玉米ZmbZIP基因植物表达载体的构建

根据玉米(Zea mays)Zmb ZIP的基因序列和植物表达载体pCAMBIA3301的多克隆位点设计带有限制性内切酶位点的特异性引物,以质粒pGM-T-ZmbZIP为模板PCR扩增ZmbZIP基因片段,双酶切目的片段及载体,回收后连接,构建该基因的植物表达载体.结果表明,扩增出的ZmbZIP基因片段长度为894 bp.经PCR检测及测序鉴定,表明植物表达载体构建成功,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.     

降低木质素、提高抗逆性的无标记植物表达载体的构建

采用高保真酶用PCR方法从pM018-BADH载体上扩增出目的基因BADH,替换pBI121质粒中的gus基因,构建pBI121-BADH植物表达载体。经过2对引物检测,证明pBI121-BADH载体构建正确。又从pBI121-BADH质粒中扩增出35s—BADH-nos片段,所用引物加上了Nhe I和Cla I接头,扩增片段经回收后插入到pUCm—T载体中测序。测序表明,所扩增的35s—BADH—nos片段与模版同源性为100％。将测序正确的质粒pUCm-35s—BADH-nos用Nhe I和Cla I酶切后连接到进行了相同酶切的pBI121-xylA载体上,用35s—BADH—nos片段取代pBI121-xylA载体上的npt Ⅱ基因片段,构建pBI121-xflA-BADH双元植物表达载体,该载体经PCR检测和酶切检测,与预期结果相同。最后,用Pme I、Cla I从pBI121-xylA—BADH上切出片段35s—BADH—nos,将其连接到进行了相同酶切的pt4CL1-P载体上,使35s—BADH-nos片段取代pt4CL1-P载体上的npt Ⅱ基因片段,构建了无选择标记的反义4CL—BADH植物双元表达载体。     

牛源整合素β_1亚基的克隆及表达载体的构建

参照已公布整合素β1亚基的基因组序列,设计并合成了对克隆引物,以RT-PCR方法从牛肺组织扩增出约2 400 bp的β1基因,经回收纯化连入PGEM-T载体,测序.依照测序结果设计1对原核表达引物,1对真核表达引物,分别以克隆载体PGEMβ1为模板扩增目的片段,经相应的EcoR I、XhoI和EcoR I、XbaI酶切纯化后,在T4DNA连接酶的作用下,定向亚克隆到原核表达载体pET-28a和真核表达载体pCDNA3.1zero(+)中,PCR、酶切鉴定及序列测定表明,成功构建了β1亚基原核表达载体pETβ1及真核表达载体pCDNAβ1.     

番茄红素环化酶基因片段克隆及反义表达载体构建

根据已知的番茄红素环化酶基因,即13环化酶基因和s环化酶基因的保守序列设计特异性引物。提取番茄叶片的RNA,经RT—PCR反应,扩增出723bp和569bp的目的片段,将它们分别连接到pEASY—T1 Cloning Vector上,测序鉴定其正确性。克隆到载体上的13环化酶基因用BamHI和SmaI双酶切,将基因反向插入PROK2表达载体上,构建PROK2-LYCb反义表达载体。同样连接到克隆载体上的s环化酶基因用BamHI和XbaI双酶切,将基因反向插入PROK2表达载体上,构建PROK2-LYCe反义表达载体。     

油菜菌核病菌激发子基因SsXYN克隆及表达载体构建

以核盘菌菌株NGA4提取的总RNA为模版,利用RT-PCR技术扩增获得SsXYN基因的全长cDNA片段,将其克隆到pMD19-T载体上,菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了核盘菌SsXYN基因。从pMD19-T:SsXYN载体上,用BamH I和Sal I双酶切切下目的基因片段,将该基因片段连接到原核表达载体pET32a中。菌落PCR和酶切鉴定结果显示成功构建了表达载体pET32a:SsXYN。利用热击法将该重组表达载体导入大肠杆菌BL21,获得携带SsXYN基因的大肠杆菌菌株,为进一步研究激发子诱发植物抗病性机理奠定了基础。     

