RNA病毒诱导的烟草WRKY转录因子基因的应急表达

植物和病毒在基因水平上的互作是植物感病和抗病的分子基础。以模式植物烟草及其3种RNA病毒（马铃薯Y型病毒,Potato virus Y,PVY;烟草花叶病毒,Tobacco mosaic virus,TMV;黄瓜花叶病,Cucumber mosaic virus,CMV）为试材,旨在研究受病毒共同诱导、并可能在植物抗病反应中具有重要功能的转录因子基因。试验首先获得10个受病毒诱导的烟草同源基因。在比较了3种病毒侵染、低温和盐害协迫以及逆境信号物质(茉莉酸甲酯与水杨酸)处理对上述基因表达的影响后发现, 3种RNA病毒所诱导的植物基因有所不同。但属于WRKY基因家族的06G基因受3种病毒的共同、高效诱导,其表达水平与叶片发育程度呈负相关。研究结果表明, 该基因在植物病毒病发生及植物抗病分子育种中可能有重要意义。     

内蒙古籽用西葫芦病毒病病原鉴定

【目的】对内蒙古自治区籽用西葫芦病毒病进行病原鉴定,并确定其分类地位,为该地区籽用西葫芦病毒病的防治提供理论依据。【方法】以采自内蒙古土默特左旗具有典型花叶症状的籽用西葫芦叶片为材料,对其进行sRNA深度测序和RT-PCR检测,并对所得序列进行一致性分析和构建系统发育进化树。【结果】对具有典型花叶症状的籽用西葫芦叶片的sRNA测序结果进行拼接,在数据库中比对共注释到14种病毒,其中西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus,WMV）、小西葫芦黄化花叶病毒（Zuchhini yellow mosaic virus,ZYMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV) 所占比例较高,分别为59.48%,20.70%和13.70%,这说明内蒙古自治区籽用西葫芦病毒病为多种病毒混合侵染引起。RT-PCR扩增除了检测到WMV、ZYMV和CMV外,还检测到马蹄莲潜隐病毒(Calla lily latent virus,CLLV)的外壳蛋白特异性条带。系统进化树分析显示,2个籽用西葫芦ZYMV分离物（MK002236和 MK002237）与伊朗蚜虫ZYMV分离物（KU528623）聚合在同一支;籽用西葫芦Z1 样品WMV分离物（MK015646）与意大利柑橘WMV分离物（FJ823122）亲缘关系最近,而Z2样品WMV分离物（MK015645）则与法国甜瓜WMV分离物、法国未知作物WMV分离物、法国西葫芦WMV分离物以及Z1 样品WMV分离物（MK015646）和意大利柑橘WMV分离物形成一个大分支。【结论】内蒙古籽用西葫芦病毒病主要病原为WMV、ZYMV和CMV,自然条件下常发生复合侵染。籽用西葫芦上最初的WMV和ZYMV可能由媒介昆虫或人从其他作物上传播而来,也可能是通过籽用西葫芦种子进口、国内调运而传播到本地的。     

侵染贵州甘蓝的芜菁花叶病毒 CP 基因序列分析

【目的】明确贵州省甘蓝芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)的发生分布,为科学防控提供指导。【方法】在贵州省安顺市、威宁县和修文县采集甘蓝病毒病样品,采用酶联免疫吸附试验法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和RT-PCR对病样进行TuMV检测,利用相关生物学软件分析TuMV CP基因序列的一致性,并构建系统进化树。【结果】152份甘蓝样品中66份检测出阳性,检出率为43.42%;测序的15个TuMV CP基因核苷酸同源性为88.70%～100%,与已报道TuMV 6个组的分离物构建系统进化树发现,14个分离物属于basal-BR,1个分离物属于world-B组。【结论】TuMV在贵州省甘蓝不同种植区普遍发生,且basal-BR为感染甘蓝的优势毒源。     

