亚东鲑基因组中Tc1-like转座子的序列歧化特征分析

根据鱼类Tc1-like超家族转座子的末端反向重复序列设计单引物,对西藏亚东鲑基因组进行PCR扩增、回收、克隆和测序,鉴定出亚东鲑两条长度为1 607 bp和1 473 bp的Tc1-like超家族转座子序列,命名为Tbt1和Tbt2。序列分析表明,亚东鲑Tbt1转座子左右两端分别存在一个196 nt和225 nt的末端反向重复序列(Inverted terminal repeats,ITR),在左右ITR中分别包含2个12 nt的亚末端反向重复序列(Subterminal inverted repeats,SIR);亚东鲑Tbt2转座子分别存在一个32 nt和31 nt短的ITR,其左右ITR中各仅包含1个12 nt的SIR。亚东鲑Tbt1、Tbt2转座子的转座酶编码区在进化过程中各已积累了4个和9个终止突变,两者均不能表达完整的转座酶。亚东鲑Tbt2与其它鲑科鱼类Tc1-like转座子的相似度低于30%,而与金鱼Tca2转座子的序列相似度高达98%,显示该转座子的获得可能起源于基因水平转移(horizontal gene transfer,HGT)方式。     

怀地黄基因片段及其中转座酶基因的克隆与序列分析

根据已知裂叶牵牛花PNZIP启动子碱基序列的相关信息设计引物,采用PCR方法,从怀地黄基因组中扩增出5个基因片段,回收和克隆出其中一个1 096bp的基因片段。经过NCBI对比分析,发现它是一个类似转座子的相关蛋白基因序列,含有一个完整的开放阅读框,大小为450bp,编码由150个氨基酸组成的转座酶。然后,基于该开放阅读框的碱基序列,设计另一对引物,用PCR方法,从中扩增出该完整开放阅读框的序列片段。     

家蚕中Brown候选基因的克隆及序列分析

Brown是一种色素运输载体基因(ABC transporters),与色素颗粒形成与转运相关,对昆虫的眼色形成有着重要影响.根据果蝇中Brown蛋白氨基酸序列,在家蚕数据库Silk DB中进行相似性搜索,并结合cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得家蚕brown候选基因的cDNA序列,全长1887 bp,开放阅读框(ORF)大小为1797 bp,编码598个氨基酸残基,该基因组DNA含有外显子11个,且起始密码子在第1个外显子内.预测蛋白序列有典型的ABC_ trans和ABC2_ membrane结构域,同源性分析表明,编码的蛋白序列归类至ABC_trans家族中的Brown蛋白亚族.     

桃果肉近核色素copia-like反转录转座子序列分析及分子标记的建立（英文）

通过对与桃果实近核色素紧密连锁的SRAP标记Me07Em02扩增得到的片段进行了验证、回收、测序和分析,并登录桃基因组Peach v1.0进行比对,获得部分copia-like反转录转座子的部分序列,应用DANMAN和DNASTAR序列分析软件辅助,在桃基因组数据库和GenBank中进行BLASTn比对获得了桃copia-like反转录转座子的全基因组序列,位于Peach v1.0基因组的Scaffold-1的9 939 764～9 944 771 bp位置,全长5 008 bp,其左右两边的长末端重复序列(LTR)完全一致,长度为444 bp,其最大开放阅读框(ORF)位于该序列的487～4 545bp,编码1 535个氨基酸,将该氨基酸序列提交到GenBank中进行Protein BLAST比对,结果显示该序列也具有典型的copia-like反转录转座子的氨基酸序列特征。同时初步建立了桃反转录转座子标记方法,并对桃的遗传多样性进行了分析。     

苹果微型反向重复转座元件（MITE）的分离与鉴定

【目的】从苹果基因组中分离微型反向重复转座元件(MITE),研究其对苹果基因组进化的作用。【方法】利用PIF转座酶简并引物扩增苹果PIF转座酶基因,采用染色体步移技术获得PIF转座酶基因的未知侧翼序列,使用EMBOSS的Eiverted软件查找靶位点重复(target site duplication,TSD)和末端反向重复(terminal inverted repeat,TIR)序列。【结果】苹果MITEs拥有MITEs的典型特征,包括长度短,不具有潜在的编码能力,富含A+T,易插入非编码区,有TIRs和TSDs,有形成二级结构的可能。【结论】苹果MITEs属于Tourist家族,与苹果PIF DNA转座子相关;苹果MITEs与基因相连,在基因调节上起重要作用;苹果MITEs具有潜在的转座能力,对苹果遗传多样性、进化及育种有重要作用。     

