应用多重PCR检测烟草黑胫病菌、根黑腐病菌、猝倒病菌及立枯病菌

通过筛选特异性引物,优化多重PCR体系中的Mg2+、d NTP Mixture、Taq DNA聚合酶浓度,退火温度等反应条件,建立了多重PCR同时检测4种病菌(烟草黑胫病菌、根黑腐病菌、猝倒病菌和立枯病菌)的技术体系,得到265、364、400和541 bp共4条特异性条带,对应的病菌分别为猝倒病菌、黑胫病菌、根黑腐病菌、立枯病菌.该检测体系的灵敏度可达10-2ng·μL-1基因组DNA.     

巢式PCR检测油茶根腐病菌的研究

为建立油茶Camellia oleifera根腐病菌层生镰刀菌Fusarium proliferatum的巢式聚合酶链式反应（PCR）快速检测体系．扩增层生镰刀菌核糖体DNA基因间隔序列（ITS）区并测定其序列,比较该序列与GenBank中近似种的ITS序列差异．设计了特异性引物GF1和GR2,利用该对引物与ITS1和ITS4进行巢式PCR扩增检测层生镰刀菌。结果显示,巢式PCR对层生镰刀菌的检测灵敏度可达100ag基因组DNA,比常规扩增方法提高了1万倍。利用设计的GF1／GR2特异性引物与ITS区通用引物进行巢式PCR扩增．可灵敏地扩增出油茶根腐病菌层生镰刀菌DNA。     

红枣中链格孢菌的多重PCR检测

为快速、灵敏并且特异性地检测红枣中链格孢菌,选取2对链格孢菌特异引物,优化多重PCR检测中的引物比例、退火温度、d NTP浓度及Mg2+浓度等条件,结果表明多重PCR扩增出了预计的链格孢菌PCR产物,优化的条件为Alt-F2\R2∶Alt-F1\R1=3∶1、退火温度52℃、d NTP浓度0.05 mmol/L、Mg2+浓度1.5 mmol/L。该方法在检测红枣链格孢菌中具有很好的应用和开发前景。     

双重PCR技术检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌方法的建立

 【目的】利用双重PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌（Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus）和黑胫病菌（Pectobacterium atroseptica）。【方法】根据GenBank上发表的马铃薯环腐病菌pCS1质粒上纤维素酶A基因序列,对比近缘种及马铃薯上几种重要病原菌的核苷酸序列,设计并合成了1对特异性引物CMS1/CMS2,将设计的引物与已发表的PCR检测马铃薯黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r结合,经过条件优化后,建立了双重PCR体系。【结果】利用引物CMS1/CMS2扩增出了1条913 bp的马铃薯环腐病菌特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达100 fg•μL-1,在细菌数上达105 CFU•mL-1。利用双重PCR体系对马铃薯环腐病菌和黑胫病菌进行扩增,可获得913和690 bp的2条特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达600 fg•μL-1,在细菌数上达5×105 CFU•mL-1。【结论】成功建立了双重PCR检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌技术体系,该技术能够同时快速可靠地检测出马铃薯环腐病菌和黑胫病菌。     

烟草黑胫病菌RPA检测方法的建立

烟草黑胫病是由烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）引起的烟草重要土传病害。建立了烟草黑胫病菌RPA快速检测方法，结合侧流层析试纸条，该方法在38 ℃恒温条件下30 min内完成可视化检测，不需要PCR仪等仪器设备。以烟草黑胫病菌YPT1为靶标基因设计RPA引物YPT1F和YPT1R，以及RPA探针YPT1-LFD-probe，对烟草黑胫病菌具有较高的检测特异性，其检测下限为10 pg·μL^-1，与普通PCR一致。因此，建立的烟草黑胫病菌RPA检测技术具有快速、简单、实用等特点，为烟草黑胫病菌的快速检测提供了新的方法。     

检测牛奶中布鲁氏菌套式PCR方法的建立

为检测牛奶中的布鲁氏菌,通过对布鲁氏菌外膜蛋白31 k Da的一段基因进行套式PCR扩增,建立从临床奶样中检测布鲁氏菌的方法。改进了奶样中布鲁氏菌基因组DNA的提取方法,通过正交试验的方法优化了套式PCR试验的反应条件,优化后的一扩PCR反应条件为:退火温度56.4℃,Mg~(2+)浓度1.5 m M,rTaq酶0.2μL,引物0.3μM,d NTP浓度0.2 m M;二扩PCR反应条件为:退火温度53.3℃,Mg~(2+)浓度1.5 m M,rTaq酶0.25μL,引物0.4μM,d NTP浓度0.1 m M。其敏感性为8 CFU·m L~(-1),比细菌分离试验敏感1 000倍;与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌、隐秘杆菌和克雷伯氏菌均无交叉反应;与试管凝集试验检测布鲁氏菌病的阳性符合率是100%,阴性符合率是86.36%。试验建立的套式PCR方法可用于检测奶样中布鲁氏菌。     