贵州芸薹黄化病毒的分子检测及基因型鉴定

【目的】对贵州省白菜、萝卜和甘蓝感染芸薹黄化病毒（Brassica yellows virus,BrYV）进行分子检测及基因型鉴定,为马铃薯卷叶病毒属病毒的防治提供理论参考。【方法】在贵州省遵义市、威宁县、关岭县、平坝县等县（市）共采集284份蔬菜（白菜、萝卜和甘蓝）疑似病毒病样品,利用马铃薯卷叶病毒属的通用引物进行RT-PCR分子检测,并对检测出的16个BrYV分离物进行P0和CP基因序列扩增,再与已报道的BrYV基因序列进行比对,从而构建系统发育进化树,鉴定其基因型。【结果】284份疑似病毒病样品中,有43份样品检测出BrYV,检出率为15.14%,其中,感染BrYV白菜样品12份,占白菜总样品数的12.77%;感染BrYV萝卜样品14份,占萝卜总样品数的20.29%;感染BrYV甘蓝样品17份,占甘蓝总样品数的14.05%。贵州16个BrYV分离物P0基因核苷酸序列的相似性为89.9%~100.0%,CP基因核苷酸序列的相似性为93.5%~100.0%,二者编码的氨基酸序列相似性均为100.0%。基于P0基因构建的系统发育进化树可知,BrYV-Pingba-BC-2、BrYV-Zunyi-LB-1和BrYV-Zhijing-BC-1均与BrYV-BJS和BrYV-BBJ聚为一类,其余13个分离物均与BrYV-ABJ和BrYV-AJS聚为一类。基于CP基因构建的系统发育进化树可知,贵州不同地区不同蔬菜作物的16个BrYV分离与BrYV-A和BrYV-B基因型无明显分界,亲缘关系均较近。BrYV P0基因检测到5个重组事件,BrYV CP基因未检测到潜在重组事件。【结论】BrYV在贵州白菜、萝卜和甘蓝上普遍发生,但对萝卜的危害最重,主要存在BrYV-A和BrYV-B 2种基因型。     

小苍兰3种病毒多重RT-PCR检测体系的建立

根据GenBank中已发表的小苍兰花叶病毒Freesia mosaic virus (FreMV)、黄瓜花叶病毒Cucumubermosaic virus (CMV)和菜豆黄花叶病毒Bean yellow mosaic virus (BYMV)外壳蛋白(CP)基因序列保守区域分别设计特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能同时检测小苍兰3种病毒的多重PCR检测体系.该体系能够一次扩增出FreMV,CMV和BYMV的特异片段,其大小分别是340、628和212 bp.测序结果表明,3种病毒序列与相应的参考序列相似性均达97％以上.灵敏度测定结果表明,从≥10-2mg的感病植物组织中能够检测到这3种病毒.     

云南胡椒花叶病病原检测及亚组鉴定

利用双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)和反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对采自云南的胡椒花叶病样品进行检测.结果表明,云南胡椒花叶病的病原为黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV),命名为CMV云南胡椒分离物(CMV-YNP).利用RT-PCR对CMV-YNP外壳蛋白(Coat protein,CP)基因进行克隆,获得大小为657 bp的基因序列.序列分析表明,CMV-YNP与从不同地域感病胡椒中分离的其它CMV株系虽同属CMV IB亚组,但并没有聚在一簇,而且与它们的cp基因存在较大差异,核苷酸序列相似性仅在92%~94%.     

侵染烟草的黄瓜花叶病毒株系分化研究

根据已报道的黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白(CP)基因序列合成1对引物,对侵染烟草的黄瓜花叶病毒贵州分离物的病毒外壳蛋白基因进行基因扩增和序列分析。结果表明:40个CMV贵州分离物和CMV株系亚组ⅠB系列CP基因核苷酸相似性为95.1%~100.0%,与CMV株系亚组ⅠA系列CP基因核苷酸相似性为92.3%~98.2%,亚组ⅡCP基因核苷酸相似性为78.2%~80.5%。表明贵州CMV分离物与CMV株系亚组ⅠB系列同源性关系更密切,因而它们都属于CMV株系亚组ⅠB系列。     

利用小RNA深度测序技术鉴定白芷病毒病病原

[目的]白芷（Angelica dahurica）是一种药用历史悠久的传统中药,本研究利用小RNA深度测序技术明确引起山西太谷白芷花叶、褪绿症状的病原,为白芷病毒病的防控提供依据。[方法]将采集的白芷病样进行小RNA深度测序,通过RT-PCR和序列相似性分析明确白芷病毒病的分类地位。[结果]白芷样品经小RNA深度测序共获得22 158 005个原始序列,将拼接contigs与NCBI中的病毒数据库进行比对注释,结果显示比对到黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）3条正义链RNA 3、RNA 2、RNA 1的比对率分别为2.14%、1.28%和1.10%。利用特异引物克隆了CMV-BZ RNA3的外壳蛋白和移动蛋白基因全序列。通过序列比对分析,发现CMV-BZ CP氨基酸序列和核苷酸序列分别与CMV亚组ⅠB中CMV分离物（CMV-SD-YT和CMV-SXCH）和（CMV-SD-QD）的相似性最高,分别为99.1%和99.5%;MP氨基酸序列和核苷酸序列分别与CMV亚组Ⅰ分离物Ah的相似性最高,为99.3%和99.0%。MP和CP氨基酸序列系统进化分析表明,CM...     

