木薯MePYL12基因克隆及采后生理性变质过程的表达分析

【目的】脱落酸受体PYL家族基因为ABA信号通路的重要成员。研究PYL基因在木薯块根的采后生理性变质(post-harvest physiological deterioration, PPD)和非生物胁迫中的功能,能够为进一步研究ABA信号在木薯抗逆和PPD过程中的功能奠定基础。【方法】本研究从木薯品种SC124中通过RT-PCR技术克隆得到了MePYL12基因,对它的蛋白质进行相关生信分析,如遗传进化关系、结构域、蛋白质结构预测、理化性质及基因的启动子元件分析,同时对MePYL12基因在相关处理和木薯PPD过程中的表达量进行分析。【结果】(1)克隆得到的MePYL12长度为567 bp,氨基酸数量为188,理论等电点为5.55,三级结构预测显示含有典型PYL螺旋手柄结构,与蓖麻和橡胶树中PYL蛋白序列的相似性较高,达到了86.77%和94.68%。MePYL12基因的蛋白序列含有PYL蛋白家族的保守结构域,特别是ABA结合的区域"Latch"和"Gate"序列100%一致,这些结果表明MePYL12基因编码的蛋白质属于PYL家族成员并且高度保守。(2)10个木薯组织中的MePYL12基因表达分析显示,该基因在分生组织和叶片中的表达水平最高。(3)MePYL12基因主要的启动子元件为光应答元件(Light-responsive motifs)、干旱诱导元件(Drought-inducedmotif)、 ABA应答元件(ABAresponsivemotif)等元件。(4)MePYL12基因的表达水平显著受到干旱胁迫和ABA处理诱导。在木薯块根的PPD过程也被显著诱导,在6 h达到最高,随后慢慢下降。【结论】MePYL12基因具有提高植物应对非生物胁迫能力的潜能,同时可能参与了木薯块根的PPD过程,也为后续研究相关功能奠定了基础。     

玉米脱落酸受体ZmPYL9基因的克隆及功能探究

脱落酸(ABA)参与植物发育过程以及调控多种非生物胁迫的适应性,PYL基因作为ABA受体,直接影响ABA的生物合成。为了探究玉米中PYL家族基因的功能,克隆了一个ZmPYL9基因,该基因编码197个氨基酸;物种同源蛋白质系统进化分析发现,ZmPYL9与高粱同源蛋白相似度甚高,且具有相同的保守基序;启动子顺式作用元件分析发现,ZmPYL9基因ATG上游2 000 bp区域含有多种激素应答相关的结合位点;ZmPYL9基因组织表达分析结果表明,该基因属于组成型表达,在胚乳中高度表达。ZmPYL9基因正向响应外源ABA诱导,恢复正常培养后,该基因表达量急速下降且低于CK;但是ZmPYL9基因受PEG和PEG+ABA负向诱导,且在PEG+ABA胁迫下该基因表达量高于PEG胁迫下,恢复正常培养后,2种胁迫下该基因的表达量均表现上升趋势。说明ZmPYL9基因响应干旱胁迫和ABA诱导,且ABA可以提高干旱胁迫下该基因的表达量。     

水稻SUPERNUMERARY BRACT(OsSNB)基因应答非生物胁迫和激素的表达特性

AP2转录因子家族普遍存在于植物中,在调控植物发育过程中起到非常重要的作用。前期研究表明,SUPERNUMERARY BRACT(OsSNB)属于AP2转录因子亚家族成员,含有两个保守的AP2结构域,主要参与调控小穗分生组织向花分生组织的转换以及花器官的发育。利用RAP-DB水稻数据库搜索到基因OsSNB,通过序列分析发现 OsSNB启动子序列中含有GCC-box、ABRE、DRE、WRKY等应答非生物胁迫及激素信号的元件;基因表达分析表明,OsSNB基因的表达受NaCl、干旱胁迫和激素ABA以及乙烯前体ACC的诱导。这些结果表明水稻OsSNB基因可能参与调控逆境胁迫反应,在植物生长发育和非生物胁迫的应答中均具有重要功能。     

