同源性与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis strain KLP2015相似度达99％,故将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌.该株枯草芽孢杆菌在大水面刺参池塘四季水体中数量为140-280 CFU/ml,高于其他菌株;同时,该菌株在水体中还具有较高的优势度,优势度分别为4.2％、3.5％、2.6％、4.6％,冬、春季节的优势度明显高于夏、秋季节;它属于土著分离菌株,对引起刺参腐皮综合征的2株病原菌具有较强的抑制作用,这对刺参大水面生态养殖具有较大的应用潜力.