非培养方法解析烟草根部内生细菌的群落结构

为了解烟草根部内生细菌多样性,采用改进的CTAB法提取烟草根部总DNA,利用细菌16 S rDNA基因通用引物对烟草根总DNA进行16 S rDNA扩增,构建烟草根部内生细菌16 S rDNA克隆文库;挑取具有不同酶切谱型的克隆进行测序、比对并构建16 S rDNA基因系统发育树。构建的烟草根部内生细菌16 S rDNA克隆文库中,155个克隆分属于36个不同的分类单元,Blast结果表明,大部分克隆与已知细菌的16 S rDNA序列相似性较高,分别属于变形菌门(Proteobacteria)的Alpha、Gamma、Beta亚群,放线菌门(Actinobacteria),拟杆菌门(Bacteroidetes),厚壁菌门(Fir-micutes)中的肠杆菌属(Enterobacter)、不动杆菌属(Acinetobacter)、寡养食单胞菌属(Stenotrophomonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜甲基菌属(Methylobacillus)、食酸菌属(Acidovorax)、芽孢杆菌属(Bacillus)等16个属,其中13.5%的克隆序列与非可培养细菌(Uncultured bacteria)的相似性在93%～99%之间,假单胞菌属细菌是烟草根部内生细菌的优势种群。这些研究结果说明烟草根部存在较为丰富的内生细菌系统发育多样性,并且潜藏着未知的内生细菌资源。     

棉花黄萎菌拮抗菌BDT-25的鉴定及抗菌蛋白产生条件研究

拮抗细菌BDT_25是从根际土壤中分离到的一株对棉花黄萎病菌具有强烈抑制作用的芽孢杆菌。经生理生化特征的鉴定,证明BDT_25菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。此外,该菌株还对棉花枯萎病菌、棉花立枯病菌等10种其他病原真菌的生长具有显著的抑制作用,为一株广谱拮抗细菌菌株。通过对BDT_25菌株培养条件的研究发现,采用NB液体培养基,28℃,170 r/min培养48 h所得发酵液对棉花黄萎病菌的抑制作用最强。其发酵液经硫酸铵沉淀粗提到对棉花黄萎病菌具有抑制作用的提取物,进一步实验表明,该拮抗物质对热和多种蛋白酶敏感,证实其为抗菌蛋白。     

海南辣椒尖孢镰刀菌拮抗内生细菌的分离与鉴定

为了获得对辣椒尖孢镰刀菌具有较好防治效果的内生细菌,课题组于2022年1～3月份在海口、定安、澄迈、临高和陵水等海南辣椒主产区采样,并从健康辣椒样品中分离获得内生细菌192株,其中39株对辣椒尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) CMTT4-1有拮抗作用,分别来源于根系(23株)、茎秆(2株)、叶片(8株)和果实(6株),有拮抗作用菌株占比20.31%,抑菌率为10.68%～59.02%。通过形态学和16S rDNA序列测定及同源性分析,初步鉴定芽孢杆菌属(Bacillus spp.)细菌36株、短杆菌属(Brevibacterium spp.) 1株、农杆菌属(Agrobacterium spp.) 1株和假单胞菌属(Pseudomonas spp.) 1株。研究结果为辣椒枯萎病的生物防治提供了菌株来源。     