木薯PYL13基因克隆及表达分析

[目的]解析木薯脱落酸(ABA)受体PYR/PYL/RCARs家族基因(MePYL13)在木薯块根采后生理性变质(PPD)过程中的功能作用,为后续探索ABA信号通路在木薯PPD中的功能及作物抗逆育种打下基础.[方法]从木薯品种SC8中克隆MePYL13基因,应用生物信息学分析方法对其编码蛋白的理化性质、亲疏水性、保守结构域及二、三级结构等进行预测,对基因上游启动子进行元件分析,通过亚细胞定位观察MePYL13蛋白在植物细胞中的定位情况,并利用实时荧光定量PCR检测MePYL13基因在木薯PPD过程中的相对表达量.[结果]克隆获得的MePYL13基因编码区(CDS)长度663 bp,编码220个氨基酸,蛋白分子量23.957kD,理论等电点(Ip)为6.74.MePYL13蛋白与巴西橡胶树(XP 021654464.1)PYL家族蛋白的氨基酸序列同源性最高,为91.55%,表明MePYL13蛋白氨基酸序列具有高度保守性.从MePYL13基因启动子鉴定获得与非生物胁迫逆境相关的响应元件,包括厌氧诱导元件(ARE,AAACCA)、光响应元件(ATCT-motif,AATCTAATCC)、干旱MYB元件(MBS,TAACTG)及ABA应答元件(ABRE,AAACAGA)和分生组织表达相关元件(CAT-box,GCCACT)等;MePYL13蛋白在木薯细胞的细胞核和细胞质上均有表达.随着PPD进程的推移,MeP YL13基因相对表达量整体上呈上升趋势,至PPD后期(48 h)其相对表达量是0h时(PPD前)的16倍,即MePYL13基因受木薯块根PPD的显著诱导.[结论]MePYL13基因是PYR/PYL/RCARs家族成员,可能在木薯块根PPD过程中发挥正向调控作用,为培育木薯PPD改良品种提供了潜在基因资源.     

木薯MePP2CAa基因克隆、表达及蛋白互作分析

为探究2C型蛋白磷酸酶（protein phosphatase 2C， PP2C）在木薯响应非生物胁迫过程中的作用，利用木薯Arg7叶片cDNA扩增MePP2CAa基因，分析该基因序列、启动子活性、不同逆境和激素处理下的表达模式以及与ABA受体PYLs之间的互作关系。序列分析结果显示，MePP2CAa基因全长1 311 bp，编码436个氨基酸，具有PP2C家族的结构域特征，与橡胶树和麻风树的PP2C序列同源性最高，分别为78.95%和74.09%，在C端保守；qRT-PCR分析结果显示，MePP2CAa基因在木薯储藏根中的表达显著高于茎、叶中的表达量；不同逆境和激素处理结果显示，甘露醇、NaCl、ABA、MeJA、低温和SA处理可以显著诱导MePP2CAa基因的表达；MePP2CAa基因启动子序列分析显示，启动子包含ABA应答元件（abscisic acid responsive element，ABRE）、MeJA响应元件、干旱诱导元件等；酵母双杂交结果显示MePP2CAa能够与MePYL1互作。以上结果表明，MePP2CAa基因可能响应木薯的非生物胁迫。     

毛果杨PtAREB1基因启动子的克隆及功能

为了研究杨树ABF2同源基因的表达规律,从毛果杨基因组DNA中克隆出Pt AREB1基因上游一段1 800 bp序列。序列分析结果表明,该序列含有逆境胁迫响应元件TC-rich repeats、ABA应答元件ABRE和茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,Me JA)应答元件TGACG-motif等胁迫相关元件。在序列分析的基础上,构建了Pt AREB1基因启动子驱动GUS报告基因的植物表达载体,利用农杆菌介导的花粉管通道法获得转基因拟南芥。结果表明Pt AREB1启动子可以在干旱、ABA、盐、Me JA和SA胁迫下,驱动GUS基因在转基因拟南芥的根、茎和叶中表达。说明Pt AREB1基因可能与干旱、高盐等胁迫应答紧密相关。     