低温胁迫对黄瓜花叶病毒CMV-BG株系cp基因多态性的影响

研究了低温胁迫下黄瓜花叶病毒与三生烟互作后CMV cp基因序列的变化规律,并分析了植物RNA病毒的进化机制。用黄瓜花叶病毒北京甘蓝分离物(CMV-BG)侵染三生烟不同单株,置于不同温度条件下(常温和低温)培养30 d后,对CMV cp基因进行克隆、序列测定和多态性分析。结果表明,侵染低温组植物CMV的cp基因多态性(Pi=0.001 76)高于常温组(Pi=0.001 14),IFEL分析检测到低温组第48个氨基酸位点为正选择位点,初步表明低温胁迫有助于提高CMV-BG cp基因序列的多态性,温度胁迫是植物RNA病毒与宿主互作过程中基因序列变异的一种重要的作用力。     

云南省烟草花叶病毒和黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因克隆及序列分析

以从云南省主要烟区烟草上分离到的烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）的RNA为模板,采用RT-PCR技术,对TMV云南分离物（TMV-YN）的外壳蛋白（Coat protein,CP）基因及3’端非编码区和CMV云南分离物（CMV-YNa）的CP基因进行了cDNA克隆和序列测定。结果表明,TMV-YN的cDNA全长684个碱基（EMBL登录号为AJ239099）,通过GenBank进行同源性比较发现：其5'端的480个碱基为CP基因,编码159个氨基酸;3'端的204个氨基酸为非编码区;此CP基因与TMV-U1株系和TMV韩国普通株系核苷酸同源性均为100%。CMV-YNa的CP基因全长657个碱基（EMBL登录号为AJ239098）,编码218个氨基酸;此CP基因与CMV亚组 I 的CMV-RB株系、CMV-117F株系和CMV-Y株系的核苷酸同源性分别为96%、93%和92%。     

来自安徽不同地区黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）cp 基因的分子进化分析

为了揭示黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)安徽分离物分子变异及系统进化情况,从安徽省5个地区采集感染CGMMV的葫芦科样本。提取感病样本总RNA,经RT-PCR扩增、克隆和测序,获得17个CGMMV分离物的cp基因序列。序列比对发现,17个CGMMV安徽分离物的cp基因核苷酸序列相似性极高,达98.4%~100%,与中国及东亚国家和地区的各个CGMMV分离物cp基因核苷酸序列相似性也非常高,达98.6%~100%,而与CGMMV西班牙分离物和俄罗斯分离物cp基因核苷酸序列相似性相对较低,为90.7%~92.6%。从构建的系统关系树可以看出,17个CGMMV安徽分离物与中国及东亚国家和地区的各个CGMMV分离物形成1个单独的分支,而CGMMV俄罗斯与西班牙分离物聚成另1个分支,说明来源于中国和东亚的CGMMV亲缘关系较近。     

Incidence and prevalence levels of three aphid-transmitted viruses in crucifer crops in China

Poleroviruses, which are distributed worldwide, infect many crops of economic importance and cause severe plant diseases. Brassica yellows virus (BrYV), which has three genotypes, A, B, and C, is a newly identified polerovirus infecting crucifer crops in China, but its distribution is still unclear. Here, we report the distribution and prevalence levels of the three BrYV genotypes in crucifer crops in China. A total of 570 crucifer leaf samples randomly collected from 22 provinces, four ethnic minority autonomous regions, and three municipalities in China were tested for BrYV. RT-PCR detection showed that 97 of the field samples were positive for BrYV, and the average incidence of BrYV was 17.0%. The virus was detected in 22 provinces, with high incidences in north, northwest, and northeast China. The multiplex RT-PCR amplification of the three BrYV genotypes revealed that both single and mixed infections occurred. Among the BrYV infections, 38.1% were mix-infected by more than two viral genotypes, and 8.2% samples were mix-infected by three viral genotypes. Our findings indicated a widespread prevalence of BrYV in China, and BrYV mixed infections with Turnip mosaic virus and Cucumber mosaic virus in crucifer crops are common. This study is the first large-scale survey of BrYV in crucifer crops in China. The information generated in this investigation will contribute to the national prevention and control of viral diseases.     