番茄内生细菌种群动态分析及拮抗菌株的筛选

摘要：采用研磨组织稀释分离法对3个种植地区的番茄内生细菌的种群分布、数量变化规律进行了初步探讨。共分离、纯化得到内生细菌374株,经形态及理化特征鉴定,分属10个不同的属,13个种。其中假单孢菌属Pseudomonas sp.,黄单孢菌属Xanthomonas sp.;肠杆菌属Entenobacter sp.和芽孢杆菌属Bacillus sp.为优势种群。内生细菌在番茄植株种群数量从0.21x104 到13.82x104 cfu.g -1鲜重之间,但不同品种、组织、生育期及种植地,内生细菌的种群和数量各不相同,各组织中内生细菌的种群及数量根中最多,其次是茎和叶,成株期内生细菌无论种类和数量都明显高于苗期。采用平板对峙法从分离的内生细菌中筛选出对番茄灰霉病菌具有体外拮抗活性的菌株32个,占菌株总数的8.56%; 25个菌株对叶霉病菌有抑制作用,占菌株总数的6.68%;对灰霉病菌和叶霉病菌都具有拮抗作用的菌株20个,占菌株总数的5.35%。对灰霉病菌有强拮抗作用的菌株12个,对叶霉病菌有强拮抗作用的菌株仅1个,其中芽孢杆菌是主要的类群。     

柑橘皮内生细菌分离及柑橘青霉病菌拮抗菌筛选研究

柑橘青霉病是柑橘贮藏期的主要病害,为利用拮抗内生菌进行生物防治,本研究选取3个品种柑橘的橘皮,采用研磨液培养法分离纯化得到26株内生细菌。通过对峙培养法,发现5株内生细菌对柑橘青霉病菌有明显拮抗作用,占菌株总数的19.2%。对这5株细菌进行初步鉴定,分属于气芽孢杆菌属（Aerobacillus sp.）、芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、气单胞菌属（Aeromonas spp.）、假单胞杆菌属（Pseudomonas spp.）和黄单胞杆菌属（Xanthomonas spp.）5个属。不同的柑橘品种橘皮内的内生拮抗细菌的出现频次不同。抑菌结果表明,培养3天时,H-3抑菌圈直径最大,达到了15.3 mm,H-18抑菌圈最小,只有5.6mm;4天时,各抑菌圈直径均有缩小,但缩小幅度不大;5天时H-3拮抗作用仍十分明显,抑菌圈直径为10.3 mm。根据H-3的菌体形态特征、生理生化测定及其16S rDNA序列分析,鉴定该菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,该菌的发现对柑橘青霉病的生物防治有较好的应用价值。     

哈茨木霉TH-1对棉花枯萎病菌和黄萎病菌的拮抗机制研究

采用平板对峙法、杯碟法和显微观察法研究了哈茨木霉(Trichoderma harzianum)TH-1菌株对棉花枯萎病菌和黄萎病菌的拮抗作用及其机制.结果表明,哈茨木霉TH-1菌株与病菌对峙培养以及在培养基中加入TH-1菌株孢子悬浮液,对供试棉花枯、黄萎病菌均有较好的抑制效果;但TH-1菌株的代谢液对棉花黄萎病菌的抑制效果较差,对枯萎病菌几乎无抑制效果;显微观察发现,TH-1菌丝与枯、黄萎病菌的菌丝平行生长、产生附着胞结构附着于病菌菌丝上,或穿透病菌菌丝使病菌菌丝发生裂解.上述结果说明,哈茨木霉TH-1对供试棉花枯、黄萎病菌的拮抗机制主要是营养和空间竞争及重寄生作用.     

蝴蝶兰根内生细菌的分离及可分泌IAA细菌的筛选

为从蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis)根部分离出可分泌吲哚乙酸(Indole-3-acetic acid,IAA)的内生细菌,通过探讨蝴蝶兰根部表面消毒的最佳条件,采用分离培养法、生理生化实验和16S rDNA分析,对蝴蝶兰根部出内生细菌进行研究。结果表明,NA培养基分离出的6株细菌分别属于短杆菌属(Brevibacterium)、伯克氏菌属(Burkholderia)、Dyella和类芽胞杆菌(Paenibacillus);R2A培养基分离出的20株细菌分别属于伯克氏菌属(Burkholderia)和Dyella;分离获得的26株内生细菌中,具有分泌IAA的功能有23株,占分离总菌数的88.5%。综合来看,蝴蝶兰根中存在可分泌IAA不同种属的内生细菌,为进一步研究内生细菌与蝴蝶兰植物之间的相互作用提供了菌种资源。     