玉米邻甲基转移酶基因bx12-ZaC546的克隆及其生物信息学分析

邻甲基转移酶是与玉米抗虫性密切相关的苯并噁嗪类化合物生物合成中的关键酶之一,由bx12基因编码。为深入研究bx12基因的表达与调控机理,该研究从我国玉米自交系ZaC546中克隆出了含有目的基因bx12的目标DNA片段Zm3325-ZaC546。测序结果证明:从ZaC546基因组中分离的目标DNA序列长度为1 010bp,含有完整的开放阅读框(ORF)。与玉米基因组数据库上的参考序列相比,目标DNA序列在其ORF的内部,从起始密码子的第1个碱基开始,下游第204个碱基位置上存在1个碱基突变,由G突变为A,遗传密码由AAG变为AAA,但氨基酸不变,都编码赖氨酸(Lysine,K)。虽然,目标DNA序列在其ORF的下游,第883个碱基G发生缺失,第905个碱基由T突变为C,但因这2个突变位于ORF的下游,并不影响目的基因的编码活性。目标DNA序列Zm3325-ZaC546与参考序列的一致性为99.70%,阅读框序列的一致性为99.87%;而由目的基因编码的蛋白质氨基酸序列与参考序列的一致性为100%。生物信息学分析结果表明:本研究中克隆的基因所编码的邻甲基转移酶蛋白属于邻甲基转移酶基因超级家族2。该酶是一种多功能酶,具有2个大的结构域,一个位于N-末端一侧,具有甲基转移酶蛋白二聚化功能;另一个位于C-末端一侧,具有甲基转移酶功能和邻甲基转移酶功能。     

甘蓝冷胁迫相关基因BobHLH18克隆与表达分析

利用同源克隆方法在耐寒,迟抽薹甘蓝自交系Y923中克隆到一个甘蓝响应冷胁迫b HLH转录因子基因Bob HLH18的DNA和c DNA全长,基因组搜索分析结果表明,该基因位于甘蓝1号染色体上,属于LF1亚基因组编码基因;序列分析结果表明,该基因含有4个外显子和3个内含子,编码338个氨基酸,蛋白质分子量为38 380,等电点为6. 80,其编码蛋白质的N端含有一个b HLH结构域;亚细胞定位分析指出该基因编码蛋白质定位在细胞核上,表明该基因编码蛋白质为核定位蛋白质,与其为转录因子特征相符;序列比对结果显示,Bob HLH18蛋白与白菜和拟南芥中的b HLH蛋白具有较高的同源性,相似度分别为90. 5%和89. 0%;聚类分析指出Bob HLH18及其同源蛋白分别聚类成2个进化分支,且来自十字花科植物的b HLH18同源蛋白质都聚在同一进化分支上; qRT-PCR分析结果表明Bob HLH18基因受冷胁迫诱导,能在叶片中被较高的诱导表达,表明该基因可能在甘蓝叶片应答冷胁迫过程中起重要作用。     

水稻干尖线虫SPRYSEC基因的克隆及表达定位分析

根据水稻干尖线虫转录组测序结果,采用c DNA末端快速扩增技术(RACE法)从水稻干尖线虫中克隆到效应因子SPRY同源基因,并将其命名为Ab–SPRYSEC(NCBI登录号为KT188820)。该基因全长为2 089 bp,包含1个1 962 bp的开放阅读框(ORF)。预测蛋白编码653个氨基酸,相对分子质量为72 009,理论等电点为4.82,不稳定指数为41.5,属于不稳定性蛋白。保守区预测分析结果表明,该蛋白含有B302_SPRY和CTLH 2个保守结构域,属于SPRY超家族。多序列比对分析结果表明,该基因编码蛋白与马来丝虫的SPRY(XP_001891979.1)蛋白的相似度为43%。蛋白结构分析结果表明,β–折叠与无规则卷曲是Ab–SPRYSEC蛋白的主要结构元件。表达定位分析结果表明,Ab–SPRYSEC基因的表达位置在水稻干尖线虫食道腺附近。Ab–SPRYSEC基因作为水稻干尖线虫效应因子,在水稻干尖线虫侵染宿主中发挥了重要作用。     

