RNA干扰(RNAi)的现象和作用机制以及在猪病防控中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)即双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)介导的同源mRNA特异性降解过程。RNAi的分子机制的研究也不断取得进展,目前研究得最多的是转录后基因沉默机制,RNAi发生过程主要分为起始阶段、沉默信号的放大和转移阶段、效应阶段。RNAi目前已经用于许多动物病毒性疾病的研究中,其中以在猪病治疗中的应用较为突出。     

刺参体内RNA干扰方法的初步研究

以刺参溶菌酶基因(lysozyme gene,LYZ)为靶基因探索构建刺参体内RNA干扰体系。构建了3个刺参溶菌酶基因特异性的RNA干扰重组质粒,以刺参体腔液原代培养细胞为靶细胞进行筛选;分别以口腔注射和腹腔注射的方式以及不同的注射剂量对刺参LYZ进行体内RNA干扰,并运用qPCR技术测定刺参LYZ的表达量;最后,对刺参LYZ进行体内RNA干扰,并分别运用qPCR技术和比浊法测定刺参LYZ的表达量及其酶活性。结果显示:3种RNA干扰重组质粒的沉默效率分别为40%、45%、0%;体腔注射RNA干扰重组质粒时,各组织中LYZ的表达量均出现了显著的上升(P0.05),而从口腔注射时,体腔液和肌肉中LYZ的表达量均出现极为显著的下降(P0.01),而在管足中未出现明显变化;当其注射剂量为0.5μg和5μg时未对LYZ的表达产生有效的抑制作用;当注射剂量为10μg和25μg时,刺参体内LYZ的表达受到了明显抑制,但是注射剂量为25μg时,部分刺参个体出现吐肠现象;在转染12h后,刺参体腔液、肌肉、体壁、疣足和管足组织中LYZ的表达量开始下降,到第四天后开始回升。表明:只有从口腔注射RNA干扰重组质粒且注射剂量达到10μg时才能有效地抑制靶基因的表达;刺参体内RNA干扰具有系统性,可以在各个组织间相互传导。     

RNA干扰对大鲵蛙病毒主要功能基因表达及其增殖的影响

采用q PCR与病毒滴度测定观察RNA干扰(RNA interference,RNAi)对大鲵蛙病毒(Chinese giant salamander ranavirus,CGSRV)主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)、甲基转移酶(methyltransferases,MTases)、DNA多聚酶(DNA polymerase)基因表达与病毒增殖的影响。结果表明,小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)能推迟鲤鱼上皮瘤细胞(epithelioma papillosum cyprini,EPC)出现病变,且病变程度也较对照组轻。在各功能基因表达量上,NC-FAM对照组与阴性对照组差异不显著(P0.05);而干扰组的干扰率极显著高于阴性对照组,其中siR-DP-1组siRNA对MCP基因的干扰率为79%,极显著高于其余组(P0.01);siR-MT-1、siR-MT-2组siRNA对MTases基因的干扰率为77%,极显著高于其余组(P0.01);siR-DP-1组siRNA对DNA polymerase基因的干扰率为79%,极显著高于其余组(P0.01)。干扰实验组病毒滴度与NC-FAM对照组和阴性对照组相比也有不同程度的降低。阴性对照组lg TCID50为8.362,NC-FAM对照组lg TCID50为7.848,siR-MCP、siR-MT、siR-DP实验组最低lg TCID50分别为5.764、5.317、5.362。证实RNAi能够抑制CGSRV主要功能基因的表达并影响病毒的复制。     

大型海藻DNA与RNA同步抽提技术比较

海藻含有的多糖、多酚等物质容易与核酸(DNA与RNA)结合形成不溶于水的复合物,干扰了后续的酶反应,制约了海藻核酸抽提。但抽提高质量核酸却是海藻分子生物学研究的第一步,因此比较了2种同步抽提技术对大型海藻DNA与RNA同步抽提的效果。应用TRIZOL法和CTAB+LiCl法同步抽提了3种海藻的DNA与RNA,接着应用紫外吸收、电泳、PCR、RT-PCR和荧光定量RT-PCR等检测核酸质量。结果显示2种方法均能获得较高纯度的总RNA,总RNA质量完全适合后续的反转录等反应;但在DNA抽提方面CTAB+LiCl法能获得更高质量的DNA。CTAB+LiCl法是一项适用于大型海藻的DNA与RNA同步抽提技术。     