拟南芥盐胁迫响应启动子的生物信息学分析

本研究使用生物信息学方法分析了拟南芥盐胁迫响应的顺式作用元件.首先分析盐胁迫0.5 h、1 h的拟南芥全基因组芯片,得到627个盐胁迫上调基因和282个下调基因.然后使用MEME软件分析了盐胁迫响应基因的启动子,得到10个保守元件.通过显著性分布分析表明Motif_1\Motif_8\Motif_10显著分布于上调基因启动子中;Motif_1\Motif_10显著不分布于盐胁迫下调基因启动子中.Motif_1元件是G-box元件(ABRE(ABA Responsive Element)元件),大量分布于盐胁迫上调基因启动子中,广泛参与盐胁迫过程中ABA依赖的信号转导途径.Motif_8、Motif_10分别类似于ABRE元件和DRE(Dehydration-Responsive Element)元件,但由于和ABRE、DRE元件的保守序列不尽相同,Motif_8\Motif_10很有可能是新的盐胁迫响应元件.本研究对于研究拟南芥在盐胁迫应答过程中在转录水平上发生的调控过程具有重要帮助作用.     

毛果杨ZHD家族全基因组水平鉴定及在干旱胁迫下的表达分析

  目的  对毛果杨Populus trichocarpa ZHD (PtrZHD)家族进行生物信息学以及干旱胁迫下表达特性分析,为研究PtrZHD在干旱胁迫中的功能提供参考。  方法  利用生物信息学方法从全基因组水平鉴定出毛果杨ZHD家族全部成员,并对其进化、理化性质、基因结构、保守基序、启动子顺式作用元件和表达特性进行分析。  结果  毛果杨ZHD家族包括21个成员,可分为7个亚家族;有8对同源基因,且非同义替换率(K_a)/同义替换率(K_s)值远小于1。该家族成员理化性质存在差异,但其结构较为保守,均含有Motif 1;启动子区含有数量不等的激素和非生物胁迫响应元件,不同基因之间响应元件的种类存在差异。在毛果杨PtrZHDs中,分别有1、7和13个基因在根、茎和叶组织中具有偏好性表达特征;PtrZHD家族成员对干旱胁迫的响应具有组织和时间表达特异性,在根、茎和叶部组织中各成员的表达量不同,但随着干旱胁迫时间的增加均呈先上升后下降的趋势。  结论  PtrZHD家族基因对干旱胁迫有不同程度的响应,可调控毛果杨对干旱胁迫的应答。图6表2参27     

谷子抗旱相关蛋白激酶基因家族鉴定及表达分析

[目的]蛋白激酶是一类催化蛋白质磷酸化反应的酶,普遍存在于植物体中,参与调控植物生长发育和抗逆等多种生理反应。本文旨在探究谷子响应干旱胁迫与蛋白激酶之间的关系,为谷子抗旱品种的培育提供参考。[方法]运用生物信息学方法,分析了谷子蛋白激酶基因家族的35个抗旱相关蛋白激酶基因的系统进化关系、基因结构、保守基序、保守结构域、启动子顺式元件以及在干旱处理下和不同组织中基因表达水平。[结果]这35个谷子抗旱相关蛋白激酶基因分布于8条染色体上,被分为4个亚家族;多数亲缘关系较近的基因,其外显子-内含子结构、保守基序、保守结构域也较为相似,它们可能具有功能上的相似性;启动子元件分析发现,多数基因启动子区含有ABA响应元件(ABRE)和干旱诱导响应元件(MBS);组织特异性表达发现,SiPK20和SiPK25基因表现出显著的组织特异性表达模式,SiPK20在叶中表达量较高,SiPK25在根中表达量较高;干旱诱导基因表达分析显示,在抗旱品种勾勾母鸡咀中,干旱处理后SiPK1和SiPK4基因表达量显著上升,并且SiPK1、SiPK4启动子区域都含有较多的MBS元件,说明SiPK1和SiPK4极有可能参与谷子干旱胁迫响应,并且SiPK4在根中表达量较高。[结论]SiPK4可能通过调控谷子根部发育参与根部对干旱胁迫的应答反应,可作为抗旱相关的候选基因。     