高亲和力玉米转磷蛋白基因B103-Zm5473电子克隆及其生物信息学分析

采用电子克隆技术,从玉米自交系B103中克隆出1个高亲和力转磷蛋白基因B103-Zm5473。测序及生物信息学分析结果表明:从B103中克隆的目标DNA序列长度为2 218bp,包含1 608bp构成的开放阅读框(ORF),编码由535个氨基酸组成的蛋白;与玉米标准基因组上注释的基因GRMZM2G045473相比,在DNA序列上存在1个碱基差异,但所编码的蛋白完全相同。生物信息学分析结果表明:来自B103的目的基因编码的B103-Zm5473P蛋白含有转运蛋白FMS超基因家族的高亲和力转磷蛋白Pht1家族蛋白的特征序列GGDYPLSxxIxSE,具有由12个跨膜区和13个亲水区;在13亲水区中,包括N-末端亲水区和C-末端亲水区在内的7个亲水区伸入细胞内部,另外6个亲水区伸出细胞的外部,在第6和第7跨膜区之间存在1个大的亲水区的特征。故该研究中克隆的基因B103-Zm5473,初步推断为Pht1家族的高亲和力转磷蛋白基因。     

东乡野生稻重复序列的克隆分析及染色体定位

从东乡野生稻(O ry za ruf ipogon G riff)中克隆到7个重复序列,序列分析表明:这些序列是与转座因子有关的序列。以序列H 2为探针,对不同基因组水稻进行Southern杂交,表明该序列为稻属内AA基因组特异的重复序列。其分布在水稻的多条染色体上,荧光原位杂交(F ISH)结果显示该重复序列主要位于染色体的着丝粒以及端粒附近,重复单位序列长度为615 bp左右。并就特异重复序列在水稻研究中的应用进行了讨论。     

水稻半胱氨酸蛋白酶OsCP2的特征分析及其原核表达与纯化

半胱氨酸蛋白酶是植物体中重要的蛋白水解酶,广泛参与种子萌发、幼苗发育、胁迫响应和组织分化衰老等生理过程.我们对水稻中半胱氨酸蛋白酶基因OsCF2 (Oryza sativa cysteine protease 2)序列进行分析.该基因cDNA全长2 279 bp,由2个外显子和1个内含子组成;包含1个1 089 bp的开放读码框,编码1个含362个氨基酸残基的蛋白,在蛋白氨基端有-36个氨基酸组成的信号肽.生物信息学分析表明,OsCP2与大麦半胱氨酸蛋白酶HvCP同源性最高,同属木瓜蛋白酶亚家族.另外,我们构建了pET32a/CP2原核.表达载体,通过转化大肠杆菌BL21DE3,成功表达了OsCP2重组蛋白.分子量约为58kD;通过纯化包涵体获得了纯度高达90%以上的重组OsCP2蛋白,这为进一步研究该基因的功能提供了基础.     

巴西橡胶树HbCXE1基因克隆及其生物信息学分析

采用PCR和RACE技术从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的乳管细胞中克隆到一条CXE羧酸酯酶蛋白家族基因HbCXE1,该基因cDNA全长1272 bp,含有一个长951 bp的阅读框,编码含316个氨基酸的HbCXE1蛋白。生物信息学分析表明,HbCXE1蛋白理论分子量为35.5437 ku,理论等电点为5.94,HbCXE1蛋白与蓖麻、杨树、葡萄、苹果、拟南芥的CXE蛋白同源性分别为75.08%、62.81%、62.31%、59.43%、57.68%。HbCXE1蛋白具有羧酸酯酶蛋白家族的特征结构,有一个保守的催化基团,由分布于一级结构基序中的不同位置的3个保守氨基酸[丝氨酸（位于保守的G-X-S-X-G结构域中间）、天冬氨酸/谷氨酸、组氨酸]组成,一个保守的氧离子洞HGG结构域,有8个β-折叠结构,5个α-螺旋结构,因此HbCXE1蛋白属于羧酸酯酶蛋白家族,可能参与橡胶树乳管细胞的防卫反应。     

