ARTP诱变筛选草菇优良菌株及RAPD分析

为构建草菇优良菌株突变体库,首次利用常压室温等离子体技术诱变草菇原生质体,优化的诱变条件是输出功率125 W、处理时间20 s。筛选出3株抗冻能力明显提高的突变菌株,3株突变株在草菇生长的20℃低温环境与对照相比生长速度提高了17%~57%,出菇爬料速度提高了0.8~2.4倍,出菇时间提前了1~2d,抗低温胁迫能力提高了24h。研究运用RAPD技术进行分子鉴定,建立草菇ARTP诱变育种筛选与检测评价平台。     

西瓜枯萎病生防菌枯草芽孢杆菌B11菌株高产拮抗物质的诱变选育

从西瓜根围分离得到的一株有效抑制西瓜枯萎病菌的枯草芽孢杆菌B 11菌株(B acillus subtilisstra in B 11)。为获得高产拮抗物质的诱变菌株,采用紫外线诱变方法对B 11菌株进行诱变,结果获得抑菌活性比野生菌B 11菌株强的6株诱变菌株,其中G 17菌株的抑菌活性及粗拮抗物质含量均高于B 11菌株,且遗传性较稳定;再以G 17菌株为供试菌株,用亚硝基胍(NTG)对其进行化学诱变,结果获得抑菌活性较强的4株诱变菌株,其中BV 22菌株对西瓜枯萎病菌的抑菌活性最高,其抑菌活性比G 17和B 11菌株分别提高了36.88%和80.00%;其粗拮抗物质的含量分别提高了30.15%和62.53%。研究结果说明,用物理诱变B 11菌株后获得的诱变菌株再用化学方法进行诱变,可选育出高产拮抗物质的诱变菌株。     

响应面法优化桔青霉F-5-5核酸酶P1发酵培养基碳氮源

桔青霉(Penicillium citrinum)CICC 4011菌株经60Co γ射线诱变后,由其高产突变株经基因组重排育种筛选获得核酸酶P1高产菌株F-5-5,在马铃薯葡萄糖培养基中产酶达978.6U/ml.经Placket-Burman试验筛选得出影响菌株产酶的3个显著因素,为葡萄糖、可溶性淀粉和玉米浆干粉.在...     

脉冲强光诱变对黑曲霉产果胶酶活力的影响

脉冲强光技术可应用于微生物诱变育种以及获得高产菌株。该文采用响应面法确定脉冲强光诱变黑曲霉高产果胶酶的最佳条件,同时探究突变菌株高产果胶酶的酶学性质。结果表明:脉冲强光诱变条件为脉冲电压2075 V,脉冲次数36次,脉冲距离5.4 cm。以此工艺参数进行诱变,得到了高产果胶酶的突变菌株L9,与原始菌株相比,其果胶酶活力提高了82.22%±0.18%。突变菌株L9遗传性能良好,所产果胶酶具有更高的pH稳定性和热稳定性。因此,脉冲强光可用于黑曲霉诱变,得到稳定性良好的高产果胶酶的突变菌株。     

原生质体EMS诱变选育杏鲍菇高产菌丝多糖菌株

为了促进杏鲍菇的产品研发,利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变处理杏鲍菇PL7菌株原生质体,筛选菌丝多糖含量显著增加的原生质体诱变菌株。结果表明,EMS诱变原生质体的适宜浓度和处理时间分别为0.20%和15 min;从160个原生质体再生菌株中筛选出与亲本菌株拮抗作用明显的22株诱变株;通过菌丝多糖浓度测定,获得菌丝多糖浓度显著增加的7株诱变菌株;通过菌落生长速度测定、RepPCR分析和出菇试验,最终获得高产菌丝多糖的新型菌株D3-12。本研究结果为杏鲍菇种质资源创新和新品种选育提供了新途径。     

绿僵菌航天诱变菌株的DNA变异性分析

昆虫病原真菌绿僵菌M2189菌株经航天搭载诱变后,分离得到200多个单孢菌株。以9个随机引物对47个诱变菌株进行PCR扩增,获得了38个位点的共1381条DNA片段。统计分析表明,47个诱变菌株在DNA水平上发生了不同程度的变异,变异系数在0.062~0.406之间,平均为0.176,>0.3的有3个菌株。由聚类分析可将47个诱变菌株划分为14个组群,组间变异率小于0.2,与原始菌株相比变异系数接近的诱变菌株无规律地分散在不同组群中,说明航天诱变导致DNA变异的位点和频率是随机的、分散的,并无特定位点。航天诱变为选育生物防治优良菌株提供了新途径。     