水稻C端结合蛋白家族基因OsCtBP-A的克隆及表达分析

利用5′-RACE方法克隆了在水稻与白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo)互作过程中下调表达的水稻C端结合蛋白家族基因OsCtBP-A的全长序列。通过生物信息学方法分析了该基因及编码蛋白质的结构特征,OsCtBP-A由424氨基酸组成,N端具有2-Hacid_dh_C保守结构域,C端具有植物CtBPs家族特有的NLS和PEST基序,氨基酸序列与拟南芥和牵牛花CtBPs同源物的同源性为63%;基因启动子区推测具有ABA和SA应答调控元件。OsCtBP-A基因对不同信号分子应答的RTQ-PCR分析表明,水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯(ETH)和脱落酸(ABA)处理水稻后均能诱导该基因的转录表达,但诱导能力有所差异,其中ABA诱导活性最强。     

玉米ZmCPK9基因在非生物胁迫下的表达分析

【目的】钙依赖蛋白激酶(CPKs)是一类依赖于Ca~(2+)的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,仅在植物和部分低等生物中存在。Ca~(2+)作为第二信使,在植物生长发育和抗逆应答过程中起着重要作用。研究玉米Zm CPK9基因在幼苗期不同逆境胁迫下的动态表达,为分析该基因在玉米逆境应答中的功能和机制奠定基础。【方法】利用生物信息学方法,分析Zm CPK9基因序列特征,采用Real-time PCR技术分析Zm CPK9在干旱、低温、盐和ABA诱导下的表达特征。【结果】利用生物信息学方法从玉米基因组中鉴定出CPK基因,命名为ZmCPK9。序列分析表明Zm CPK9 c DNA序列长1 548 bp,编码515个氨基酸。生物信息学分析显示,在蛋白质序列和结构上该基因与其他物种CPK基因一样非常保守。Real-time PCR的结果表明,在干旱、低温、盐和ABA诱导下,Zm CPK9表达量均有所上调。【结论】Zm CPK9是玉米CPKs基因家族中一个新的成员,对干旱、低温、盐和ABA等非生物胁迫具有应答反应,推测Zm CPK9对植物防御非生物胁迫具有一定作用。     

杨树干旱胁迫响应转录因子的研究进展

转录因子是杨树干旱胁迫应答分子调控网络中的重要组成部分之一,通过特异性结合干旱响应相关基因启动子区的顺式作用元件,调控下游靶基因的转录表达,从而参与杨树干旱胁迫响应过程。杨树WRKY、NAC、bZIP、MYB和AP2/ERF是干旱胁迫响应分子机制研究中最主要的五大转录因子家族,每个家族拥有超过80个成员。本文简要介绍了杨树干旱胁迫转录组学研究进展,系统总结和概括了杨树这五类转录因子的结构特征与亚家族分类、调控下游靶基因表达的方式及其在参与调控干旱信号转导网络中的作用等方面的研究进展,并对存在的问题与未来研究进行展望,旨在深入了解杨树耐旱分子机理,为培育抗旱型杨树新品种提供参考。     