土壤中黑胫病菌荧光定量PCR快速检测体系的建立及初步应用

为建立土壤中黑胫病菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR快速检测方法,依据疫霉菌特异性par A1基因序列差异位点,设计1对特异性引物。通过构建含有目的片段的重组质粒,建立标准曲线,以SYBR GreenⅠ荧光染料法对烟草黑胫病菌进行荧光定量PCR检测,检测灵敏度达1×102个/g土壤,建立了基于SYBR GreenⅠ荧光染料法的荧光定量PCR的快速定量检测体系,并对云南、四川烟草主要栽培区土壤进行检测。表明该体系可以对烟草不同时期的田间土壤黑胫病菌的数量进行动态监测,可用于烟草黑胫病的预测和防治。     

三重PCR检测黄瓜靶斑病菌、炭疽病菌和细菌性角斑病菌

【目的】开发一种可同时检测黄瓜靶斑病菌(Corynespora cassiicola)、黄瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)和黄瓜细菌性角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.lachrymans)的三重PCR快速检测方法。【方法】根据ITS或16S r DNA序列分别设计黄瓜靶斑病原菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌特异性检测引物;通过鉴定引物的特异性,筛选可在目标菌株中扩增出特异片段的特异引物;选择可以组合的3种病原菌特异性引物进行三重PCR,对引物浓度、退火温度、延伸时间和循环数分别进行优化,优化三重PCR体系。【结果】针对黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌分别设计出5对、7对和6对特异性引物,其中引物CC4F/CC4R和CC5F/CC5R可特异扩增黄瓜靶斑病菌ITS,引物CL1F/CL1R、CL2F/CL2R、CL3F/CL3R、CL3F/CL4R、CL3F/CL5R、CL3F/CL6R和CL3F/CL7R可特异扩增黄瓜炭疽病菌ITS,引物PS3F/PS4R和PS4F/PS4R可特异扩增黄瓜细菌性角斑病菌16S rDNA。引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R扩增片段长度分别为370、275和698 bp,其混合扩增产物可在3%琼脂糖凝胶上得到充分分离,这3对引物选择作为三重PCR引物。在三重PCR反应体系中,当引物CC5F/CC5R、CL3F/5R和PS3F/4R的终浓度分别为0.16、0.4和0.16μmol·L~(-1)时,3个目的片段能同时得到有效扩增;当退火温度大于65℃时,部分目的片段不能有效扩增。最终建立并验证了适合上述3种黄瓜主要病原菌的三重PCR检测体系,即25μL PCR反应体系中含有12.5μL 2×Hiff~(TM) PCR Master Mix(With Dye)、0.16μmol·L~(-1) CC5F/CC5R、0.4μmol·L~(-1) CL3F/CL5R、0.16μmol·L~(-1) PS3F/PS4R。反应程序:95℃预变性3 min;95℃变性30 s,65℃退火30s,72℃延伸2 min,35个循环;最后72℃延伸10 min。【结论】建立的三重PCR方法能够快速检测田间采集的黄瓜发病叶片中的黄瓜靶斑病菌、黄瓜炭疽病菌和黄瓜细菌性角斑病菌,灵敏度均可达到0.4 pg·μL~(-1)。     

