广西巴马小型猪CTGF基因真核表达载体构建 及其相关生物信息学分析

[目的]构建广西巴马小型猪结缔组织生长因子(CTGF)基因真核表达载体并鉴定其活性,为深入研究CT-GF在癌症发生中的作用及其分子机制提供参考,也为构建CTGF转基因广西巴马小型猪及研发基于CTGF的癌症基因治疗策略提供理论依据.[方法]利用RT-PCR从广西巴马小型猪肝脏组织中克隆CTGF基因,并将CTGF基因亚克隆到pDsRed-N1载体上,然后通过脂质体转染小鼠Hep3B细胞,转染48 h后于荧光显微镜下观察细胞是否表达红色荧光蛋白,同时利用在线生物信息学软件对其理化性质进行分析.[结果]成功克隆获得广西巴马小型猪CTGF基因编码区(CDS)序列,序列全长1050 bp,共编码349个氨基酸,与NCBI上已公布普通猪参考序列的同源性为99.5%,有5处碱基突变,且均为同义突变.将广西巴马小型猪CTGF基因亚克隆到pDsRed-N1载体上成功构建了阅读框架正确的广西巴马小型猪CTGF基因真核表达载体,转染小鼠Hep3B细胞48 h后有红色荧光蛋白表达.广西巴马小型猪CTGF蛋白具有较强的亲水性,其二级结构中α-螺旋、β-折叠、延伸链和无规则卷曲各占13.18%、5.73%、17.48%和63.61%.[结论]广西巴马小型猪CTGF基因在进化过程中的保守性非常稳定,通过构建的真核表达载体能转染小鼠Hep3B细胞并成功表达,可用于生产转基因广西巴马小型猪及研发与CTGF基因有关的疾病模型.     

猪细小病毒NS1基因真核表达载体pEGFP-N1-NS1的构建与表达

根据Gen Bank上发表的PPV的基因组序列,设计扩增非结构蛋白NS1基因的特异性引物。通过PCR方法克隆NS1基因,经双酶切及与pEGFP-N1载体连接构建了真核表达载体pEGFP-N1-NS1,将双酶切和测序鉴定正确的质粒转染至293T细胞,经过荧光观察和PCR方法鉴定。结果表明,克隆了猪细小病毒NS1基因的全序列1989 bp,成功构建了NS1基因的真核表达载体,并在293T细胞中转染表达。     

广西巴马小型猪ApoE基因真核表达载体的构建及鉴定

【目的】构建广西巴马小型猪载脂蛋白E基因（ApoE）真核表达载体,为生产转ApoE基因的广西巴马小型猪奠定基础。【方法】采用RT-PCR从广西巴马小型猪肝组织中扩增出ApoE基因编码序列,将该基因连接至pEGFP-C1载体上,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-C1-ApoE进行鉴定,并将重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞。【结果】广西巴马小型猪ApoE基因编码区序列长954bp,编码317个氨基酸,与GenBank已公布的猪ApoE基因cDNA序列（NM_214308）对应区段同源性为100%。构建的重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞48h后,在荧光显微镜下转染细胞发出荧光,细胞形态清晰,可见细胞核。【结论】广西巴马小型猪ApoE基因能与pEGFP-C1载体重组构建pEGFP-C1-ApoE真核表达载体,有效表达出ApoE蛋白。     