利用常压室温等离子体诱变选育工厂化金针菇新菌株

为确定金针菇常压室温等离子体处理的诱变致死率，创制工厂化金针菇新种质，本研究以上研1号菌株作为亲本，收集其孢子进行常压室温等离子体诱变后，采用多孢自交技术获得新菌株，再经工厂化小试初筛和中试复筛，最终获得新种质。结果表明，从108个突变自交菌株中获得出芽快且整齐、产量高、商品性状优良(菌盖厚实、菌柄较粗)的金针菇新品种上研A130，该品种为白色，菌盖呈球形、内扣，菌柄基部绒毛少，子实体干品中必需氨基酸总含量为2.57×10⁴ mg·kg^-1。工厂化栽培条件下，菌丝培养温度为20℃，子实体生长发育温度为4～18℃，瓶栽菌丝培养周期为22 d，子实体生育时间为26 d，平均单瓶产量为每瓶456.41 g。本研究结合新型诱变技术和传统选育方法，提高了亲本的突变率，为筛选具有目标性状的工厂化金针菇新菌株提供了数据支撑，对金针菇产业持续发展具有实践价值。     

嗜鞣管囊酵母木糖发酵乙醇高产突变株选育及其发酵特性

目前能够利用木糖发酵产乙醇的菌株很少且产量较低,对菌株进行诱变选育,可以提高其对木质纤维集的利用率.本试验选择嗜鞣管囊酵母As2.1585为原始菌株,采用15keV的低能氮离子进行注入诱变.随着注量的增加,菌体存活率曲线呈"马鞍型",综合考虑其存活率和正突变率,确定最佳诱变注量为12.5×1014ions/cm2,对诱...     

低温生防菌株的诱变选育及生防效果

为了提高生防菌株wswshg-10低温生长速度和抑菌活性,采用常压室温等离子体诱变技术(ARTP)对其进行诱变选育。结果表明,最佳照射时间为120 s,此时菌株致死率为95.4%,单菌落变大的突变率为24.5%。经低温平板培养和抑菌活性测定,从19个大菌落的菌株中筛选出2株低温生长速度和抑菌活性明显高于出发菌株的突变菌株WM4和WM7,其低温(15℃)生长速度分别是出发菌株的1.94倍和2.09倍,平板抑菌活性分别较出发菌株高26.2%和29.8%。传代培养10代,2株突变菌株在低温生长速度和抑菌活性方面均表现出良好的遗传稳定性。突变菌株WM7对玉米茎基腐病的温室防效为70.8%,比出发菌株高15.1%。本研究结果为适于低温地区生物农药的研发提供了菌株资源。     

空间环境诱变甜椒基因组DNA变异的分子检测

为明确空间环境对甜椒后代的诱变影响,本研究以空间诱变的甜椒第4代及其地面对照为主要研究材料,采用RAPD技术对二者的基因组DNA进行了扩增分析,并对部分差异片段进行了测序。结果发现:空间诱变的甜椒后代与其地面对照变异情况相比,SP4的基因组DNA发生了变异,共检测出8个多态性位点,在对照和变异体中各扩增出4个位点。对其中2条特异片段进行回收测序,序列同源性为97%。研究认为空间环境条件可以诱导甜椒后代植株基因组DNA发生变异。     

草菇基因组中的tRNA分析

草菇（Volvariella voluog,e曲，又名中国蘑菇，是一种生长于中国和东南亚的重要经济食用菌。本文基于本实验室的草菇基因组测序结果，分析了草菇基因组中的tRNA情况。草菇基因组的302个框架中，共发现了177个tRNA基因，其中有7个可能的假基因，有2个携带硒代半胱氨酸，一个抑制性tRNA基因和一个未知的异型结构tRNA。除了上述11个特殊的tRNA基因外，166个tRNA可按反密码子类型分成47类。与其它5种担子菌的基因组tRNA比较，草菇的tRNA数量处于第4位，少于鬼伞、裂褶菌、灵芝，多于双孢蘑菇和平菇。通过比较分析草菇及这5种大型真菌的基因组tRNA编码情况，首次报道了几种食用菌tRNA遵守修正的摆动假说的情况。另外，草菇的同功受体tRNA非编码子序列也具有差异性，对tRNA的分析将有助于进一步研究草菇的进化。     

γ辐照对草菇保鲜及其生理机制的研究

以草菇V84 子实体为供试材料,用60 Co γ射线0-8 、1-2 和1-6kGy 辐照,在16 ℃下打孔自发气调贮藏,结果表明,在一定的范围内,辐照抑制了膜脂过氧化过程,保持了膜结构的完整性,因而延缓了草菇的衰老进程,延长了贮藏保鲜期。0-8kGy 辐照处理将草菇的贮藏保鲜期延至6d 。     