盐生植物盐穗木HcPS_H基因大肠杆菌表达载体的构建

[目的]构建盐穗木HcPS_H基因的大肠杆菌表达载体。[方法]以质粒pGEM-T-HcPS_H为模板,HcPS_H-pET28a-F、HcPS_H-pET28a-R为引物进行PCR扩增,获得两端含酶切位点的HcPS_H基因目的片段。将该目的片段与大肠杆菌表达载体pET-28a通过T4DNA连接酶连接,并转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,得到重组子克隆,抽质粒进行测序鉴定。[结果]扩增出HcPS_H基因片段长度为441 bp,将其连接到大肠杆菌表达载体pET-28a上后,得到重组子质粒,经PCR检测、双酶切验证及测序鉴定,表明成功构建原核表达载体。[结论]该研究成功构建了盐穗木HcPS_H基因的大肠杆菌表达载体,为进一步进行该基因功能的研究奠定了基础。     

牛Cathelicidin BMAP-28基因的克隆及原核表达

根据GenBank中公布的牛BMAP-28基因mRNA序列设计引物,利用RT-PCR技术从牛骨髓总RNA中扩增出BMAP-28基因片段,将其克隆到pMD-18载体上,通过PCR、酶切和测序分析鉴定,获得重组克隆载体pMD18-T-BMAP28.以重组质粒为模板,扩增BMAP-28基因的去信号肽片段,转入原核表达载体PE...     

番茄脯氨酸脱氢酶基因的克隆与RNAi植物表达载体的构建

[目的]克隆了脯氨酸脱氢酶ProDH基因的全长cDNA,构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体,并转化到农杆菌.[方法]以“耐运2000番茄”幼苗为试材,根据GenBan中公布的番茄脯氨酸脱氢酶ProDH基因的序列信息设计了一对特异性引物,克隆了该基因的全长cDNA,分析基因序列选择正反向片段并扩增,并通过酶切、连接的方法构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体PBI121-PDHi利用冻融法将表达载体转化到农杆菌EHA105中.[结果]所克隆到的ProDH基因片段长2 001 bp,其中CDS为1 491 bp,编码380个氨基酸.测序结果与公布序列同源性100％,因此可以用来构建干扰载体;通过酶切与测序鉴定,证明表达载体构建成功.[结论]经特异性引物扩增检测,证明表达载体已转入农杆菌,为进一步的研究该基因奠定了基础.     

黄鳝抗菌肽hepcidin基因大肠杆菌表达载体的构建

[目的]构建黄鳝抗菌肽hepcidin基因大肠杆菌表达载体。[方法]根据Genbank中黄鳝hepcidin基因序列设计引物进行PCR扩增,将测序正确的基因片段连接入载体pET-28a中。[结果]以黄鳝cDNA为模板,扩增出hepcidin基因片段,长度为291 bp,连接到pET-28a上。经PCR扩增、双酶切验证,证实成功构建原核表达载体。[结论]成功构建了黄鳝hepcidin基因大肠杆菌表达载体。     

口蹄疫病毒P1+2A基因真核表达载体的构建

通过RT-PCR方法获得了口蹄疫病毒O型,编号为OF3毒的P1+2A区的目的基因,并将其克隆到克隆载体pMD18-T上,再根据表达载体pQE-Trisystem的特性及酶切位点设计合适的表达引物.由表达引物通过PCR技术从克隆载体上扩增出带有特定酶切位点的目的片段,再对载体和目的片段进行酶切处理,处理后由T4 DNA连接酶将二者连接.通过PCR及酶切鉴定,结果证明口蹄疫病毒目的基因片段已被正确克隆到表达载体pQE-Trisystem上.     