广西巴马小型猪ApoA1基因克隆及其生物信息学分析

[目的]克隆广西巴马小型猪载脂蛋白A1(ApoA1)基因并进行生物信息学分析,为后续开展ApoA1基因研究提供基础数据,同时为制作广西巴马小型猪动脉粥样硬化疾病模型打下基础.[方法]以提取的广西巴马小型猪肝脏组织总RNA为模板,运用RT-PCR克隆广西巴马小型猪ApoA1基因序列,以实时荧光定量PCR(qPCR)检测ApoA1基因在广西巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中的表达情况,并利用MegAlign、ProtParam、SOPMA、Net-Phos、SignalP和SWISS-MODEL等在线分析软件对广西巴马小型猪ApoA1基因进行生物信息学分析及构建系统发育进化树.[结果]广西巴马小型猪ApoA1基因编码区(CDS)序列长795 bp,与普通猪ApoA1基因序列的同源性为99.9%,仅第630处有1个碱基发生同义突变.ApoA1基因在广西巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中均有表达,且以肝脏中的相对表达量最高、脾脏中的相对表达量最低.广西巴马小型猪ApoA1由264个氨基酸残基构成,其分子式为C1343H2136N376O409S5,蛋白分子量为30254.31 Da,理论等电点(pI)为5.47,属于亲水性蛋白,存在跨膜结构,不存在信号肽,有18处磷酸化位点(丝氨酸磷酸化位点有10处,苏氨酸磷酸化位点有6处,络氨酸磷酸化位点有2处).广西巴马小型猪ApoA1的二级结构中,α-螺旋占79.92%,β-折叠占2.65%,无规则卷曲占11.12%,延伸链占6.31%,属于全α类蛋白.广西巴马小型猪ApoA1氨基酸序列与普通猪的同源性最高,达99.6%;由基于ApoA1氨基酸序列同源性构建的系统发育进化树也可看出,广西巴马小型猪与普通猪的亲缘关系最近.[结论]广西巴马小型猪ApoA1基因保守性强,以在肝脏中的表达量最高,是广西巴马小型猪抗动脉粥样硬化的重要因子,通过敲除该基因可制作广西巴马小型猪动脉粥样硬化疾病模型.     

广西巴马小型猪ApoE基因真核表达载体的构建及鉴定

【目的】构建广西巴马小型猪载脂蛋白E基因（ApoE）真核表达载体,为生产转ApoE基因的广西巴马小型猪奠定基础。【方法】采用RT-PCR从广西巴马小型猪肝组织中扩增出ApoE基因编码序列,将该基因连接至pEGFP-C1载体上,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-C1-ApoE进行鉴定,并将重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞。【结果】广西巴马小型猪ApoE基因编码区序列长954 bp,编码317个氨基酸,与GenBank已公布的猪ApoE基因cDNA序列（NM_214308）对应区段同源性为100%。构建的重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞48 h后,在荧光显微镜下转染细胞发出荧光,细胞形态清晰,可见细胞核。【结论】广西巴马小型猪ApoE基因能与pEGFP-C1载体重组构建pEGFP-C1-ApoE真核表达载体,有效表达出ApoE蛋白。     

广西巴马小型猪miR-148b慢病毒制备及靶基因通路预测分析

[目的]构建广西巴马小型猪miR-148b慢病毒表达载体并对其靶基因进行预测及相关通路分析,为揭示miR-148b的作用机制打下基础.[方法]以广西巴马小型猪血液基因组DNA为模板,扩增miR-148b的前体及部分侧翼序列,使用T4连接酶将目的片段连接至pLV-CMV-MCS-EF1载体上,构建获得pLV-miR-148b慢病毒表达载体;以pLV-miR-148b慢病毒表达载体转染293T细胞48 h后进行表达验证;利用miRDB、miRWalk 2.0和TargetScan 7.2三大数据库预测分析广西巴马小型猪miR-148b的靶基因,并以MirPath v.3分析miR-148b靶基因相关通路.[结果]广西巴马小型猪miR-148b片段大小为385 bp,与miRBase 21.0网站上已发布猪miR-148b成熟序列(前体和侧翼序列)的同源性达100%.构建获得的pLV-miR-148b慢病毒表达载体能在293T细胞中成功表达,且相对表达量极显著高于pLV-GFP慢病毒空载质粒转染组(P<0.01).数据库预测分析得到18个广西巴马小型猪miR-148b的靶基因,分别为CLOCK(时间昼夜调控因子)、MIER1(转录调控因子)、MECP2(甲基化CpG结合蛋白)、ZNF704(锌指蛋白)、SPTY2D1(SPT2染色质蛋白)、QKI(RNA结合蛋白)、ZBTB20(锌指蛋白)、MGAT4A(钠/磷酸转运蛋白)、UHMK1(编码蛋白激酶)、PIK3C2A(磷酸肌醇-3-激酶2α肽)、C6orf62(6号染色体开放阅读框62抗体)、HECW2(E3泛素蛋白连接酶)、MAP1B(微管相关蛋白)、NHS(NHS肌动蛋白调节因子)、B4GALT6(β-1,4-半乳糖基转移酶)、ATP2A2(肌浆ATP酶/内质网Ca2+转运酶)、AP4E1(蛋白复合物接头分子)和BBX(锌指蛋白);且发现有11条靶基因相关通路,其中与疾病相关的通路有脂肪酸合成通路、细胞外基质受体相互作用通路、癌症的蛋白聚糖通路、神经胶质瘤通路、癌症的小分子核糖核酸通路、肾细胞癌通路、N-聚糖生物合成通路和致心律失常性右室心肌病通路.[结论]广西巴马小型猪miR-148b慢病毒表达载体能在293T细胞中成功表达,miR-148b存在18个靶基因和11条相关通路,且主要在脂肪酸合成、N-聚糖生物合成及致心律失常性右室心肌病等相关疾病通路上发挥作用.     