黄瓜棒孢叶斑病菌实时荧光定量PCR方法的建立与应用

黄瓜棒孢叶斑病是近年来生产中流行的一种气传病害,易与霜霉病、炭疽病等病害混淆,具有传播迅速、难以防治的特点,严重威胁黄瓜生产。研究旨在开发一种快速、灵敏的实时荧光定量PCR方法,用于定量检测叶片中黄瓜棒孢叶斑病菌(Corynespora cassiicola)并应用于田间监测。基于黄瓜棒孢叶斑病菌的actin序列设计并合成一对特异性引物CAF2/CAR2,以标准品DNA构建实时荧光定量PCR标准曲线并优化实时荧光定量PCR反应体系。当退火温度60℃,DNA模板量3μL(10 ng·μL~(-1)),引物量0.2μL (10 mmol·L~(-1))时为最佳体系条件。此方法检测黄瓜棒孢叶斑病菌DNA最低浓度为1.36×10~(-6)ng·μL~(-1)。验证实时荧光定量PCR体系组内与组间重复性和稳定性,其变异系数均小于2%。应用所建立的实时荧光定量PCR体系,检测5种不同抗性黄瓜品种接种棒孢叶斑病菌后不同时间叶片中病菌动态变化,发现4～8 h(Cq值30)时,黄瓜棒孢叶斑病菌开始侵染高感和感病品种,8～12 h时开始侵染中抗、抗病和高抗品种,且随时间延续侵染量逐渐增加,根据黄瓜棒孢叶斑病病情分级标准,当Cq值21时,病情级别为1;Cq值19时,病情级别为2;Cq值17,病情级别为3;Cq值14,病情级别为4。研究为黄瓜棒孢叶斑病诊断及监测提供技术支持。     

食品中绿豆成分PCR特异性检测方法的建立

针对绿豆物种特异性序列,设计了定性PCR引物,建立了绿豆源性成分检测方法,并对0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μmol·L~(-1)的引物浓度,52、54、56、58、60、62℃的退火温度等反应条件进行优化,对该方法的灵敏度、特异性和检出限进行了测试。结果表明,在引物浓度0.4μmol·L~(-1)、退火温度58℃条件下的扩增效果最优,绿豆的检出限可达到0.5%。该检测方法具有高度的特异性,操作方便、简单、快捷,可为食品安全的检测提供依据。     

广东烟叶主要真菌病害无公害化学防治药剂筛选试验

烟草黑胫病和赤星病已成为广东烟叶生产的重要真菌病害,开展其无公害化学药剂筛选和应用研究势在必行。以烟草黑胫病菌和赤星病菌为研究对象,室内毒力测定结果表明:烯酰吗啉和氟吡菌胺的对烟草黑胫病菌的毒力最高(EC50分别为0.56μg/m L和0.25μg/m L),苯酰菌胺对烟草黑胫病菌的毒力次之(EC50为1.14μg/m L);咪鲜胺对烟草赤星病菌的毒力最高(EC50为0.26μg/m L),75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂对烟草赤星病菌的毒力较高(EC50为2.66μg/m L)。田间试验结果表明:处理后15 d,推荐药剂50%烯酰吗啉可湿性粉剂1 500倍和80%苯酰菌胺可溶性粉剂2 500倍轮换施用防治烟草黑胫病的效果为87.23%;推荐药剂45%咪鲜胺水乳剂2 000倍和75%肟菌·戊唑醇水分散粒剂2 500倍轮换施用对烟草赤星病的效果为82.53%;均显著高于对照药剂的防治效果。研究结果为烟叶真菌病害化学防控提供了技术指导,促进了烟叶绿色安全生产,保证了烟叶产量和品质。     

苹果树腐烂病菌qPCR检测方法的建立

利用ITS、β-微管蛋白和EF-1α基因序列的通用引物来扩增苹果树腐烂病菌菌株Vmm41,产物序列,与GenBank中的序列对比,设计并筛选出特异性引物对VE1-F/VE1-R。将目的片段连接到载体pUC19上制成标准品,通过优化退火温度和引物浓度,建立了实时定量PCR检测体系,并对该体系的特异性、灵敏度和可靠性进行了验证。结果表明,该体系可检测到26.4fg/μL的模板浓度,并可从苹果轮纹病菌、链格孢菌、层出镰刀菌、木霉菌和青霉菌等苹果园常见真菌中特异性的检测出苹果树腐烂病菌。用该体系对人工接种腐烂病菌的苹果叶片进行检测验证,结果表明,利用该检测体系可检测出叶片未发病部分的腐烂病菌数量。本研究建立的定量PCR检测体系可用于苹果树腐烂病菌的快速检测,为苹果树腐烂病侵染规律及预警研究提供新方法。     