草菇菌渣接种固氮菌、磷溶菌进行有机堆肥的研究

以工厂化栽培杏鲍菇和草菇后的菌渣废弃物为主要原料,考察经2种固氮菌和溶磷菌强化的生物堆肥过程中60 d内菌渣堆温度、pH值、E4/E6值对堆肥的影响,堆肥过程中全氮、磷、钾和速效氮、磷、钾的动态变化情况,发现经微生物强化的堆肥与自然条件下堆肥的情况差别不大,说明该菌渣适宜进行自然发酵堆肥生产有机肥料,具有方便、经济的优势,为食用菌菌渣的生态无害化利用开辟新路,为进一步实现菌渣循环反哺农业种植奠定了基础。以期为菌渣废弃物的"综合、生态、链式、经济"利用提供科学支撑。     

草菇菌丝体与原基差异表达基因分析

采用Solexa测序技术,对草菇菌丝体和原基进行了数字基因表达谱（DGE）测序,在菌丝体和原基文库中分别得到5701781个和5659262个高质量测序标签（cleantags）,对应的标签种数（distinct clean tags）分别为85626和95363。将所有高质量测序标签与参考基因库进行比对,在菌丝体和原基文库中,占标签种数的43.32%和52.57%的标签可以唯一定位（map）到参考序列上,占标签种数的21.65%和21.47%的标签可以被定位到基因组序列上。最终,被菌丝体和原基标签唯一定位的基因数（unambiguous tag-mapped genes）分别为14794和15534。差异基因分析显示,两个文库中共有显著性差异表达的基因4163个,其中在原基中上调、下调的基因数分别为2486和1677,只在原基中表达的基因321个。经过Blastnr比对,在原基中特异表达的基因,涉及蛋白质（氨基酸）合成与代谢、糖代谢、脂类代谢和抗逆反应等多个代谢途径。GO功能富集分析结果表明,葡萄糖、己糖和乙醇等代谢途径大部分基因下调表达。Pathway功能富集分析结果表明,合成核糖体蛋白的基因均下调表达,表明原基形成时细胞代谢减弱,蛋白质合成量减小。     

用基因组改组技术改良发酵木糖酵母Candida tropicalis XY-19的耐乙醇性能

Candida tropicalis XY-19是一株具有优良乙醇发酵性能的发酵木糖酵母,其发酵葡萄糖产乙醇性能与目前酒精工业生产菌种--安琪酒精酵母相近,但XY-19的耐乙醇性能远比安琪酒精酵母差,XY-19在含有超过7%（v/v）乙醇的培养基中不能生长。以XY-19为出发菌株,经紫外线诱变获得了5株能在7.5%（v/v）乙醇的培养基中旺盛生长的突变株,经Co-60诱变获得了8株能在含8%（v/v）乙醇的培养基中旺盛生长的突变株。然后,以紫外线诱变得到的5株菌和Co-60诱变得到的8株菌及耐乙醇性能较好的酿酒酵母（S.cerevisae Angel,S.cerevisae4608和S.cerevisae172）为出发菌株,经过4轮Genome shuffling结合木糖乙醇梯度平板的筛选,获得了4株（G3-13,G3-18,G3-57和G3-60）能够在12%乙醇平板上生长的菌株,其乙醇耐受性比野生菌株XY-19提高了71%,为将XY-19进一步开发成纤维质乙醇发酵的生产菌种奠定基础。本研究结果进一步体现了Genome shuffling技术在改良如乙醇耐受性等多基因控制性状上的突出优势,为工业生产菌种的快速有效改良提供了一种有效的方法。     

Facile immobilization of evolved agrobacterium radiobacter carbamoylase with high thermal and oxidative stability

Optically pure amino acids have been widely used as intermediates in the synthesis of antibiotics, antifungal agents, pesticides, and sweeteners. Of particular importance, d- p-hydroxyphenylglycine (D-HPG) can be produced from d, l-hydroxyphenly hydantoin (D,L-HPH) in a two-step reaction mediated by d-hydantoinase and N-carbamoyl- d-amino acid amidohydrolase (or carbamoylase). To make this production more industrially appealing, the carbamoylase gene from Agrobacterium radiobacter NRRL B11291 cloned in an Escherichia coli strain was intensively mutated to improve the thermal stability of carbamoylase by three rounds of DNA shuffling. After an extensive screening of the mutant library, the mutant E. coli strain M303 was obtained to produce variant carbamoylase, CBL303, with three critical mutated residues, including V40A, G75S, and V237A. Further characterization showed that in comparison with the wild-type counterpart the evolved carbamoylase exhibited more than 20-fold tolerance to heat and, in addition, hydrogen peroxide as a result of the synergistic effect caused by the three mutations. Moreover, with the fusion of the chitin-binding domain (ChBD) of Chitinase A1, the evolved carbamoylase CBL303 was specifically adsorbed on chitin beads. Subsequent analysis indicated that the linkage between the enzyme and the affinity matrix was substantially stable. The half-life of the immobilized carbamolyase CBL303 could reach 210 h at 45 degrees C, whereas its free form had that of 17 h. In particular, when applied to D-HPG production, the immobilized enzyme could be recycled 16 times with the achievement of 100% conversion yield. Along with the previous illustration of d-hydantoinase immobilization, the success achieved by immobilization of the evolved carbamoylase in this work apparently offers a promising way for the efficient production of D-HPG from D,L-HPH.     