广西巴马小型猪α干扰素基因克隆及其真核表达载体的构建

[目的]克隆广西巴马小型猪α干扰素基因（poIFN-α）全部编码序列并构建其哺乳动物真核表达载体,为研发重组猪干扰素类免疫佐剂及生物治疗制剂提供参考依据.[方法]应用RT-PCR扩增广西巴马小型猪poIFN-α编码序列,链接至pMD 18-T载体构建重组质粒,以测序正确的重组质粒为模板,PCR扩增带有酶切位点的poIFN-α基因,然后连接真核表达载体pTARGET构建重组表达载体pTARGET-poIFN-α,并转化感受态细胞DH5α,经双酶切初步鉴定正确后送至北京诺赛生物有限公司测序,用DNASTAR软件及Primer Premer 5.0等对获得的基因序列进行分析.[结果]以广西巴马小型猪总RNA为模板扩增获得的目的片段为618 bp,包含poIFN-α基因全部编码序列;将克隆获得的poIFN-α基因插入哺乳动物真核表达载体pTARGET中,可成功构建广西巴马小型猪重组表达载体pTAR-GET-poIFN-α.广西巴马小型猪poIFN-α与GenBank上已发表的猪、鼠、人IFN-α基因同源性分别为97.0％、78.2％和66.3％;其成熟肽与普通猪相比,共有17个位点发生碱基突变,其中第63、189、198、288、544、545位点为无义突变,第88、119、163、182、186、195、263、301、306、553、560位点为错义突变.[结论]IFN-α成熟肽在哺乳动物中保守性较差;克隆获得的广西巴马小型猪poIFN-α基因能成功插入哺乳动物真核表达载体pTARGET中构建重组表达载体pTAR-GET-poIFN-α,为研发重组猪干扰素类生物治疗制剂、免疫佐剂、构建小型猪疾病动物模型等奠定了基础.     

广西巴马小型猪ANK1基因启动子克隆及其活性分析

[目的]克隆广西巴马小型猪ANK1基因启动子,确定其活性核心区,为研究ANK1基因启动子与肉质性状的相关性及构建动物疾病模型打下基础.[方法]通过在线软件对ANK1基因启动子的转录因子结合位点进行预测,根据转录因子结合位点设计特异引物扩增不同长度的ANK1基因启动子片段,并利用双荧光素酶试剂盒检测其荧光值,以确定不同ANK1基因启动子片段的活性.[结果]发现ANK1基因启动子存在1个转录起始位点(TSS)、2个CpG岛和多个转录因子结合位点,并以此作为ANK1基因启动子的分段依据,将其分割为P638、P791、P1113、P1163、P1648、P1694、P1796和P2074等8个不同长度的目的片段.成功克隆获得的8个ANK1基因启动子片段经KpnⅠ和HindⅢ双酶切、T4真核表达载体连接、细胞转染等方法构建8个双荧光素酶重组报告基因,双荧光素酶试剂盒检测结果显示,广西巴马小型猪ANK1基因启动子在P1796片段活性最强,与其他片段存在显著差异(P<0.05).[结论]成功克隆获得广西巴马小型猪ANK1基因启动子的8个片段,且利用双荧光素酶试剂盒检测确定其核心启动子区域出现在P1796片段.     