重病田和无病田棉花根组织中细菌群落结构的差异

为了研究黄萎病菌侵染条件下内生细菌群落结构多样性变化,以不同时期健康棉株和感染黄萎病菌(Verticillium dahliae)的棉株根部组织为材料,提取样品总DNA,扩增内生细菌16S r DNA的V3可变区,将扩增产物进行变性梯度凝胶电泳分析,并对21个优势条带进行切胶回收、克隆测序,构建系统发育树。结果表明:不同时期发病棉株和健康棉株样品可以聚成2大类,一是苗期和蕾期的根部样品,二是初花期和结铃期的根部样品;感染黄萎病棉株内生细菌种类多样性下降;BLAST比对结果发现21个克隆序列与Gen Bank数据库中已知16S r DNA基因序列同源性很高(99%~100%),绝大多数属于变形菌门(Proteobacteria),占总克隆序列的80.95%,其他不可培养细菌占19.05%。说明黄萎病菌的侵染能明显影响内生细菌群落结构多样性。     

濒危药用植物沙冬青内生真菌分离及其抑菌活性初步研究

为探明濒危药用植物沙冬青内生真菌资源的多样性及其抑菌活性特征,通过组织块法对内生真菌进行了分离,并选择小麦全蚀病菌、枸杞黑果病菌、番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、黄瓜立枯病菌5种植物病原真菌和枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌4种细菌作为指示菌,采用对峙法和改进的菌块法测定抑菌活性。结果显示,从沙冬青不同组织器官中分离出41株内生真菌,根部最多,其次为叶部,茎部最少,经形态学初步分类鉴定归于5个目,6个科,19个属;有31株菌对2种或多种指示菌有不同程度的抑制作用,占菌株总数的75.6%,15株内生真菌对1种或多种供试细菌指示菌具有不同程度的抑制作用,占分离菌株总数的36.6%,其中5株内生真菌分别对4种植物病原真菌指示菌具有明显的抑制作用,占菌株总数的12.2%,8株内生真菌对1种供试细菌指示菌有明显的抑制作用,占分离菌株总数的19.5%, 4株内生真菌菌株即对供试植物病原真菌指示菌又对供试细菌指示菌有明显抑制作用, 抑菌范围宽,属于青霉属、束丝菌属、茎叶核菌属。濒危药用植物沙冬青具有丰富的内生真菌资源,其开发和利用具有重要的生态学意义和经济价值。     

四个玉米自交系根系内生细菌的分离和鉴定

对4个玉米自交系(PH4CV、PH6WC、郑58和昌7-2)根系中的内生细菌进行分离和鉴定,为获得有益微生物资源奠定基础。通过形态学观察、生理生化特征鉴定及16S r DNA基因序列同源性分析和构建系统发育树等方法对分离菌株进行生物学鉴定,以确定其种属。共分离到23株内生细菌,鉴定为6个属,包括芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas sp.)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、贪噬菌属(Variovorax sp.)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.),其中优势属为芽孢杆菌属。4个玉米自交系内生细菌的种类不同,细菌种类由多到少依次是PH6WC、郑58、PH4CV和昌7-2。通过对不同玉米自交系内生细菌的比较分析,发现内生细菌的种类和数量与玉米基因型相关。     

棉花黄萎病拮抗细菌DS45-2菌株在土壤和棉花根内的定殖

通过盆栽试验,对棉花黄萎病拮抗细菌DS45-2菌株在土壤和棉花根际、根内的定殖情况进行了分析。结果表明,在自然条件下,拮抗细菌DS45-2菌株能够在土壤及棉花根际、根内定殖。拮抗菌株DS45-2施到土壤中后的45d内,其定殖数量在开始25d内显著下降,但随后下降缓慢并逐渐趋于稳定,维持在106个·g-1土左右。接菌后45d,DS45-2在棉花根内的定殖菌量达2.35×104个·g-1根,在棉花根际的定殖菌量达97.4×106个·g-1土,且重新分离出的拮抗菌株保持较高的拮抗活性。DS45-2菌株在灭菌土中的定殖数量高于自然土中的数量。随土层深度的增加,定殖菌量呈下降趋势,但变化不明显。     