RNA干扰MSTN基因鲤的肌纤维密度及染色体核型分析

本实验分析RNA干扰MSTN基因鲤(以下简称RNA干扰鲤,体质量为116.2g和110.3g)的染色体,测定该鲤肌肉中的肌纤维密度。结果表明:(1)三组实验鱼的肌纤维密度分别为163.7根/mm~2、171.9根/mm~2和162根/mm~2,对照鱼的普通鲤(Common carp)为142根/mm~2,实验鱼高于对照鱼。单因素方差分析表明:实验鱼组间肌纤维密度差异不显著(F=0.83,P=0.440.05),而与对照鱼差异显著(F=5.24,P=0.0340.05)。(2)PHA和秋水仙素体内注射法分析核型表明,实验鱼的染色体数为2n=100,核型公式为:2n=30m+24sm+28st+18t,臂比(NF)156,对照鱼染色体数为2n=100,核型公式为:2n=30m+26sm+28st+16t,臂比(NF)156。结果说明RNA干扰基因的插入并未影响鲤染色体组成。     

刺参组织总RNA提取的研究

利用Trizol法和两种RNA提取试剂盒对刺参的肠、呼吸树、纵肌、体壁等不同组织总RNA进行了提取。综合分析结果表明,F试剂盒提取刺参组织总RNA的效果较其他两种方法而言方法最适宜,能获得纯度高、污染少,而且无降解的高质量总RNA。刺参的肠组织富含RNA,且质地较软容易研磨彻底,是提取总RNA的最佳组织,可获得量大、质优的总RNA。     

RNA干扰Gas2基因对低温胁迫下罗非鱼肾脏细胞系增殖及凋亡的影响

探讨低温胁迫下,干扰生长抑制特异性基因2(Gas2)对罗非鱼肾脏细胞系增殖和凋亡的影响。采用脂质体转染法介导Gas2短发夹RNA(short hairpin RNA, shRNA)及阴性对照短发夹RNA处理罗非鱼肾脏细胞,24 h后,以5℃/d降温速率对转染后的罗非鱼肾脏细胞进行低温胁迫,分别在25、20、15、10℃进行细胞采集。随后,利用实时荧光定量PCR检测Gas2基因及P53基因mRNA表达变化,利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,并开展WST-1细胞增殖实验检测细胞的增殖情况。结果表明,低温胁迫下,阴性对照组及Gas2干扰组中Gas2和P53基因mRNA的表达在15℃和10℃时均显著升高;Gas2干扰组中Gas2和P53基因mRNA的表达水平在所有温度下均显著低于阴性对照组;随着温度降低,阴性对照组及Gas2干扰组的细胞凋亡率均明显升高,但Gas2干扰组的细胞凋亡率明显低于阴性对照组;低温胁迫下,对照组及Gas2干扰组的细胞增殖率与25℃时相比均显著下降;当温度降至15℃时,Gas2干扰组的细胞增殖率显著高于对照组。罗非鱼肾脏细胞在受低温胁迫时,抑制Gas2基因能够降低P53基因mRNA的表达水平以及细胞的凋亡率,并增加细胞的增殖。     

草鱼呼肠孤病毒的致病机制及抗病毒新对策

草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)引发草鱼病毒性出血病,是危害性最大的草鱼病原体。该病毒基因组由11条双链RNA组成,共编码7种结构蛋白和5种非结构蛋白。报告总结了呼肠孤病毒在基因表达、蛋白质合成、细胞凋亡、细胞融合、细胞膜渗透、干扰素分泌、细胞分裂以及细胞压力小体等方面与宿主细胞相互作用的生物学研究进展;论述了蛋白酶抑制剂、RNA干扰(RNAi)机制、干扰素诱导素、GCRV干扰颗粒及小分子化合物等抗病毒策略的分子作用机制。报告预测基于中草药的免疫增强剂和口服化基因工程抗病毒疫苗将是最容易被市场化的两种绿色抗草鱼出血病药物。     