广西巴马小型猪PAQR3基因克隆及表达谱分析

[目的]克隆广西巴马小型猪孕激素和脂联素分子受体3(PAQR3)基因,并研究该基因在广西巴马小型猪不同组织中的表达特性,为揭示PAQR3的功能及其在疾病模型中的作用打下基础.[方法]采用RT-PCR扩增广西巴马小型猪PAQR3基因,应用在线预测软件对其功能和结构进行生物信息学分析,并以qRT-PCR分析PA QR3基因在不同组织中的表达特性及高脂高糖诱导后的表达水平.[结果]广西巴马小型猪PAQR基因编码区(CDS)序列全长936bp,编码3l2个氨基酸,与人类(XM 0067141062)、猕猴(NM 001257693.1)、牛(XM 010806259.1)、家犬(XM 014109889.1)、家鼠(XM 006534874.2)、羊(XM_012180242.1)、鸡(XM_001233720.3) PAQR3氨基酸序列的一致性在81%以上,其中与猕猴的亲缘关系最近,与牛的亲缘关系相对较远.PAQR3蛋白氨基酸序列包含保守的HlyI Ⅱ结构域,为亲水性蛋白,有7个跨膜螺旋结构;其二级结构主要是延伸链,占31.83%;该蛋白不存在信号肽,不属于分泌蛋白.qRT-PCR分析结果表明,PA QR3基因在广西巴马小型猪的不同组织中均有表达,以在肺脏中的表达量最高、脂肪中的表达量最低;经高脂高糖诱导后,PAQR3基因在广西巴马小型猪肝脏组织中的表达水平显著降低(P<0.05).[结论]PAQR3基因在广西巴马小型猪不同组织中广泛表达,在胆固醇和甘油三脂充裕的条件下,机体可通过下调PAQR3基因的表达量来平衡胆固醇含量.     

猪源IKKγ在原核和真核表达系统中的表达及其多克隆抗体制备

[目的]制备猪源IKKγ多克隆抗体,为进一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示IKKγ蛋白与猪瘟病毒(CSFV)间相互作用机制打下基础.[方法]利用RT-PCR从猪肾细胞(PK-15)中克隆原核表达的IKKγ基因功能片段(561 bp),与原核表达载体pET-32a(+)构建原核重组质粒pET-IKKγ,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经纯化和浓缩后,免疫小鼠制备猪源IKKγ多克隆抗体.同时克隆IKKγ基因全长序列(1356 bp),与真核表达载体pCMV-HA构建真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ,分别转染293T细胞和PK-15细胞,检测融合蛋白表达情况.[结果]以原核重组质粒pET-IKKγ转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导能表达出约40 kD的融合蛋白,且融合蛋白主要以可溶性蛋白形式进行表达,可通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化,已获得较高纯度的融合蛋白IKKγ.构建的真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ能在293T细胞中成功表达出IKKγ蛋白;制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能与293T细胞表达融合蛋白IKKγ发生特异性反应,其抗体效价为1:16000,与PK-15细胞表达IKKγ蛋白也具有良好的反应性,其中CSFV感染后36 h是IKKγ蛋白表达高峰期.此外,制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能在PK-15细胞中成功检测到IKKγ蛋白,说明猪源IKKγ多克隆抗体与真核细胞瞬时表达的IKKγ蛋白特异性良好.[结论]制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体具有效价高、特异性强等特点,可用于检测CSFV感染PK-15细胞中IKKγ蛋白表达水平,为下一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示NF-κB信号通路转录调节功能机制提供技术支持.     