笋瓜韧皮部特异性启动子的克隆分析及新型植物表达载体构建

根据已报道具韧皮部组织特异性的笋瓜韧皮部蛋白2（PP2）基因序列设计引物,以山西本地种笋瓜叶片基因组DNA为模板,用PCR法扩增得到了长度为966bp的PP2基因启动子片段,克隆入pUCm—T载体后,经鉴定获得了新的重组质粒pUCm—PSP,测序和序列分析表明与两个已报道的片段分别有95％和99％的同源性,推测具有相似的启动子功能。分别用限制性内切酶PstⅠ和BglfⅡ双酶切重组质粒pUCm—PSP和由CaMV35S组成型启动子驱动GFP报告基因的双元植物表达载体pCAMBIA1302,分别回收pUCm—PSP重组质粒中的PSP小片段和pCAMBIA1302植物表达载体中去掉GFP报告基因上游CaMV35S组成型启动子的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动报告基因GFP的新型植物表达载体pHZ03。利用细胞感受态法将新植物表达载体分别导入根癌农杆菌EHA105、GV3101、LBA4404和发根农杆菌Ri15834中,为进一步研究其表达功能奠定了基础。     

八氢番茄红素脱氢酶基因超表达载体的构建及表达鉴定

八氢番茄红素脱氢酶(PDS)是植物类胡萝卜素生物合成途径中促进番茄红素合成的关键酶,根据番茄中该酶的编码基因序列设计一对特异引物,通过RT-PCR在番茄中扩增出一个约1 900 bp的全长cDNA片段。对这个全长片段构建了超表达载体,酶切检测表明该片段已插入植物表达载体。采用农杆菌介导的方法转化番茄获得10株转基因植株,PCR检测表明外源基因已导入番茄基因组中。转基因番茄果实的番茄红素含量分析结果表明,转基因后代株系番茄红素平均含量比对照增加了1.4倍,PDS编码基因的超表达有效促进了番茄果实中番茄红素的合成和积累。     

木薯淀粉合成酶SSS Ⅱ基因片段的克隆与分析

[目的]建立木薯块根RNA的提取方法,并克隆和鉴定淀粉合成酶SSS Ⅱ基因核心片段。[方法]采用改良的CTAB法提取木薯块茎RNA,反转获得cDNA模板,同时基于已知植物的SSS Ⅱ基因同源性,设计简并引物,进行RT-PCR扩增,通过Blast在线检索比对对基因功能进行了初步鉴定。[结果]所获得片段即为木薯SSS Ⅱ基因的核心序列。[结论]该研究为木薯淀粉合成酶SSS Ⅱ基因全长cDNA序列的克隆及其反义载体的构建奠定了基础,同时为实现优质淀粉的代谢工程提供了理想的候选基因。     

cNHX1基因转化草莓的研究

[目的]探讨将完整的含柑橘cNHX1基因转化为草莓植株。[方法]以弗吉尼亚草莓品种为试材构建了含柑橘cNHX1基因的植物表达载体,并进行了酶切鉴定,然后将表达载体导入农杆菌EHA105中,获得了工程菌株;利用农杆菌转化法,把cNHX1基因转化成草莓植株,并利用PCR方法鉴定了转化植株。[结果]利用农杆菌转化法获得了转cNHX1基因,通过进一步利用含Kam的平板进行筛选,获得了纯合的转基因植株;对获得的转基因草莓植株提取叶片DNA,利用引物F01和R02进行扩增,结果在草莓基因组中可以扩增出1.63kb的目的条带,证明cNHX1基因已经整合到草莓基因组。[结论]为获得耐盐程度显著提高的转基因草莓奠定了初步基础。     

茄子反转录转座子基因片段克隆中的2种DNA回收方法的效果比较

根据已报道的反转录转座子的序列设计合成一对引物,以西安绿茄基因组DNA为模板,采用PCR扩增的方法扩出一条DNA特异片段并克隆到pMD18-T载体中。采用一种新建立的在可见光下参照位置标记方法回收目的DNA片段,并与常规的在紫外光下回收的目的DNA片段进行了克隆效果比较。结果表明,在紫外光下回收的茄子反转录转座子基因片段易出现目的DNA片段断裂,而在可见光下参照位置标记回收DNA的方法能保证目的DNA片段的完整性。     