水稻OsNHO1基因cDNA序列分离及表达分析

OsNHO1是一种甘油激酶,受多种因素的诱导,在植物先天免疫反应中起着重要的作用。笔者采用同源序列法,根据已报道的拟南芥NHO1基因序列结合水稻基因组测序结果,筛选水稻OsNHO1基因,采用RT-PCR获得水稻OsNHO1基因全长cDNA(1 590 bp,529AA),并通过半定量RT-PCR方法分析OsNHO1基因在SA,PXO99刺激下的表达模式,结果显示OsNHO1基因的表达受SA,PXO99的诱导,为进一步研究OsNHO1的具体功能和作用机理奠定了基础。     

簇毛麦Dvblt101基因及其启动子的克隆与序列分析

BLT101家族是一类高度保守的小分子质膜蛋白,在植物抗寒、耐旱、耐盐、脱落酸(ABA)应答等过程中起重要作用。利用PCR技术从抗寒、耐旱的簇毛麦中克隆了Dvblt101基因及其启动子。结果表明,Dvblt101cDNA全长422 bp,具有完整的开放阅读框(ORF),编码一条54个氨基酸残基的多肽,并具有2个保守的跨膜结构域;Dvblt101基因长为754 bp,含有2个外显子和1个内含子,启动子区域具有2个干旱/冷应答核心元件(DRE/CRT)、2个MYC结合位点和3个ABA应答元件(ABRE),该基因对低温、干旱等逆境及ABA可能存在广泛的应答。本研究为进一步揭示BLT101家族在簇毛麦抗逆过程中的作用机理奠定了基础。     

Xa21全生育期表达载体的构建

利用PCR技术,以水稻品种明恢63基因组DNA与携Xa21完整基因组片段的载体pDBXa21作为模板,分别克隆了RSuS1启动子（RSP）、Xa21的开放阅读框至终止子的片段,并构建了RSP驱动水稻广谱抗白叶枯病基因Xa21的转基因表达载体。实时荧光定量PCR技术证实,水稻蔗糖合酶基因1（rice sucrose synthase gene 1,RSuS1）在水稻种子中低表达,在叶鞘与叶中全生育期高效表达。     

黄曲条跳甲E型前列腺素受体cDNA的鉴定及表达谱研究

前列腺素(Prostaglandin,PG)的受体(E-Prostaglandin Receptors,EP)与细胞信号传导密切相关,对于昆虫免疫、生殖等具有重要意义。为促进重要蔬菜害虫黄曲条跳甲前列腺素受体的功能研究,结合转录组测序和荧光定量PCR等方法,分析了黄曲条跳甲PGE2受体EP(PsEP)的cDNA序列及基因表达情况。结果表明,PsEP的cDNA的开放阅读框为1 323 bp,编码323个氨基酸,含有典型的G-蛋白耦联受体家族1结构域,但其亚型分类还有待进一步验证。PsEP分子在成虫的多种组织器官中都有表达,但生殖系统和中肠相对较高。此外,雌雄之间对比发现,雄虫PsEP表达量均比雌虫对应组织器官的表达量要高。     

香蕉水通道蛋白基因的克隆与表达分析

[目的]更好了解香蕉果实与水分代谢的关系。[方法]依据从抑制差减杂交文库(SSH)中获得的一个cDNA序列,设计5′和3′RACE引物,从香蕉果实中扩增基因5′和3′末端片段,并用RT-PCR的方法探讨该基因在香蕉各组织中的表达情况。[结果]获得一个1 132 bp的水通道蛋白全长基因,命名为MaPIPl;1。MaPIPl;1基因包含861 bp的完整阅读框架,编码的蛋白有6个跨膜结构及aspara-gine-proline-alanine(NPA)和aromatic/arginine 2个保守区。其与水稻水通道蛋白基因OsPIP1;2在氨基酸序列上有94.1%的一致性和97.9%的相似性。且MaPIP1;1在香蕉各器官中均稳定表达。[结论]MaPIPl;1可能与香蕉的水分代谢相关。     

紫大麦草中DREB类转录因子基因Hvi917DREB2的克隆、原核表达及序列分析

DREB类转录因子是一类与植物逆境胁迫响应相关的重要蛋白,本研究利用同源克隆方法和RACE技术从紫大麦草(Hordeum violaceum)中分离到1个DREB类转录因子基因,命名为Hvi917 DREB2。序列分析表明Hvi917 DREB2基因含有1个792bp的开放阅读框,编码264个氨基酸残基,含有1个保守的AP2结构域,属于AP2大家族。该基因编码的氨基酸序列与Genebank中短芒大麦草AP2蛋白HbDREB2、DREB1(登录号分别为:AAU29412.1和AER42620.1)具有99%的氨基酸序列一致性。将该基因构建成原核表达载体,经IPTG诱导表达了1个分子量为34.5kD的蛋白。     