广西巴马小型猪与长白猪的BMP2和FGFR3基因序列及表达差异分析

【目的】明确广西巴马小型猪与长白猪的BMP2和FGFR3基因序列及表达差异,为进一步阐明大型猪与小型猪的体型形成机制提供理论依据。【方法】以1日龄的广西巴马小型猪和长白猪为研究对象,采集其四肢骨生长板软骨组织提取总RNA,反转录合成cDNA后用于扩增BMP2和FGFR3基因的编码区（CDS）序列,采用PCR-RFLP检测FGFR3基因SNP位点多态性,并通过实时荧光定量PCR分析BMP2和FGFR3基因在1日龄广西巴马小型猪和1日龄长白猪生长板软骨组织中的表达差异。【结果】1日龄广西巴马小型猪与1日龄长白猪的体型差异明显,其体重、体长和体高的差异均达极显著水平（P<0.01,下同）,股骨长的差异达显著水平（P<0.05,下同）。广西巴马小型猪和长白猪的BMP2基因CDS序列全长1188 bp,且2个品种猪的CDS序列完全一致;广西巴马小型猪和长白猪的FGFR3基因CDS序列全长808 bp,与NCBI已公布的FGFR3基因序列（XM_005666479.1）比对发现存在8个碱基突变位点及1个碱基缺失位点。广西巴马小型猪和长白猪共有5个错义突变位点,分别为A124G、C190G、A204C、C205A和C245T,另外3个突变位点是广西巴马小型猪A438G和C549T的同义突变及长白猪A752C的错义突变;碱基缺失位点为长白猪第328~330个碱基（GCA）缺失。FGFR3基因A2374G和C2620T位点的基因型及基因频率在广西巴马小型猪与长白猪间的分布差异极显著,对应的等位基因分布均不符合Hardy-Weinberg平衡,且2个基因座均处于连锁平衡状态。1日龄广西巴马小型猪生长板软骨组织中的BMP2基因相对表达量显著低于1日龄长白猪,而FGFR3基因相对表达量极显著高于1日龄长白猪。【结论】BMP2和FGFR3基因在猪的软骨和骨骼形成方面具有重要意义,其中,BMP2基因对猪骨发育起促进作用,而FGFR3基因对猪骨发育起抑制作用。广西巴马小型猪体型矮小与FGFR3基因高表达及BMP2基因低表达存在直接关联。     

猪CFL2b/荧光蛋白融合基因在小鼠成肌细胞中的表达与定位

[目的]了解猪CFL2b基因在成肌细胞中的表达与定位。[方法]用RT-PCR方法扩增得到猪CFL2b基因,连接到T载体上,双酶切后通过定向克隆将其与真核表达载体pEGFP-N1的绿色荧光蛋白基因融合,构建CFL2b-荧光蛋白融合基因表达载体。然后经真核表达质粒-脂质体介导,导入C2C12细胞系。[结果]荧光显微镜观察显示:在空白载体pEGFP-N1转染的C2C12细胞中荧光布满整个细胞,而在转染阳性载体pEGFP-N1-CFL2b的C2C12细胞中荧光主要聚集在细胞质的肌动蛋白丝。表明转染的C2C12细胞系能够高效表达猪CFL2b蛋白,猪CFL2b基因表达的蛋白定位于细胞质中。[结论]该研究为CFL2b基因的功能及该基因与猪肉质性状的相关性的研究奠定了基础。     

牛TLR2全长基因表达质粒的构建及其在HEK293细胞中的表达(英文)

[目的]构建牛TLR2全长基因表达质粒,并在HEK293细胞中表达。[方法]利用RT-PCR技术克隆TLR2基因的全长编码区,连接到pMD18-Tsimplevector,再亚克隆到pEGFP-N1载体,得到包含TLR2基因全长的重组真核表达质粒。将重组质粒瞬时转染到HEK293细胞。流式细胞计数法和共聚焦显微镜法检测转染效率和表达蛋白在细胞中的定位;qRT-PCR法检测TLR2 mRNA在HEK293/boTLR2中的表达。最后,通过脂膜酸刺激HEK293/boTLR2细胞试验来分析TLR2蛋白的生物活性。[结果]成功克隆TLR2基因全长并连接到真核表达载体,并在HEK293细胞中表达。在LTA刺激的条件下,转染重组质粒的细胞比未转染的HEK293细胞分泌更多IL-8。[结论]本研究建立的细胞模式为TLR激动剂和拮抗剂的筛选提供快速有效的手段,有利于开展TLR激动剂和TLRs相互作用的研究。     

pEGFP-N1-hTERT真核表达载体的构建与表达鉴定

[目的]构建pEGFP-N1-hTERT真核表达载体,观察其在真核细胞中的表达。[方法]利用pC1-neo-hTERT和pEGFP-N1质粒构建重组质粒,通过双酶切鉴定、DNA测序分析验证人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)片段的准确性。将pEGFP-N1-hTERT真核表达载体转染到大鼠胎儿神经干细胞(NSCs)中,通过绿色荧光蛋白间接观察人端粒酶逆转录酶蛋白在细胞中的表达定位,通过RT-PCR、WesternBlot验证所构建的真核表达质粒pEGFP-N1-hTERT的正确性。[结果]所构建的pEGFP-N1-hTERT真核表达载体结构正确并能够在真核细胞中表达。[结论]该研究为建立大鼠永生化NSCs系奠定了基础。     