三重PCR检测草莓灰霉病菌、炭疽病菌和黄萎病菌

【目的】探索和优化检测条件,建立同时检测草莓灰霉病菌Botrytiscinerea,炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides和黄萎病菌Verticillium dahliae的三重PCR检测体系,为3种病害的早期快速诊断和鉴定提供技术和方法。【方法】选择可以组合的3种病原菌特异引物,研究多重PCR的影响因素,优化PCR退火温度,采用正交试验方法,以3个引物组、TaqDNA聚合酶、dNTP和Mg2+六因素三水平优化多重PCR体系。【结果】建立并验证适合上述草莓主要病原菌的三重PCR最佳检测体系,可分别扩增出729、539和450bp的特异条带,最适退火温度为50℃,25μL的反应体系中含有0.32μmol·L-1C729+/-、0.032μmol·L-1DB19/DB22、0.32μmol·L-1CgInt/ITS4、1.5UTaq聚合酶、0.15mmol·L-1dNTP、1.6mmol·L-1MgCl2。【结论】利用上述引物组合和反应体系进行三重PCR检测,能够快速从田间发病植株和土壤中将草莓灰霉病菌、草莓炭疽病菌和草莓黄萎病菌检测出来,灵敏度可以达到10pg菌丝DNA。     

基于SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术检测烟草靶斑病发病菌量

本研究根据烟草靶斑病菌(Rhizoctonia solani)与烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、烟草棒孢霉叶斑病菌(Corynespora cassiicola)等田间常见烟草叶部病害病原菌的rDNA-ITS(ribosomal DNA Internal Transcribed Spacers, rDNA-ITS)序列差异位点,设计一对特异性检测引物RSW1F/RSW2R,建立烟草靶斑病菌实时荧光定量PCR(Real time fluorescence quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR)快速准确检测体系,并分析烟草靶斑病最低发病菌量.结果表明,设计的引物特异性良好,灵敏度达到1×10^-3 ng/μL.利用已获得的实时荧光定量PCR体系计算得出引起烟草靶斑病发病的最低菌量为12.03 pg/μL.此外,对重庆龚滩地区烟叶中烟草靶斑病菌含量进行计算,发现土壤以及周边杂草可能为该地区烟草靶斑病菌的侵染来源,并进一步确定该地区预防烟草靶斑病的最佳时期为5月15日至6月15日,为烟草靶斑...     

禽致病性大肠杆菌O_1、O_2、O_(78)血清型三重PCR检测方法的建立

[目的]本试验旨在建立一种能同时检测禽致病性大肠杆菌O_1、O_2和O_(78) 3种血清型的三重PCR检测方法。[方法]根据O_1、O_2和O_(78) 3种血清型的特异性基因片段设计并合成引物,分别提取O_1、O_2和O_(78)血清型禽致病性大肠杆菌的DNA作为模板,优化三重PCR反应条件,进行特异性和敏感性检测,并对临床模拟样品进行检测。[结果]在三重PCR的25μL反应体系中,dNTP 1.5μL,MgCl_22.5μL,Taq DNA酶0.6μL,O_1、O_2、O_(78)最佳引物加入量分别为0.6、0.2、0.6μL;最佳退火温度为55.9℃。三重PCR的特异性好,3种血清型之间无交叉反应;对146株不同血清型的大肠杆菌进行检测,准确率为99.32%(145/146),用金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和枯草芽胞杆菌进行特异性检测时,没有出现非特异性扩增。三重PCR敏感性高,以单一血清型DNA为模板时,O_1和O_2血清型的DNA最低检测限均为0.1 ng·μL~(-1),O_(78)血清型的DNA最低检测限为0.02 ng·μL~(-1);以O_1、O_2和O_(78)混合DNA为模板时,最低检测限为0.05 ng·μL~(-1)。对18份临床模拟样品进行检测,准确率为94.4%(17/18)。[结论]建立了一种能同时检测O_1、O_2和O_(78)3种血清型禽致病性大肠杆菌的三重PCR方法,方法特异性好,敏感性高,适用于临床上禽大肠杆菌病的快速检测。     

玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法的建立与应用

【目的】由大斑突脐蠕孢(Exserohilum turcicum)和玉蜀黍平脐蠕孢(Bipolaris maydis)引起的玉米大斑病和小斑病是玉米生产上重要的叶部真菌病害,本研究旨在建立玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法,为玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型田间分布和有性生殖研究提供技术方法。【方法】根据GenBank中已登录的玉米大斑病菌(登录号MAT1-1:GU997138和MAT1-2:GU997137)和小斑病菌(登录号MAT1-1:X68399和MAT1-2:X68398)交配型基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计2种病原菌交配型多重PCR检测特异性引物,采用单因素法对引物的退火温度以及扩增程序中延伸时间和循环数等重要参数进行优化,建立玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法,并对2种病原菌的交配型多重PCR检测灵敏度和特异性进行检验。同时,对田间采集的129株玉米大斑病菌和194株玉米小斑病菌单孢菌株的交配型进行多重PCR检测,以明确建立的交配型多重PCR检测方法的适用性。【结果】建立的多重PCR方法和设计的交配型特异引物StMAT01-2F/R、StMAT02-3F/R、ChMAT01-3F/R和ChMAT02-2F/R可分别扩增出MAT1-1、MAT1-2型菌株大小为816、132 bp(大病斑菌)与490、136 bp(小病斑菌)的特异性目的条带。25μL多重PCR扩增体系:2×Multiplex PCR Mix 12.5μL,引物各10 pmol,DNA模板100 ng,退火温度为57.2℃(大病斑菌)和55.0℃(小斑病菌),35个循环。该多重PCR对玉米大斑病菌MAT1-1、MAT1-2型单孢菌株的检测灵敏度分别为0.1、0.01 ng基因组DNA,而对玉米小斑病菌MAT1-1、MAT1-2交配型的检测灵敏度均为0.1 ng基因组DNA。该交配型多重PCR检测方法对玉米大斑病菌和小斑病菌特异性很强,能够很好地区分玉米大斑病菌和小斑病菌相应的近缘种和14株其他真菌菌株。不同地理来源的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型检测结果表明,该多重PCR能够准确地检出129株玉米大斑病菌和194株玉米小斑病菌的交配型,且检测结果与随机抽取的菌株杂交验证结果完全吻合。【结论】构建的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR检测方法灵敏度高、特异性好、操作简便,能够准确、快速地检测出玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型,为玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型田间分布和监测及有性生殖研究提供了可靠的技术方法。     

大花三色堇FPNI-PCR反应体系的优化

融合引物与巢式聚合酶链式反应(fusion primer and nested integrated PCR,FPNI-PCR)是一种分离并扩增已知序列旁未知序列的有效方法。以大花三色堇(Viola×wittrockiana Gams.)为材料,为提高FPNI-PCR产物特异性,增加条带清晰度,降低非特异性条带的干扰,对FPNI-PCR反应体系中第1轮的模板DNA浓度进行对比,优化了第3轮反应中引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、缓冲液用量,筛选了第3轮特异性引物的退火温度,进一步完善了FPNIPCR反应体系。各因素优化比对试验表明:FPNI-PCR第1轮反应体系应以稀释后的DNA为模板,20μL体系中,用量在4.5~10 ng。第3轮最优反应体系为:20μL反应体系中,特异性引物浓度0.2μmol/L,引物SP2浓度0.75μmol/L,Taq DNA酶用量1.0 U,d NTP用量2μL,10×buffer(20 mmol/L,Mg2+plus)用量2μL,模板1μL(第2轮反应稀释100倍后取1μL为模板),dd H2O补足。第3轮反应中,退火温度为64℃或66℃时条带最为清晰。     

基于gpd基因的大蒜黑腐病菌实时荧光定量PCR鉴定技术

【目的】大蒜黑腐病菌（Embellisia allii (Campanile) Simmons）的检疫鉴定主要采用形态鉴定方法。不仅耗时长,而且大蒜黑腐病菌与本属其他种以及其他属的分生孢子非常相似,极难分辨,需要建立快速、有效的分子诊断方法。研究旨在建立实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)体系以准确、灵敏地鉴定大蒜黑腐病菌。【方法】从NCBI的GenBank数据库中,选取大蒜黑腐病菌和其他大蒜病害以及近似种的3-磷酸甘油脱氢酶（gpd）基因核酸序列数据15种,应用引物设计软件Primer express,根据探针设计原则从理论上选出1条探针和3对引物。根据试验结果对上述引物进行筛选,筛选出能够鉴定出大蒜黑腐病菌的特异性引物对和TaqMan探针。同时对反应体系中复性-延伸温度的反应参数进行优化,设计56、58、60℃ 3个温度梯度;将大蒜黑腐病菌基因组DNA在紫外核酸分析仪上进行定量后进行10倍的梯度稀释,对探针灵敏性进行测试,从而建立大蒜黑腐病菌TaqMan水解探针法qPCR检测体系。【结果】从基于GenBank上的15种gpd基因核酸序列设计的引物和探针中,筛选出能够鉴定大蒜黑腐病菌的特异性引物对Emb21/Emb32和TaqMan探针Emb。在供试的6种菌株中,只有靶标菌大蒜黑腐病菌利用该引物对和探针能够被特异性的检测到阳性,空白对照和其他参试菌均没有荧光信号的增加,检测为阴性。复性-延伸温度反应参数优化中,△Rn荧光信号增加值在58℃时达最大,56、60℃荧光信号增加值降低,经过多次重复试验,确定最佳的复性-延伸温度为58℃。灵敏度测试中,大蒜黑腐病菌DNA浓度稀释到140 pg时,所得的图形较好;当体系中模板浓度稀释到14 pg时,所得的图形较差。最终DNA检测灵敏度为140 pg。应用该引物和探针建立的qPCR检测方法能够从供试的菌株中特异性地检出大蒜黑腐病菌。【结论】建立了大蒜黑腐病菌TaqMan探针法qPCR检测体系,该检测技术能够从供试的6种病原菌中特异性检测出大蒜黑腐病菌,检测灵敏度可达140 pg。建立的基于gpd基因的大蒜黑腐病菌qPCR方法具有高度的特异性和灵敏度,适合口岸大蒜黑腐病菌的快速检测。     