连作对棉田土壤枯、黄萎病菌数量及细菌群落的影响

采用选择培养法测定新疆库尔勒不同连作年限棉田土壤枯、黄萎病病菌数量的变化,运用PCR-DGGE(Polymerase chain reaction-denatured gradient gel electrophoresis)技术分析棉花连作对土壤细菌群落结构和多样性的影响。结果表明,不同连作年限棉田的枯萎病菌和黄萎病菌量具有相似的变化特征,即在5~20年连作年限内,土壤中病原菌量随着连作年限的延长而增加,20年连作土壤病原菌数量达到最高峰;连作超过20年,土壤菌源数量开始下降。不同连作年限棉田土壤中枯、黄萎病病原菌的数量与发病株率呈显著正相关关系。连作棉田土壤细菌群落的DGGE图谱分析显示,连作棉田土壤细菌种群的组成、结构、丰富度均发生变化。连作5~40年的棉田土壤细菌种群Shannon-Wiener多样性指数(H')、均匀度(EH′)和丰富度(S)指数均降低,且连作年限越长降低越突出。     

Isolation and Characterization of Endophytic Bacillus methylotrophicus LH-L3 Antagonist of Cotton Verticillium Wilt

The aim of this study is to obtain endophytic Bacillus with control effect on cotton Verticillium wilt. [Method] The cotton tissue grinding liquid was heated at 80 ℃, and spread onto the Luria-Bertani ager medium. The strains with better inhibitory effects on Verticillium dahliae Vd084, a strain with strong pathogenicity, was identified by the morphology, physiological and biochemical traits as well as 16S rRNA, gyrB and rpoB sequences, and its control effect on cotton Verticillium wilt was determined by pot experiments. [Result] 61 similar Bacillus strains were isolated from cotton plants. Among them, 17 strains could inhibit Verticillium dahliae Vd084. A strain named LH-L3 with a relatively higher antagonistic activity and a broad inhibition spectrum was obtained in the second screening. LH-L3 was classified into Bacillus methylotrophicus. Compared with the control, the emergence rate, plant height, root length, fresh weight of aerial part and underground part of cotton with 106 mL^－1 LH-L3 suspension drenching for 3 times increased by 42.85%, 10.24%, 23.83%, 10.05% and 97.62%, respectively. And control effect on Verticillium wilt was 85.24%. [Conclusion] LH-L3 had good growth promotion and Verticillium wilt control effects and showed good potential for biological control.     

棉花内生拮抗菌Paenibacillus xylanilyticus YUPP-1抗黄萎病研究

 在棉花现蕾期筛选到一个高抗黄萎病的内生菌菌株,根据16S rDNA序列同源性,将其命名为Paenibacillus xylanilyticus YUPP-1(解木聚糖类芽孢杆菌YUPP-1)。当把该菌标记后,每株棉花施用该菌株达到1×10⁶ cfu时,该菌能顺利定殖于棉花体内。室内盆栽抗病实验表明：当生防菌灌根处理的菌量为每株1×10⁶,1×10⁷,1×10⁸ cfu,其在结铃期的发病株率仅为8%,5%和2%,而此时对照的发病株率高达96%。2008－2009年的小区防治结果表明：当生防菌灌根处理的菌量为每株1×10⁸ cfu时,2008年处理区的棉花黄萎病发病株率和病指为14.8%和8.5,对照分别为53.3%和26.5,2009年处理区的棉花黄萎病发病株率和病指为9.4%和6.5,对照为37.8%和18.8。这些结果表明,解木聚糖类芽孢杆菌YUPP-1对防治棉花黄萎病具有巨大的应用潜力。     

