细口杯环线虫形态学和分子特征分析

为探讨细口杯环线虫(Cylicocyclus leptostomum)的分类地位和系统发育关系,本试验利用数码显微镜对细口杯环线虫进行了形态观察,运用PCR扩增其核糖体DNA内部转录间隔区(rDNA-ITS)序列,并从GenBank中下载12种圆线虫的ITS序列,以马圆形线虫(Strongylus equinus)为外群,运用最大似然法(maximum likelihood,ML)构建系统发育树。结果显示,细口杯环线虫中等大小,口囊呈圆柱形,宽度大于深度,口囊底部有小齿;口囊壁前端薄,后端基部有明显的环箍形增厚;外叶冠由20～24个小叶组成,内叶冠由50～60个小叶组成;食道漏斗较小;雄虫生殖锥较长,呈圆锥形;雌虫尾部直,尾尖呈指形;所测ITS序列总长度为837bp,其中ITS1长366bp,5.8S长153bp,ITS2长318bp;ITS1的GC含量(46.0%)明显高于ITS2(39.8%);经BLAST同源性比对分析,本研究线虫ITS序列与GenBank上登录的同种线虫序列(登录号:AJ004849、Y08587)同源性达99.85%,与阿氏杯环线虫的同源性达99.0%,与杯环属内其他线虫的同源性仅为93.33%～98.45%;ITS序列种间差异远大于种内差异;系统进化分析显示,细口杯环线虫与阿氏杯环线虫的亲缘关系较近,而与杯环属内其他线虫的亲缘关系相对较远。综上所述,ITS序列可作为鉴定寄生线虫的分子遗传标记,证实所采标本是细口杯环线虫,并首次在国内报道了细口杯环线虫的ITS序列,为该线虫的进一步研究奠定基础。     

卡拉干斯齿线虫的形态及ITS和COⅠ序列分析

利用光学显微镜和PCR扩增技术,对采自河南省马肠道内的卡拉干斯齿线虫(Skrjabinodentus caragandicus)进行形态学观察和分子序列测定。结果表明,卡拉干斯齿线虫中等大小,口囊壁呈"S"状,前端极度膨大,厚度10μm~12μm,后端稍薄,约4μm~6μm,外叶冠由8个长而宽的小叶组成,内叶冠由16个~18个短而宽的小叶组成,食道漏斗发达;雄虫生殖锥长337μm,引器长245μm;所测核糖体DNA(rDNA)内转录间隔区(ITS)及5.8S片段长度为853bp,其中ITS1长369bp,ITS2长331bp,ITS1区的GC含量(47.2%)明显高于ITS2区(40.7%);线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因长度为393bp,A、T、G、C碱基含量分别为25.2%、42.7%、21.4%、10.7%。卡拉干斯齿线虫在河南省属首次报道,为河南省新记录种。     

马属动物盅口亚科3种肠道线虫形态的扫描电镜观察

利用扫描电子显微镜对采自乌克兰的马属动物消化道内杯环属的细口杯环线虫(Cylicocyclus leptostomum)、外射杯环线虫(Cylicocyclus ultrajectinus)和冠环属的箭状冠环线虫(Coronocyclus sagittatus)的体表形态进行观察。在扫描电子显微镜下，虫体外叶冠的形状和数目、雄虫生殖锥和雌虫尾部等结构辨识清晰，立体感强。细口杯环线虫外叶冠细长，小叶状，22枚；雄虫生殖锥腹唇锥形，有丘状突，背唇有囊泡状附属物和指状突；雌虫尾长176μm,末端急剧变细。外射杯环线虫外叶冠宽而长，12枚，内叶冠中有12枚、较长、随外叶冠伸出口囊、位于外叶冠中间；雄虫生殖锥发达，腹唇锥形，背唇两侧有长形突起和泡状附属物；雌虫尾长约386μm。箭状冠环线虫外叶冠细小，片状，20枚；雌虫尾尖锥形逐渐变细，长约130μm。研究结果为上述3种线虫的分类鉴定提供了更为精确的形态学依据。     