马铃薯早疫病菌RAPD-PCR反应体系优化

为了应用RAPD分子标记技术分析马铃薯早疫病菌遗传多样性,采用单因素水平对影响RAPD反应的Mg~(2+),dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物浓度及引物退火温度等条件进行了优化。结果表明:建立了适宜于早疫病菌的RAPD最佳反应体系,25μL的反应体系中,Mg~(2+)2.5mmo1·L~(-1),dNTPs 0.20mmol·L~(-1),Taq DNA聚合酶1U,引物0.40μmol·L~(~(-1))。     

耐草甘膦转EPSPS/GAT大豆多重PCR检测体系的建立及应用

【目的】建立一种精准、高效的草甘膦抗性基因G2-EPSPS和GAT的检测方法,为转基因大豆新品系ZH10-6的广泛应用提供技术支持。【方法】根据抗草甘膦大豆ZH10-6和受体中黄10的分子特征,设计大豆内源参考基因(Actin)、外源基因(G2-EPSPS和GAT)以及侧翼序列(G2EPSPS-2/ZH10P2和ZH10P1/GAT-2)的特异性引物,通过PCR扩增测试引物的特异性和适用性。调整引物配比、DNA模板量、dNTP含量、退火温度和延伸温度等,筛选该多重PCR体系的最适扩增条件。将转基因大豆ZH10-6和受体中黄10的基因组DNA按质量比混合,制备成100%、50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%和0的DNA样品,进行灵敏度检测。运用建立的多重PCR体系检测转基因大豆ZH10-6不同地理来源的11份衍生品系,并根据鉴定结果对该体系的应用性进行评价。【结果】建立的多重PCR方法中引物GmActin11 F/R、G2-EPSPS F/R、GAT F/R、ZH10P1/GAT和G2/ZH10P2可分别扩增出转基因大豆ZH10-6大小为126、430、338、810和1 626 bp的特异性目标条带。用该方法扩增受体中黄10时,除了GmActin11 F/R可以扩增出126 bp目标条带,侧翼序列上游引物ZH10P1和下游引物ZH10P2也可以扩增出632 bp目标条带。多重PCR最适扩增体系为DNA模板量100 ng、5 U·μL-1 Ex Taq 0.2μL、10×ExTaq Buffer 2.5μL、2.5 mmol·L-1 dNTP 2μL、10μmol·L-1引物(GmActin11 F/R 0.4μL、G2-EPSPS F/R 0.6μL、GAT F/R 0.4μL、ZH10P1/GAT 0.6μL和G2/ZH10P20.6μL),ddH2O补足25μL。多重PCR扩增最适程序为95℃5 min;95℃30 s,60℃30 s,68℃1 min 20 s,35个循环;72℃12 min。该多重PCR体系灵敏度为0.5%,符合欧盟有关转基因产品标识的要求。该多重PCR方法特异性很强,可以成功检测受体中黄10、转基因大豆ZH10-6及ZH10-6不同地理来源的11个衍生品系。【结论】建立的转EPSPS/GAT大豆多重PCR检测体系具有高通量、特异性强、操作简便和应用广泛的优点,并且能够快速、准确地检测转基因大豆ZH10-6及其衍生品系。