新疆棉花枯萎病菌营养体亲和群及互补指数的研究

从采自新疆23个不同县(市或团场)的棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f．sp．vasinfectum)52个菌株上获得785个不能利用硝酸盐的突变体(nit),其中nitl 占70．57％,nitM占19．75％,nit3(8)占9．68％。将52个菌株分别与已知的4个7号小种菌株、一个3号小种菌株和一个8号小种菌株的突变体按nitl或nit3(8)配nitM的方式等距离配对,(各对菌株间的配组数为11～154),进行营养体亲和性的测定,结果表明,52个待测菌株与7号小种的4个标准菌株间存在着不同程度的营养体亲和性,而与3号小种和8号小种的标准菌株均不亲和,因此,它们属于7号小种营养体亲和群—VCG701。但各菌株与7号生理小种的4个标准菌株间的互补指数存在着差异,显示出棉花枯萎病菌同—营养体亲和群内在个体间存在着生理和遗传的差异。     

棉花枯、黄萎病菌营养亲和性研究进展

介绍了棉花枯、黄萎病菌营养亲和性研究方法和营养体亲和群研究,并着重总结了利用营养亲和群结合DNA多态性技术,研究尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumSchlechtend:Fr)专化型、生理小种、亲和群之间的关系,以及棉花黄萎病菌(VerticilliumdahliaeKleb.)亲和群与致病型关系的研究进展。     

香蕉枯萎病拮抗芽胞杆菌的防效评价及防病作用研究

为有效评价生防菌对香蕉尖孢镰刀菌古巴转化型(Fusarium oxysporum f.sp. cubense,FOC4)B2的防病能力,通过对收集的生防菌资源进行抗性筛选,对筛选到的3株拮抗菌进行了抑菌观察、抗病谱测定、土壤抑菌能力监测及盆栽苗拮抗能力测定,并对测试菌进行了形态观察和16 r DNA测序鉴定。结果表明：249个测试菌中有109个菌株在对峙培养中表现拮抗能力,其中有三个菌株A5-6, D7-16和CL7的抑菌效果较为稳定。显微观察显示：三个拮抗菌会导致病原菌B2的菌丝发育畸形、膨胀、胞壁增厚、部分形成泡状、内容物外渗生长,以及抑制孢子的萌发等显著影响。抑菌谱测试表明,菌株对包括FOC以内的其它真菌性病害抑菌率在60%以上,但对尖孢镰刀菌其它专化型抑菌率较低,仅在40%-50%之间。土壤拮抗性能评价结果表明：拮抗菌单独对土壤中FOC数量的控制有限,只能降低一个数量级,但对盆栽苗中镰刀菌的数量控制能下降到2个数量级。盆栽实验表明,菌株A5-6以72.3%的防病效果较D7-16、CL7 45.4% 、50.0%的防效之间差异达到了极显著。三个菌株经形态学和16S rDNA序列鉴定表明D7-16为短短芽胞杆菌Brevibacillus brevis,A5-6和CL7也属于芽胞杆菌,三个菌株都是香蕉镰刀菌枯萎病潜在的良好生防资源,可作为生防菌做进一步的开发性研究。     

我国棉枯萎镰刀菌小种间的营养体亲和性

采用不能还原利用硝酸盐作唯一氮源生长的突变体(nit突变体),对我国棉枯萎镰刀菌的3、7、8号小种的61个菌株作了营养亲和性研究。结果表明,第3号小种7个菌株和第7号小种42个菌株各属一个不同的营养体亲和群,第8号小种的8个菌株则属6个不同亲和群,不同小种的菌株间没有亲和性。营养体亲和性试验结果与致病性测定结果吻合,能从遗传学角度区分棉枯萎菌不同小种,用它作为鉴定手段,结果更能反映出不同菌系间的本质联系,并可克服致病力测定工作中费时、费力及结果不稳定等缺点。