大豆疫霉多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因毕赤酵母表达载体的构建

[目的]构建大豆疫霉多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因毕赤酵母表达载体。[方法]利用PCR方法从大豆疫霉菌cDNA中扩增多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因。用限制性内切酶EcoRI和Not1分别酶切此基因和毕赤酵母表达载体pPIC9K,然后用T4连接酶将目的基因克隆到pPIC9K载体中构建此载体。[结果]扩增的大豆疫霉菌pspgl基因成熟肽片段大小为1250bp。用基因特异性g}物扩增阳性重组子,可得到大小为1200bp的片段。而用载体特异性引物扩增阳性重组子,可得到大小为1200和1700bp两条带,多出来的400bp恰好符合载体部分的大小。将此特异性片段PCR扩增回收,序列测定发现大豆疫霉pspg1基因已经成功地插入到表达载体中。[结论]该研究为进一步研究大豆疫霉菌pspg1基因在毕赤酵母中高效表达奠定了基础。     

甜瓜多聚半乳糖醛酸酶反义基因植物表达载体的构建

选育耐贮运品种是解决甜瓜贮运难题的有效途径之一.用特异引物从含甜瓜多聚半乳糖醛酸酶(PG)cDNA全序列的pCMPG质粒中克隆出PG基因,将该基因连接至pGEM-T Easy载体,获得重组质粒pGEM-PG.先用SacI和XbaI双酶切pGEM-PG,再用SacI和XbaI消化pBI121,得到除去了GUS基因的线状载体.从pGEM-PG质粒上切下的PG1 cDNA片段的粘性末端和pBI121线状载体的粘性末端恰好反向匹配,构建了甜瓜PG1 cDNA反义序列植物表达载体.     

法氏囊炎病毒VP2基因高变区片段的克隆与鉴定

[目的]研究法氏囊病毒VP2蛋白的抗原表位在机体免疫应答中的作用和特点。[方法]以接种传染性法氏囊病毒(IBDV)的鸡胚尿囊液为模板,根据Genbank中登录的IBDV的VP2蛋白基因的全序列设计引物,通过RT-PCR扩增获得VP2高变区部分片段,将其克隆到原核表达质粒PGEX-4T-1中,经酶切鉴定后,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)BL21,筛选阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]通过PCR扩增获得一个504bp的扩增片段,序列分析结果表明它与GenBank中登录的IBDV的VP2蛋白基因的核苷酸序列同源性达99.8%,其氨基酸序列的同源性为99.4%,说明各毒株间高变区基因序列保守性很高。[结论]法氏囊炎病毒毒株在两个大小亲水区内的氨基酸都非常保守。     

马铃薯A病毒云南分离物外壳蛋白基因的克隆与序列分析

根据马铃薯病毒A(Potato virusA,PVA)外壳蛋白(CP)基因序列设计合成的一对引物,以带病毒植株总RNA为模板,RT-PCR扩增得到长约800 bp的目的片段。将目的片段克隆至pGEM-T Easy载体并进行了序列测定,测得全长为807 bp的PVA CP基因。测序结果与PVA其他分离物CP基因序列比较,其氨基酸同源性最高可达98.5%。根据GenBank中PVA CP氨基酸序列建立了病毒的系统进化树并对PVA不同分离物CP氨基酸序列差异性进行了分析。     

奶牛β-防御素5基因的克隆与原核表达

根据已发表的β-防御素5基因序列设计引物,采用RT-PCR技术扩增奶牛白细胞β-防御素5基因片段,构建原核表达载体并进行诱导表达.结果表明:将PCR产物插入pGEM-T easy载体后,经琼脂糖凝胶电泳、PCR、酶切及DNA测序证明构建的重组克隆载体完全正确,以该重组质粒为模板扩增目的基因的成熟肽片段,产物用EcoR I+NotⅠ双酶切并与原核表达载体PET28a连接,获得了预期的重组表达质粒.将重组表达质粒转化到BL21(DE3)宿主菌中,用异丙基--βD-硫代半乳糖苷诱导表达,经尿素-SDS-PAGE检测表明表达产物为6.4 kda的融合蛋白.