油棕脱落酸受体PYL基因家族的全基因组鉴定及表达分析

【目的】鉴定油棕（Elaeis guineensis）脱落酸（ABA）受体PYR/PYL/RCARs （PYL）基因家族成员,分析其表达特性,为探究ABA信号通路在油棕果肉成熟过程中的功能研究提供理论依据。【方法】以拟南芥和水稻的PYL蛋白氨基酸序列作为参考序列,通过BLASTp比对及保守结构域预测分析从油棕基因组中鉴定出PYL基因家族成员,利用生物信息学软件对其染色体定位、基因结构、启动子顺式作用元件及编码蛋白的理化性质、保守结构域、进化关系进行分析,并采用实时荧光定量PCR对PYL家族基因在不同组织、不同发育期果实及外源ABA处理下的表达特性进行检测。【结果】从油棕基因组中共鉴定出12个油棕PYL基因家族成员（EgPYL1~EgPYL112）,分布在8条染色体和1个Scaffolds上,含有1~3个外显子,开放阅读框（ORF）为564~765 bp,编码187~254个氨基酸,蛋白分子量为20.95~28.33 kD,等电点（pI）为5.26~7.95,不稳定指数为32.67~52.87,脂溶指数为73.87~87.60,总平均亲水性为-0.68~-0.17。12个PYL家族蛋白均含有特征结构域PYR/PYL/RCAR,分为3个亚族。EgPYL1和EgPYL6基因具有共线性,EgPYL4、EgPYL5、EgPYL9和EgPYL11基因具有共线性。EgPYLs基因的启动子上含有大量植物激素响应元件、逆境胁迫响应元件和光响应元件。EgPYLs基因在根、茎尖、叶、花和果肉中均有表达,但表达量差异较明显。EgPYL7、EgPYL8和EgPYL9基因的表达量随果肉成熟度增加逐渐升高,在23周达峰值。11个Eg PYLs基因均受外源ABA诱导表达。【结论】大多数PYL基因家族成员参与油棕对ABA的响应,且部分成员（如EgPYL7、EgPYL8和EgPYL9）在油棕果实发育中发挥重要的调控作用。     

马铃薯3个StSnRK2基因启动子的克隆与序列分析

【目的】克隆马铃薯StSnRK2.1、StSnRK2.2和StSnRK2.4基因的启动子片段,为马铃薯StSnRK2基因表达与功能研究奠定基础.【方法】以马铃薯(Solanum tuberosum L.)品种‘陇薯3号’为试材,采用PCR技术从马铃薯基因组DNA中分离得到了3个SnRK2基因启动子.通过PCR扩增,酶切鉴定,测序,利用PlantCARE和PLACE在线分析软件预测分析所得序列.【结果】获得与预期大小基本一致的目的片段,分别为StSnRK2.1基因启动子、StSnRK2.2基因启动子和StSnRK2.4基因启动子.分析软件预测分析表明,启动子调控序列中除含有典型的真核生物核心启动子外,还含有多个CAAT-box、TATA-box等启动子元件,以及相应的ABRE、DRE/CRT、LTRE等与激素应答、逆境胁迫相关的顺式作用元件.【结论】这些结果预示StSnRK2.1、StSnRK2.2和StSnRK2.4基因调控机制相对复杂,可能参与了ABA,干旱,盐等多种逆境胁迫信号的转导过程,在马铃薯逆境胁迫应答过程中具有重要的功能作用.     

玉米ZmSNAC13等位变异对抗旱性的调控研究

NAC家族转录因子是植物特有的,在植物的生长发育、胁迫应答和激素调节等方面具有重要的生物学功能。前期根据干旱胁迫处理RNA-Seq筛选到NAC转录因子基因ZmSNAC13。为了探究ZmSNAC13在干旱胁迫响应中的作用,以耐旱性不同的玉米自交系B73（干旱敏感）和Qi319（耐旱）为材料,进行荧光定量PCR分析,发现干旱处理后ZmSNAC13在2个材料根中均下调表达,干旱处理12 d后在茎中均上调表达,Qi319干旱处理12 d后在叶中上调表达,而B73干旱处理8和10 d后在叶中下调表达,表明ZmSNAC13基因响应干旱胁迫。利用双荧光素酶融合报告载体分析ABA处理对ZmSNAC13基因启动子活性的影响,结果表明,ABA处理下Qi319的ZmSNAC13启动子活性显著高于B73,在Qi319的ZmSNAC13基因5’-UTR区发现9个能够提高启动子活性的高度连锁变异,并且干旱处理12 d时, Qi319叶中ZmSNAC13的表达量高于B73,因此推测干旱胁迫下ZmSNAC13基因5’-UTR区遗传等位变异通过影响启动子活性进而控制基因的表达水平,最终调控玉米对干旱胁迫的适应性。上述结果为解析玉米抗旱的遗传机制奠定了基础。     