3种冠环线虫rDNA-ITS的PCR扩增及序列分析

本试验利用PCR扩增3种冠环线虫5个样品的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)及5.8S片段,将PCR扩增产物纯化后直接进行序列测定和分析。序列比对和分析结果显示,所测样品ITS1-5.8S-ITS2的长度范围为748~843 bp,总变异位点(包括gaps)119个,简约信息位点18个;其中ITS1和ITS2的长度范围分别为367~370 bp和228~320 bp,变异位点分别为14个和105个,简约信息位点均为9个。所有测试样品的5.8S片段完全相同,长度为153 bp。5条序列ITS1区的G+C含量(48.0%~48.5%)明显高于ITS2区(37.7%~40.3%)。通过序列两两比对,3种冠环线虫ITS1和ITS2的种间差异性分别为1.9%~3.5%和5.6%~31.8%;而种内差异性分别为0~0.5%和0~0.9%。并且所测序列与GenBank中已知序列的同源性为99.07%~99.41%。本研究认为,ITS序列可以作为冠环线虫种类鉴定的分子标记。     

黑龙江与广州颚口线虫幼虫分离株的形态学观察及其分子鉴定

本研究从来自黑龙江及广州地区的泥鳅中分离到10条颚口线虫幼虫,采用光学显微镜观察幼虫的形态特征,并对虫体的ITS2与CO1基因进行扩增测序、系统发育分析以鉴定虫种。结果显示10条颚口线虫幼虫头球均有3环小钩,其形态学特征与日本颚口线虫(Gnathostoma nipponicum)第3期幼虫相符。序列分析结果显示与GenBank中登录的日本颚口线虫ITS2和CO1基因的同源性分别为100%和99%。邻位连接法构建的50%一致树也均与日本颚口线虫处于同一分支。表明从黑龙江及广州地区泥鳅中分离的颚口线虫幼虫为日本颚口线虫幼虫,首次证明了中国存在日本颚口线虫。     

犬体内类圆线虫的分子鉴定

为了鉴定来自斗牛犬体内的类圆线虫种类,试验提取了虫体的总DNA,对核糖体内转录间隔区(ITS)和线粒体细胞色素C氧化酶第Ⅰ亚基(cox1)部分序列进行扩增、克隆、同源性分析及构建系统进化树。结果表明:rDNA ITS序列全长为580 bp,其中ITS1序列长度为216 bp;得到的cox1序列长度为961 bp;ITS1和cox1序列均与粪类圆线虫同源性最高,分别为99.5%和99.8%;基于ITS1和cox1序列与Gen Bank中相关线虫进行遗传进化分析,类圆属线虫处在一个大的进化分支上,亲缘关系最近。说明采自病犬体内的线虫为粪类圆线虫。     

两种鞭虫ITS序列的比较与进化分析

对猪鞭虫(Trichuris suis)和无色鞭虫(Trichuris discolor)的内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列进行扩增、克隆和比较分析;以ITS序列为基因标记采取ML法构建系统发生树,确定它们间的亲缘关系。结果猪鞭虫ITS序列长1 397 bp,其中ITS1和ITS2序列长度分别为658 bp和585 bp。无色鞭虫ITS序列长1 404 bp,其中ITS1和ITS2序列长度分别为786 bp和455 bp,两者的ITS1与ITS2序列的同源性分别为55.8%和65.0%;进化分析显示两种鞭虫处于不同分支上,分别与Gen Bank上发表猪鞭虫和无色鞭虫序列聚集在一起,显示两者亲缘关系较远。     

进境太平洋鳕鱼寄生的异尖科线虫rDNA-ITS 序列的PCR扩增及分析

以日本进境的冻太平洋鳕鱼体内分离出的异尖科线虫为研究对象,采用寄生虫通用引物NC5和NC2扩增其核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)序列,进行克隆、转化、测序和序列分析,并对样品进行分子鉴定。结果表明,扩增的异尖科线虫样品的ITS序列片段大小为906 bp,包含部分的18S、28S及全部的ITS1(353 bp)、5.8S(157 bp)和ITS2(299 bp)序列,ITS1和ITS2序列与GenBank登录的伪新地蛔线虫(Pseudoterranova decipiens)同源性均为在99.7%以上,与其他线虫的相似性较低。由ITS1和ITS2序列构建的系统进化树可知,从鳕鱼中分离到的线虫ITS1和ITS2均与伪新地蛔线虫处于同一分支。本研究结果为异尖科线虫种属的确定及进一步的分子生物学研究奠定基础。     

蛇钩口线虫长沙分离株ITS基因的克隆及序列分析

为研究蛇钩口线虫长沙分离株的核糖体DNA (rDNA)内转录间隔区(ITS)序列的遗传变异情况,并利用ITS序列构建蛇钩口线虫与其它线虫的种群遗传关系,本研究利用PCR扩增蛇钩口线虫rDNA的ITS片段,并克隆至pGEM-T载体中进行序列测定及分析.结果显示,长沙市各分离株的ITS序列长度均为734 bp,与其它线虫的同源性均低于83.9％,而与十二指肠钩口线虫的同源性较高.本研究为蛇钩口线虫的分类鉴定以及进一步的分子流行病学调查和群体遗传研究奠定了基础.     