猪CTSZ基因的克隆及真核表达载体的构建

组织蛋白酶Z基因(Cathepsin Z gene, CTSZ)是影响猪生长、肉质等性状的一个重要候选基因.本研究以长白猪的背最长肌为试验材料,采用RT-PCR的方法克隆CTSZ基因CDS序列全长,对该序列进行了生物信息学分析,并构建pEGFP-N1-CTSZ融合表达载体,通过脂质体介导瞬时转染猪成纤维细胞,30 h后进行荧光表达检测.结果本试验克隆出猪CTSZ基因CDS全序列912 bp,并成功构建pEGFP-N1-CTSZ融合表达载体,瞬时转染后在猪成纤维细胞中表现为绿色荧光蛋白表达.本试验为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础.     

从江香猪SP1基因组织表达特征及其超表达对间质细胞自噬和凋亡的影响

【目的】分析SP1基因在从江香猪不同组织及不同发育阶段睾丸中的表达情况及其对睾丸间质细胞自噬、凋亡的转录调控作用,为探究SP1基因调控间质细胞自噬的分子机制及提高从江香猪雄性繁殖性能提供理论基础。【方法】选取性早熟的从江香猪作为研究对象,PCR扩增得到其SP1基因编码区（CDS）序列,应用相关在线软件对CDS序列进行生物信息学分析,荧光定量PCR检测性成熟期从江香猪不同组织中SP1表达量,利用实时荧光定量PCR和Western blotting检测不同日龄从江香猪睾丸中的SP1基因表达量。【结果】生物信息学分析结果显示,SP1基因CDS序列全长为2361 bp,编码786个氨基酸残基,蛋白二级及三级结构以无规则卷曲和延伸链为主,无跨膜结构域和信号肽剪切位点,且为不稳定蛋白。SP1氨基酸序列有174个磷酸化位点,通过氨基酸同源性分析发现猪SP1与绵羊和牛的亲缘关系最近。对SP1在各组织的表达量进行检测,结果表明SP1基因相对表达量在脾脏中最高;此外,SP1的蛋白水平在180 d的香猪睾丸中有最高表达量,基因水平在30和180 d的香猪睾丸中有较高表达量。进一步构建SP1基因超表达载体,转染至从江香猪睾丸间质细胞,结果显示pEGFP-C1-SP1组的SP1相对表达量显著高于pEGFP-C1组（P<0.05,下同）,而自噬通路相关因子基因mTOR、LC3B、Beclin-1和凋亡相关因子基因Caspase-3、Bcl-2的相对表达量在超表达pEGFP-C1-SP1组显著低于pEGFP-C1组,但自噬凋亡信号因子ERK1/2和凋亡基因Bax的相对表达量无显著变化（P>0.05）。推测SP1基因可通过降低LC3B、Beclin-1、Caspase-3的表达来抑制睾丸间质细胞自噬凋亡的发生,或通过降低mTOR及抗凋亡基因Bcl-2的表达来促进凋亡发生。【结论】 SP1基因在从江香猪不同组织及睾丸发育不同阶段均有表达,且通过影响睾丸间质细胞自噬、凋亡相关基因表达,而在从江香猪初情期和性成熟期发挥重要的生理学作用。     

小鼠IL-5真核表达质粒的构建及表达

[目的]克隆小鼠白细胞介素-5（mIL-5）cDNA构建真核表达质粒,并转染293细胞检测其是否表达。[方法]以小鼠脾脏细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-5基因cDNA,酶切后插入pRc-CMV/Fc真核表达质粒中,构建重组真核表达质粒mIL-5/Fc-pRc-CMV,转染293细胞,RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。[结果]Fc-pRc-CMV中插入DNA序列与mIL-5 cDNA一致,重组质粒转染293细胞后,ELISA可检测出质粒能在293真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白。[结论]该研究成功克隆了小鼠IL-5基因cDNA,并构建其真核表达质粒。