与草菇菌柄伸长相关的bZIP转录因子基因克隆与表达分析

本研究分析了草菇子实体原基、钮扣期菌柄、蛋形期菌柄、伸长期菌柄和成熟期菌柄的表达谱（DGE）,找到一个在伸长期菌柄高表达的基因elnL。PCR克隆测序以及转录组分析结果表明,elnL序列长度1640bp,含有一个内含子,编码526个氨基酸,具有典型的bZIP保守结构域,与双孢蘑菇、双色蜡蘑等担子菌的bZIP转录因子相似性较高。该基因在伸长期菌柄的表达量显著高于其它发育阶段,它可能是一个与草菇菌柄伸长有关的bZIP转录因子。     

多轮次筛选选育高酚酸耐受性丁醇生产菌

纤维原料预处理过程中会产生酚酸等抑制菌株生长的物质,为选育出高丁醇产量及高耐受酚酸胁迫丁醇生产菌株,该研究利用多因子复合筛选策略筛选出一株能够合成足够还原力与对丁醇耐受性较好的菌株Clostridium beijerinckii W6。通过丁醇胁迫适应性进化获得丁醇耐受菌W6-1,其丁醇和总溶剂产量相较于菌株W6分别提高了14.01%和16.85%。通过紫外诱变处理菌株W6-1并结合理性筛选模型最终获得丁醇产量较高菌株W6-2,其丁醇及总溶剂产量分别可达到（9.51±0.06）和（15.32±0.11）g/L。最后将菌株W6-2通过酚酸胁迫适应性进化得到突变菌W6-3,其能耐受1.0 g/L酚酸胁迫环境,且丁醇和总溶剂产量相较于菌株W6-2分别提高了18.17%和17.49%。当以葛渣水解液为底物进行丙酮丁醇发酵时,突变菌W6-3的丁醇产量达（8.54±0.31）g/L,相较于菌株W6-2提高了26.71%。经多轮次诱变及适应性进化处理获得的突变菌的酚酸耐受性及发酵性能均有较大提高,该文所采用的多轮次筛选方法可以为其他快速筛选优良生产菌提供可靠的理论参考。     

瑞氏木霉碳源阻遏相关基因Cre1的分子改造

为了提高瑞氏木霉（Trichoderma reesei）纤维素酶的活力,用类似基因改组的方法改造其碳源阻遏相关基因cre1。以瑞氏木霉基因组DNA为模板PCR扩增cre1基因,用DNaseⅠ消化cre1基因后,回收50-100 bp的DNA片段,用T4 DNA连接酶连接,以连接产物作为模板进行无引物PCR,并将PCR产物转入瑞氏木霉原生质体,通过测定滤纸酶活的方法筛选突变菌株,并在NCBI上比对分析突变菌株的cre1基因。结果表明,筛选获得1株纤维素滤纸酶活比出发菌株提高0.7倍的突变菌株cre2-3。cre2-3菌株在液体培养基中呈棉花状,而出发菌株呈小颗粒状,菌株cre2-3发酵液的颜色比出发菌株的更黄亮。推测cre1基因与瑞氏木霉菌株的生长代谢有关。     

辣椒不同品种种子萌芽期耐低温性及评价方法研究

以108个辣椒品种为试材, 测定了低温(18 ℃)下种子的相对发芽势、相对发芽率、相对胚根长、相对发芽指数和相对活力指数, 并采用极点排序法对辣椒不同品种的耐低温性进行综合评价。结果表明: 辣椒 不同品种种子萌芽期的耐低温性不同, 相对发芽率、相对发芽指数、相对胚根长和相对活力指数4项指标在不同品种间差异达显著水平(P<0.05)。选用上述4个指标, 采用极点排序法计算得到各品种的综合评价得分, 根据综合评价得分将108个辣椒品种分为10个耐低温品种, 9个低温敏感品种, 其余为中度耐低温品种。辣椒种子相对发芽势、相对胚根长与综合评价得分的相关性达到显著水平; 相对发芽率、相对发芽指数、相对活力指数与综合评价得分的相关性达极显著水平, 且相对活力指数与综合评价得分的相关性最高(r=0.899 9)。通过测定低温下辣椒品种萌芽期相关性状指标, 采用极点排序法可对辣椒种子萌芽期耐低温性进行快速、准确的评价。