一种异尖科线虫rDNA-ITS序列的PCR扩增及分析

以日本进境的冻鳕鱼体内分离出的异尖科线虫为研究对象,用保守引物PCR扩增其核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)和5.8S序列,并进行克隆、转化和序列分析,对样品进行分子鉴定。结果获得2个异尖科线虫样品的ITS及5.8 S rDNA序列,总长为991 bp,样品间序列相似性为99.0%。将序列与GenBank公布灰海鳗对盲囊线虫(Contracaecum muraenesoxi)的相关序列进行比较分析,结果显示与C.muraenesoxi的ITS1、5.8S和ITS2序列相似性高,分别98.0%～98.4%、100%和97.0%～98.0%,表明冻鳕鱼中分离的异尖科线虫属于C.muraenesoxi。     

猪巨细胞病毒福建株DPOL基因的克隆及序列分析

为了明确猪巨细胞病毒（porcine cytomegalovirus,PCMV）福建株（PCMV-FJ01株）DPOL基因特征,本研究根据GenBank数据库中PCMV DPOL基因序列特征,利用引物设计软件Oligo 7.0设计针对DPOL基因的引物,以PCMV-FJ01株核酸DNA为模板,对其进行分段PCR扩增。将分段扩增的产物经胶回收试剂盒回收后进行克隆测序,对测序结果进行拼接后获得PCMV-FJ01株DPOL基因序列,并进行生物信息学分析。结果表明,PCMV-FJ01株DPOL基因全长为3 021 bp,编码1 006个氨基酸;其与GenBank中的PCMV分离株DPOL基因核苷酸和氨基酸同源性分别在98.7%和99.1%以上。遗传进化分析发现,相对于巨细胞病毒属其他种代表株,PCMV分离株DPOL基因在遗传进化上和玫瑰疱病毒属代表株更近。建议根据PCMV DPOL基因遗传进化特征,将其划归为玫瑰疱病毒属的一个病毒新种--猪玫瑰疹病毒（porcine roseolovirus）。     

Cloning and Sequencing Analysis of DPOL Gene of Porcine Cytomegalovirus

In order to know the DPOL gene characterization of porcine cytomegalovirus (PCMV) (PCMV-FJ01 strain),three pairs of specific primer were designed by Oligo 7.0 software based on comparison the characterization of DPOL gene retrieved from GenBank.The target DPOL gene fragments were amplified using PCR methods with the strain PCMV-FJ01 genomic DNA. The target PCR fragments were cloned and sequenced. The assembly sequences were bioinformatics analysis. The DPOL gene of PCMV-FJ01 strain was 3 021 bp in length, coding 1 006 amino acids. The results showed that the homology of the nucleotide sequence and amino acid sequence were above 98.7% and 99.1%, respectively. Phylogenetic analysis revealed that the PCMV was closer with genus Roseolovirus rather than genus Cytomegalovirus. The results suggested that PCMV should be new species under genus Roseolovirus base on the phylogenetic relationship.     

西北部分地区猪蛔虫rDNAITS基因序列测定及遗传变异分析

为了摸清西北部分地区猪蛔虫内转录间隔区(ITS)的遗传变异特点,扩增了猪蛔虫ITS基因,进行测序,依据GenBank公布的ITS序列将测序结果截为ITS1、5.8S及ITS2三段,分析比对各段序列的差异性。结果显示,所有样品ITS序列长约1 000bp,其中ITS1、5.8S和ITS2的长度分别为450bp~453bp、159bp、272bp,种内差异分别为0~0.2%、0、0。基于ITS1的种系发育分析表明,23个猪蛔虫样品均位于同一分支,而与贝蛔属蛔虫分属两个不同分支。ITS1序列不能作为区分西北不同地区猪蛔虫的种内分子标记,但可以作为区分蛔属蛔虫与贝蛔属蛔虫的种间分子标记,研究结果为猪蛔虫的鉴定和分子流行病学调查提供了基础资料。     

钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫ITS2序列测定及其种系发育分析

本试验将从犬猫肠道中分离的钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫用盐酸卡红染色后观察其形态学特征;PCR扩增其ITS2基因序列并测序,并将测序结果与GenBank同属异形科的多棘单睾吸虫和横川后殖吸虫序列进行比对;应用Mega 6.05软件采用邻位相连法构建种系发育树进行分析。盐酸卡红染色后显示,钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫各形态学特征符合经典的分类学描述。PCR测序后获得钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫ITS2序列长度分别为295和297 bp,G+C含量分别为49.5%(146/295)和54.2%(161/297)。提交至GenBank后获得登录号分别为钩棘单睾吸虫KJ137221~KJ137223,KP165437~KP165439;扇棘单睾吸虫KP165440。序列比对结果显示,钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫种内差异性为0,4种异形吸虫种间差异为15.2%~28.9%。基于ITS2序列建立的种系发育树显示钩棘单睾吸虫和扇棘单睾吸虫构成自展值为78%的拓扑分支。     

Molecular identification of Candida parapsilosis from crop mucosa in a cockatiel.

A 2-month-old cockatiel was evaluated for diarrhea, dyspnea, and death. Histologic examination of lesions in the crop mucosa revealed hyperkeratosis and the presence of blastoconidia and hyphae. Positive immunohistochemical staining of the organisms was achieved with an antibody directed against Candida spp. Polymerase chain reaction amplification of DNA from crop lesion material with internal transcribed spacer 2 (ITS2) primers yielded fragments of approximately 300 bp, which demonstrated 95% DNA homology with the corresponding sequence from a strain of Candida parapsilosis deposited in the GenBank data base. The Candida species in the lesion of the crop mucosa was therefore identified by DNA sequence analysis as C. parapsilosis.     

白鹈鹕体内对盲囊线虫种类的鉴定及其ITS序列分析

为了鉴定从广东某地圈养的白鹈鹕体内的线虫种类,2个样本通过形态学观察初步鉴定为对盲囊线虫后,对虫体核糖体DNA（rDNA）内转录间隔区ITS-1、ITS-2及5.8SrDNA序列进行扩增和测序,并与GenBankTM公布的序列进行比对,构建系统发育树分析,确定其种类.结果显示,白鹈鹕体内线虫符合对盲囊线虫的形态学特征,其ITS-1序列长度为463 bp,与Contracaecum sp.（GenBankTM登录号：KF990496.1）ITS-1的序列相似性分别为98.9％、99.8％;ITS-2序列长度分别为288-289 bp,与C.bancrofii（GenBankTM登录号：FM177887.1）的ITS-2序列的相似性分别为96％、95％;5.8SrDNA序列长度为157 bp.通过以ITS-1序列为分子标记的系统发育树分析,白鹈鹕体内线虫与C.bancrofti属同一分支,应为C.bancrofii.形态学鉴定方法结合ITS序列分析可以准确鉴定白鹈鹕体内线虫的种类,为其他线虫的快速准确鉴定提供参考.     

牦牛心脏脂肪酸结合蛋白基因的分子克隆和进化分析

对牦牛心脏脂肪酸结合蛋白（H-FABP）基因进行了克隆测序，并与GenBank中9个物种相应基因编码区核苷酸序列进行了比对分析，在此基础上采用邻接法、最大简约法和最小进化法构建了牦牛与其它物种间分子系统进化树。结果表明，牦牛H-FABP基因由4个外显子和3个内含子组成，外显子1、外显子2、外显子3和外显子4大小分别为73、173、102和54bp，内含子1、内含子2和内含子3大小分别为3460、1892和1495bp。CDS序列全长为402bp，前体氨基酸数为133个。不同物种间在该基因核苷酸序列上有较高的保守性。牦牛与普通牛、绵羊、山羊、猪、人、大鼠、小鼠、鸡、斑马鱼各物种在H-FABP基因编码区核苷酸序列上同源性大小分别为99．8％、97．8％、97．0％、92．8％、88．8％、83．3％、83．1％、76．4％、68．7％。通过邻接法、最大简约法和最小进化法用H-FABP基因编码区核苷酸序列构建的物种间分子系统进化树，结果表明，3种方法构建的物种间分子系统进化树基本一致。系统树总体分为两支，斑马鱼为独立的一支，而牦牛与其它物种为另一大分支。牦牛与普通牛、绵羊与山羊先分别聚在一起，然后再聚为一类；后与猪、人依次聚为一类。小鼠和大鼠先聚为一类，再与人和其它物种聚类，然后再与鸡聚为一类。该系统聚类结果与动物学分类一致，表明H-FABP基因适合于构建不同物种间的系统进化树。