湖北省蔬菜病毒病主要毒原种类检测

采用斑点酶联免疫吸附法(Dot-ELISA)和RT-PCR法对采自湖北省7个地区的966份疑似感染病毒的蔬菜样本进行黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus,ToMV)、芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)、蚕豆萎蔫病毒(Broad bean wilt virus,BBWV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)共7种病毒的检测。结果显示检出阳性样本695份,占总样本数的71.9%。其中,十字花科蔬菜上主要毒原为TuMV,检出率高达86.4%,其次为CMV,检出率为26.7%;茄科、葫芦科和豆科蔬菜上主要毒原均为CMV,检出率分别为34.3%、59.2%和56.2%。CMV几乎能侵染所有蔬菜,为湖北省蔬菜病毒病的主要毒原。在检出的6种病毒中,存在TuMV+CMV、TuMV+BBWV、TuMV+CMV+BBWV、CMV+BBWV、CMV+ToMV和CMV+BBWV+TSWV+TMV等6种复合侵染类型,其中TuMV+CMV为十字花科蔬菜上的主要复合侵染类型,复合侵染率为23.8%,其他蔬菜上主要侵染类型为CMV+BBWV,复合侵染率为28.0%。     

侵染我国主要蔬菜作物的病毒种类、分布与发生趋势

【目的】 对我国茄科、葫芦科、豆科和十字花科蔬菜主要病毒病开展调查、诊断,明确当前我国主要蔬菜作物病毒病的病原物、优势病毒及其分布,并对其中一些重要病毒引起的病毒病在我国的发生危害趋势进行分析。【方法】 2013—2017年,对我国大陆31个省（市、自治区）开展茄科、葫芦科、豆科和十字花科等蔬菜作物主要病毒病发生情况的普查,利用血清学和分子生物学相结合的方法对主要蔬菜病毒病的病原进行鉴定。【结果】 我国大陆31个省（市、自治区）共采集茄科、葫芦科、豆科和十字花科蔬菜作物疑似病毒病样品41 653份,共检出病毒63种,其中茄科蔬菜检出病毒达40种,葫芦科蔬菜检出病毒26种,豆科蔬菜检出病毒19种,十字花科蔬菜检出病毒14种。茄科的辣椒检出病毒33种,番茄检出病毒25种;葫芦科的南瓜检出病毒22种,黄瓜检出病毒19种;豆科的豇豆检出病毒14种,菜豆检出病毒12种;十字花科的萝卜检出12种病毒,大白菜检出7种病毒。蔬菜作物中普遍存在多种病毒复合侵染现象,已发现2—6种病毒复合侵染,以2种病毒复合侵染类型居多,其中辣椒、番茄和茄子上存在6种病毒复合侵染。本研究首次在国内发现番茄斑驳花叶病毒（Tomato mottle mosaic virus,ToMMV）、西葫芦虎纹花叶病毒（Zucchini tigre mosaic virus,ZTMV）、辣椒脉黄化病毒（Pepper vein yellows virus,PeVYV）、辣椒隐潜病毒1号（Pepper cryptic virus 1,PCV-1）和辣椒隐潜病毒2号（Pepper cryptic virus 2,PCV-2）的侵染;首次发现ToMMV、甜瓜蚜传黄化病毒（Melon aphid-borne yellows virus,MABYV）、南瓜蚜传黄化病毒（Cucurbit aphid-borne yellows virus,CABYV）对辣椒的侵染,首次发现ZTMV对黄瓜、烟草轻绿花叶病毒（Tobacco mild green mosaic virus,TMGMV）对南瓜的侵染,首次发现番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt tospovirus,TSWV）可以侵染芹菜、曼陀罗、豇豆、豌豆、党参、大丽花、旱金莲、刺天茄等,首次发现红辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）可以侵染红茄,另外还首次发现辣椒和番茄为烟草丛顶病毒（Tobacco bushy top virus,TBTV）的新自然寄主。【结论】 黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）、芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus,TuMV）和蚕豆萎蔫病毒2号（Broad bean wilt virus 2,BBWV2）为当前危害我国蔬菜作物的优势病毒,在全国范围内广泛分布且发生严重,特别是CMV发生最为普遍,在31个省（市、自治区）均有分布,且均为这些地区的优势病毒。茄科蔬菜的优势病毒为CMV和TMV,葫芦科蔬菜的优势病毒依次为CMV、小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）、黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV）和TMV,豆科蔬菜的优势病毒为CMV和BBWV2,十字花科蔬菜的优势病毒依次为TuMV、CMV和TMV。番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis virus,ToCV）、TSWV、CGMMV和ToMMV等病毒在部分省区发生严重,扩展蔓延速度极快,具有在全国范围内流行的风险。     