水稻L-半乳糖脱氢酶基因的克隆与序列分析

[目的]对水稻L-半乳糖脱氢酶（L-GalDH）基因进行克隆与序列分析。[方法]通过RT-PCR从水稻中克隆了L-GalDH基因,采用GenBank的BLAST程序进行序列分析。[结果]水稻L-GalDH基因的cDNA全长1 340 bp,包含一个长为951 bp的完整开放读码框,推导的氨基酸序列与其他植物的L-半乳糖脱氢酶基因的同源性较高,其中与大麦的同源性最高,序列一致率为92%,与菠菜的序列同源性稍低,一致率为71%。系统进化分析结果表明不同来源的L-GalDH基因聚为3类。[结论]该研究为L-GalDH基因的功能研究打下了基础。     

谷子SiARGOS1的克隆、表达分析和功能标记开发

【目的】从谷子中分离受激素诱导表达、参与器官大小控制的拟南芥ARGOS(Auxin-regulated gene involved in organ size)基因家族的同源基因,进行生物信息学分析,明确其在不同组织器官及其受植物激素诱导的表达模式,分析基因编码区及其启动子序列差异,开发功能标记,为谷子产量性状相关基因的改良提供依据。【方法】通过对已有ARGOS蛋白保守结构域进行BLAST,明确谷子ARGOS家族成员数目并进行蛋白序列分析,采用同源克隆方法获得谷子ARGOS家族成员之一——SiARGOS1编码区及其启动子序列,用生物信息学方法分析SiARGOS1启动子的顺式作用元件,通过实时荧光定量PCR分析该基因在谷子各器官中以及不同植物激素条件下的诱导表达模式,利用基因编码区及启动子序列的SNP和插入缺失序列开发分子标记,同时利用85份谷子品种的穗重(panicle weight,PW)、穗粒重(grain weight,GW)和千粒重(thousand-grain weight,TGW)等产量性状数据进行基因型间的差异显著性分析,挖掘用于检测该基因与谷子产量性状相关优异等位变异的功能标记。【结果】获得6个谷子ARGOS家族成员,均具有典型的保守OSR(organ size related)结构域,包含2个跨膜螺旋结构和1个高度保守富含亮氨酸区域,克隆了与拟南芥AtARGOS同源的家族成员之一——SiARGOS1编码区及其启动子序列,该基因位于谷子第8染色体上,开放阅读框为342 bp,无内含子,编码113个氨基酸,启动子区域为2 109 bp,含有与生长素、乙烯、茉莉酸和赤霉素等多种植物激素调控有关的元件。表达分析发现,SiARGOS1在谷子根、茎、叶和穗等器官中均有表达,在根中表达量最高,其次为茎和叶,穗中表达量最低。SiARGOS1对生长素吲哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)不敏感,但受乙烯利(ethephon,ETH)上调表达。不同基因型谷子SiARGOS1序列分析发现,SiARGOS1编码区151 bp(起始密码子83 bp)处存在1个SNP(C/G),导致该基因第28个氨基酸发生突变(Ala/Gly),据此设计一个CAPS-AccⅡ标记;另外,启动子区存在19个SNP和2个In Del,根据-1 652—-1 651处(TA)_(2/3)和-1 165—-1 163处(TCA)_(1/2)的序列差异分别设计SSR引物AP-1和AP-2。同时,用这些标记对85份谷子品种进行检测,CPAS-AccⅡ和AP-1检测到不同基因型的穗重、穗粒重和千粒重的差异均不显著,而AP-2检测的2种基因型间除千粒重差异不显著外,穗重和穗粒重在2015和2016两年间差异均达到显著水平。【结论】在谷子中发现6个ARGOS家族成员,均具有保守OSR结构域,其中,谷子SiARGOS1开放阅读框为342 bp,无内含子,与拟南芥AtARGOS同源,该基因对生长素不敏感,但受乙烯利上调表达。在该基因启动子区开发的SSR标记AP-2可作为功能标记,用于谷子穗重和穗粒重等产量性状相关优异等位变异的鉴定和筛选。