水稻OsGRAS1启动子的克隆及多样性分析

通过克隆水稻抗旱QTL区段内抗旱相关基因OsGRAS1上游1 332 bp的调控元件启动子序列,并对其进行顺式作用元件分析发现:该序列具有典型的真核生物核心启动子结构,并且包含多个与干旱胁迫相关和激素应答的调控元件;根据该序列在93-11和日本晴的同源序列间存在的插入缺失位点设计引物,在120份稻种资源中对OsGRAS1启动子片段进行序列多样性分析发现,存在4种不同类型的启动子序列,其中Ⅳ型OsGRAS1启动子比其他3种类型多了3个顺式作用元件:MYB1LEPR,GTICORE,NTBBF1ARROLB.每种序列类型选取1份材料,进行冷、盐、外源ABA和PEG胁迫处理,分析其下游基因OsGRAS1的表达水平.结果表明:Ⅳ型材料的启动子对ABA和PEG处理较其他3种类型更敏感.     

水稻OsDDM1a和OsDDM1b基因应答非生物胁迫的表达特性分析

环境胁迫会引起植物基因组DNA甲基化水平改变和组蛋白修饰变化,而DNA甲基化与组蛋白修饰在基因表达的调控过程中具有重要作用。分析表明水稻OsDDM1a和OsDDM1b基因属于SWI2/SNF2家族,编码染色质重塑酶,氨基酸序列的相似性达92.82%。OsDDM1a和OsDDM1b的表达均受ABA、NaCl、低温和干旱胁迫诱导,且这两个基因的启动子序列中均含有ABRE、DRE、MYC和WRKY等应答不同胁迫信号的元件。因此,推测水稻在感受外界刺激后可能通过激活OsDDM1a和OsDDM1b的表达,使水稻基因组DNA发生相应的甲基化修饰,进而调控相关基因的表达,表明OsDDM1a和OsDDM1b在水稻胁迫应答反应中发挥重要的作用。     

谷子XTH基因家族与抗旱相关基因的分析

[目的]木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶(XTH)属于糖苷水解酶GH16家族,其家族成员可能在植物响应逆境胁迫的过程中发挥重要作用,为深入挖掘谷子抗旱基因,进而选育谷子抗逆新品种,[方法]本研究利用生物信息学手段,对谷子XTH基因家族进行了分析。[结果]从谷子基因组数据库中鉴定出16个XTH基因。结构分析表明:SiXTH家族成员在基因结构及编码区序列上较为保守,含1~3个内含子;谷子XTH蛋白含有XTH家族典型的保守基序DEIDFEFLG;预测SiXTH基因家族成员在启动子区域含有响应逆境胁迫的顺式作用元件。在干旱胁迫下,通过比较两个谷子品种勾勾母鸡咀及晋汾16在干旱胁迫下基因的相对表达水平,我们发现了3个上调表达和1个下调表达的SiXTH基因。[结论]因此推测,同一类基因其基因结构及蛋白结构域相似,且XTH基因家族在谷子应答干旱胁迫的过程中起一定的作用,同时本研究也为深入探究XTH基因家族成员的功能奠定了一定的基础。     

玉米CPK基因家族鉴定及干旱胁迫下表达分析

干旱严重影响玉米的产量和品质。钙依赖性蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase, CPK)是一种Ca2+结合蛋白，在植物非生物胁迫应答方面发挥重要作用。本研究对玉米37个ZmCPKs的染色体定位、系统进化、基因结构、保守结构域和理化性质进行了分析。其中，36个ZmCPK基因不均匀的分布在9条染色体上；通过系统进化分析将其分为4个亚组，同一亚组成员具有相似的基因结构和保守结构域；ZmCPKs启动子分析表明，ZmCPKs启动子区含有大量的逆境响应元件，包括MBS、DRE和ABRE等；qTeller数据库和转录组数据分析表明，ZmCPKs基因家族成员在营养生长和生殖生长期均有表达，其中，26个基因在干旱胁迫下表达量发生变化。综合启动子元件及转录组数据，共筛选出9个基因作为干旱响应候选基因。进一步qRT-PCR验证显示，这9个基因均受PEG诱导表达。本研究可为玉米耐旱性的遗传改良提供优异的基因资源。