南京市郊萝卜病毒病的调查和病原鉴定

南京郊区萝卜病毒病以夏秋萝卜受害最重,但品种间的感病性有差异,主栽品种泡里红、五月红等十分感病,而中秋红和六十日早白萝卜发病很轻。芜菁花叶病毒(TuMV)是危害萝卜的主要病原;黄瓜花叶病毒(CMV)也占一定的比例;从少数样本中也分离到烟草花叶病毒(TMV)。约有1/3的样本是由两种或两种以上的病毒复合侵染,复合侵染病株中的病毒主要是芜菁花叶病毒、黄瓜花叶病毒、蚕豆萎蔫病毒(BBWV)和烟草花叶病毒。     

猪流行性腹泻病毒的RT-PCR鉴定及其 M、N和E基因的序列分析

对引起仔猪严重腹泻的猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)进行RT-PCR检测,并对PEDV部分基因进行克隆和序列分析。从陕西省某发生严重仔猪腹泻的养猪场采集肠道内容物,利用RT-PCR技术成功检测到PEDV感染。克隆检测到的PEDV M、N和E基因片段,并将该基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其他不同来源的PEDV毒株进行比较分析。结果表明,克隆的M、N和E基因与其他已经发表的PEDV毒株核苷酸的同源性分别为96.3%～99.9%、95.2%～99.5%和96.1%～96.9%,氨基酸同源性分别为95.6%～99.6%、96.1%～99.5%和96.1%～98.7%;系统进化树结果表明,试验检测的PEDV与国内分离株的PEDV株亲缘关系更近。可见:陕西省养殖场存在猪流行性腹泻病毒感染,其M、N和E基因变异不大。     

武隆烟区烟草病毒病的病原初步鉴定

对重庆市武隆烟区田间烟草进行了病毒病病原种类的调查和鉴定。26个烟草样品经ELISA共检测到TMV,CMV,PVY及TuMV等4种病毒。所有样品均感染TMV,且病毒复合侵染严重,其中,以TMV,TuMV,CMV及PVY等4种病毒的复合侵染为主,侵染率达30．77％。ELISA结果表明,复合侵染的样品中TMV含量最高,TuMV含量最低。     

重庆辣椒上烟草轻型绿花叶病毒的分子检测及全基因组克隆分析

辣椒是重庆重要的经济作物,烟草轻型绿花叶病毒(Tobacco mild green mosaic virus, TMGMV)引起的病毒病对辣椒生产造成了严重影响.为明确TMGMV在重庆辣椒上的发生、分布情况及其基因组特征,从重庆北碚、石柱、潼南和九龙坡4个区县采集29份疑似病毒病样品进行了RT-PCR鉴定,通过分段扩增测序的方法拼接获得病毒基因组全序列并进行了系统进化分析.检测结果表明:29份样品中有9份检测到TMGMV,检出率为31.03%,其中石柱县的检出率最高,为60.00%.序列分析发现,重庆辣椒分离物TMGMV-TN29基因组全序列具有烟草花叶病毒属(Tobamovirus)病毒典型基因组结构特征,由6 356 nt构成.系统进化分析得出,该分离物与TMGMV厦门分离物Xiamen (JX534224)具有较近的亲缘关系,核苷酸序列相似性达到99.75%.     

陕西关中某羊场羊口疮病毒的分离鉴定与基因序列分析

羊口疮疫病的暴发可严重影响畜牧的经济效益,为探明陕西地区该病的发病原因。本研究从陕西关中地区某羊场出现特征症状病羊嘴部痂皮中分离病原,经过感染MDBK细胞系,获得1株病毒,经形态学、理化学、PCR检测及病理组织学等方法鉴定,该病毒分离株为羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV),命名为ORFV-SXGZ。依据GenBank中发表的ORFV特异性B2L、F1L及VIR基因的核酸序列,设计并合成3对引物,应用PCR方法成功对ORFV-SXGZ毒株的B2L、F1L及VIR基因进行克隆,并将其基因序列及推导的氨基酸序列与其他不同来源ORFV分离株进行比较分析。序列分析结果表明,ORFV-SXGZ毒株的B2L、F1L和VIR基因与其他已发表ORFV毒株之间的核苷酸同源性分别为96.7%~99.6%、95.8%~97.9%和95.0%~99.3%,氨基酸同源性分别为95.3%~99.7%、95.8%~98.2%和95.5%~98.4%。系统进化树分析结果显示,ORFV-SXGZ毒株与国内新疆和甘肃等西北部地区分离株的亲缘关系更近,证实陕西关中地区养殖场中存在羊口疮病毒感染。