装甲RNA在牡蛎中诺如病毒4种RNA提取方法比较研究中的应用

RNA提取是诺如病毒检测的关键步骤,而目前贝类中诺如病毒RNA提取、检测方法的比较与评价常囿于缺乏量值明确、无生物安全隐患的标准样品作为参考依据。本研究将前期制备的 GⅡ型诺如病毒装甲RNA (3.0×1010拷贝)作为标准样品,人工污染牡蛎(Ostrea gigas tnunb)消化腺匀浆物,用4种常见RNA提取方法：TRIzol试剂、Viral RNA Kit、High Pure Viral Nucleic Acid Kit、柱式病毒RNAOUT试剂盒,分别提取RNA,经实时荧光RT-PCR检测后,利用标准曲线进行定量分析,分别计算4种方法对装甲RNA的回收率。结果显示,对于匀浆样本,TRIzol法对装甲RNA的回收率最高(6.80±0.89)%,显著高于Viral RNA Kit (4.51±2.28)%,二者的回收率又显著高于High Pure Viral Nucleic Acid Kit (0.24±0.05)%与柱式病毒RNAOUT试剂盒(0.11±0.02)% (P?0.05);对于冻干样本,Viral RNA Kit对装甲RNA的回收率最高(8.71±0.17)%,显著高于TRIzol试剂(7.12±0.64)%,二者的回收率又显著高于High Pure Viral Nucleic Acid Kit (0.33±0.12)%与柱式病毒RNAOUT试剂盒(0.06±0.01)% (P?0.05)。研究表明,TRIzol试剂与Viral RNA Kit对牡蛎消化腺样本中人工添加的装甲RNA均有良好的回收效果,同时也提示装甲RNA可作为一种良好的标准样品用于不同RNA提取试剂盒方法的评价与比较研究。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) miR-223的表达特征及免疫应答分析

microRNA(miRNA)是一类内源性、长度约为22个核苷酸的非编码小单链RNA分子,由具有发夹结构的70?90个碱基的单链RNA前体经过Dicer酶加工而成。本研究使用荧光实时定量PCR (Quantitative Real-Time PCR, qRT-PCR)方法,研究了miRNA-223(miR-223)在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)各健康组织、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后各时间点的免疫组织以及不同病原类似物刺激后头肾细胞中的表达模式。结果显示,miR-223在半滑舌鳎各组织中均有表达,在头肾中表达量最高,在脑和血液中的表达量极低。鳗弧菌感染3组样品4种免疫组织,miR-223表达变化显著,感染后20 h内,鳗弧菌诱导miR-223上调表达。鳗弧菌感染后半滑舌鳎免疫组织miR-223表达变化规律显示,鳗弧菌感染2、6、12、24、48、72、96和168 h后,miR-223在肝、肠、脾、头肾4种组织中出现差异表达。其中,miR-223在半滑舌鳎肝、脾、头肾中表达上调,在肠中表达下调。用LPS、poly I:C、PGN、RGNNV感染半滑舌鳎头肾细胞后,发现经LPS、RGNNV诱导后miR-223上调表达,poly I:C、PGN诱导后miR-223下调表达。研究结果表明,miR-223参与了半滑舌鳎免疫应答过程。本研究结果有助于了解miRNA在半滑舌鳎对病原刺激免疫应答过程中的作用以及半滑舌鳎与病原相互作用中miRNA参与调控的机制。     

摄食不同种类饵料的鲤肝脏组织miRNA表达谱分析及验证

MicroRNA(miRNAs)是一类长度为18-25nt的内源性非编码单链小RNA,参与细胞增殖与凋亡、免疫、脂肪代谢等过程。本试验以三组投喂不同类型饵料的鲤(Cyprinus carpio)肝脏为研究材料,通过HiSeq 2500深度测序技术和生物信息学分析miRNA,鉴定出235个已知miRNAs。三种饵料组共表达的差异miRNAs有13个,随机挑选5个miRNA并采用qPCR进行验证,表达趋势在qRT-PCR结果和RNA测序结果中高度相似;对13个共表达的差异表达miRNAs进行靶基因预测,共预测到靶基因530个。对预测靶基因进行KEGG通路分析,结果显示参与2-羰基羧酸代谢,糖基磷脂酰肌醇(GPI)-锚定生物合成,柠檬酸循环(TCA循环)等通路的调节。本研究首次了解鲤摄食不同种类饵料的miRNAs表达特征,可以为深入了解miRNA对鲤摄食不同种类饵料过程的调控作用奠定基础。     

病原诱导水产动物细胞凋亡途径研究进展

凋亡是机体为维持内环境稳定而由基因控制的细胞的自主、有序性死亡,与细胞坏死的方式不同。近年来的一些研究显示,水产病原致病过程中可诱导宿主细胞凋亡。文章总结并展望了细菌、病毒和寄生虫诱导水产动物细胞凋亡的研究进展和发展趋势,可为水产病原致病机制的深入研究提供参考。     

河纯毒素的起源及检测技术研究进展

分析了不同学者对河纯毒素起源的几种解释,从遗传学角度解释河纯毒素是河纯在长期进化过程中自然选择的结果的解释较为合理。本文对河豚毒素的检测方法进行了综述。河豚毒素是钠离子通道阻断剂,是一种强海洋神经毒剂,结合国内外研究现状介绍了河鲍毒素的控毒手段以及河纯毒素作为一种工具药在临床上的应用前景。     

中国对虾卵黄蛋白原合成部位的研究

十足目甲壳类卵巢中卵黄的来源,在过去的几十年研究中一直存在争议,内源性合成和外源性合成都有报道。本文以雌性中国对虾为实验材料,根据组织学观察确定其发育阶段,试验虾可以分为:卵巢未发育期;卵黄发生前期;初级卵黄发生期和次级卵黄发生期4个时期。从处于不同卵巢发育期对虾的卵巢和肝胰腺中提取总RNA,用RT-PCR的方法初步探讨不同发育期的中国对虾卵巢和肝胰腺中卵黄蛋白原mRNA的表达,确定是否存在卵黄蛋白原的合成功能。结果发现,从卵巢未发育期到次级卵黄发生期的卵巢和肝胰腺中都有卵黄蛋白原mRNA的表达,说明二者为卵黄蛋白的合成部位。     

浙江舟山市捕捞渔民转产转业工作的探讨

在中日、中韩渔业协定等众多因素的制约下,面临重重困境,渔民转产转业退出捕捞的"舞台"是一种必然,而渔民的转产转业关系到和谐社会的构建,关系到渔业经济社会的稳定,因此解决好渔民的转产转业问题具有及其重要的意义。本文从客观、主观两个方面及不同层次阐述了舟山捕捞渔民转产转业面临的困境,从社会长远稳定、构建和谐社会等方面进行分析并从战略实施的角度提出了相应的解决策略。     

编码鹰爪虾蜕皮抑制激素基因的cDNA片段的克隆和序列分析

提取鹰爪是眼柄总RNA，以眼柄总RNA为模板，根据日本对虾的具有蜕皮抑制活性的神经肽Pej-SGP-Ⅳ的氨基酸设计兼并引物，进行RT-PCR扩增，在适宜条件下得到一特异性片段。将这一特异性片段克隆到载体中进行测序，测得鹰爪虾的特异性cDNA片段由213个碱基对组成，推测的氨基酸序列由71个氨基酸组成。序列比较发现许多甲壳动物的CHH家庭神经肽与它相似。在所有与该序列推测的氨基酸序列相似的甲壳动物CHH家族神经肽中，MIH与它的相似度最高，表明由鹰爪虾眼柄特异性cDNA片段椎定的氨基酸基酸序列可能是鹰爪虾的MIH片段，它相当于MIH成熟肽的第5至75个氨基酸。     

海水流速对网箱养殖卵形鲳鯵生长的影响

2000—2004年分别在马銮湾、火烧屿、鳄鱼屿和猴屿4个海区进行卵形鲳鯵网箱养殖,探讨在养殖模式和饲料投喂技术相同条件下,海水流速度对网箱养殖卵形鲳鯵生长的影响。结果显示,海水流速最慢的马銮湾海区养殖效果最好,海水流速最快的猴屿养殖效果最差。