不同地方品种牦牛IGF-1基因的PCR-SSCP分析

为了检测高原地区4个不同地方牦牛品种IGF-1基因第1外显子和第2外显子的多态性,采用PCR-SSCP分析了牦牛IGF-1基因在天祝白牦牛、甘南牦牛、青海高原牦牛及培育品种大通牦牛4个品种中的遗传多态性。结果表明:牦牛IGF-1基因的第1外显子不存在遗传多态性;第2外显子在4个品种中检测到了AA、AB和BB基因型,而且A等位基因为4个牦牛群体的优势等位基因,分布较高。在4个品种中,天祝白牦牛AA基因型频率最高,达到0.8559,而大通牦牛、甘南牦牛和青海高原牦牛则相对较低,分别为0.8333、0.6970和0.5689。大通牦牛和天祝白牦牛,青海高原牦牛和甘南牦牛基因和基因型相近,其它牦牛群体之间基因和基因型存在差异。     

三个牦牛品种生长激素受体(GHR)基因PCR-SSCP分析

为了加速牦牛群体的复壮,本实验利用PCR-SSCP技术对甘南、天祝、青海高原3个牦牛品种的生长激素受体基因进行了多态性分析。结果表明:第1、3对引物扩增无多态,第2对引物扩增3个牦牛品种均发现2个等位基因A和B,天祝白牦牛A的基因频率为0.3682,B的基因频率为0.6318;甘南牦牛A的基因频率为0.1596,B的基因频率为0.8404;高原牦牛A的基因频率为0.0700,B的基因频率为0.9300。青海高原牦牛群体处于哈代-温伯格平衡状态,而甘南和天祝牦牛处于不平衡状态,应加强对该基因位点的选择强度。     

甘南牦牛GH基因的SNPs分析

[目的]甘南牦牛是分布在甘南境内的牦牛类群,是当地优势畜种之一.为了揭示甘南牦牛GH基因的结构特征,[方法]采用PCR-SSCP技术,对202头甘南牦牛生长激素基因(GH)5个外显子及部分内含子序列进行SNPs分析.[结果]表明:甘南牦牛GH基因第1、第2和第4外显子无多态性,第3内含子及第5外显子表现遗传多态性,其中第3内含子有AA、AB、BB 3种基因型,第5外显子有CC和CD 2种基因型,未发现DD基因型.序列分析发现,第3内含子1 694 bp处发生T→C单碱基转化;第5外显子2 154 bp处发现G→A单碱基突变,导致由甘氨酸(Gly)变为丝氨酸(Ser).甘南牦牛在2个基因位点上均表现为低度多态(PIC<0.25),χ2检验表明其处于Hardy-Weinberg不平衡状态(P<0.05).结论 初步推测甘南牦牛GH基因的多态性相对贫乏.     

牦牛乳铁蛋白基因多态性及其与乳品质性状的关联分析

试验旨在检测牦牛乳铁蛋白（lactoferrin,LF）基因多态性,评估基因突变对牦牛乳品质性状的影响,以期丰富牦牛重要经济性状的分子遗传研究。应用PCR-SSCP方法,检测甘南牦牛、西藏牦牛和天祝白牦牛LF基因5'UTR和内含子4突变,结合甘南牦牛乳品质测定,评估基因突变对其乳品质性状的影响。结果表明,牦牛LF基因5'UTR检测到c.-568 G>A的突变,等位基因A₁和基因型A₁B₁频率最高,为优势等位基因和基因型;内含子4检测到c.499+56 C>A突变,基因型A₂B₂频率最高,为优势基因型,等位基因A₂为甘南牦牛和天祝白牦牛优势等位基因,而B₂为西藏牦牛优势等位基因;各类群牦牛检测区域多态信息含量（PIC）介于0.25~0.50,属中度多态。关联分析表明,甘南牦牛LF基因突变影响部分胎次甘南牦牛乳品质性状,其中5'UTR第2胎基因型A₁A₁和A₁B₁个体无脂固体物质百分含量显著高于B₁B₁个体（P<0.05）;内含子4第3胎基因型A₂B₂和B₂B₂个体乳脂率显著高于A₂A₂型个体（P<0.05）,第4胎基因型B₂B₂个体的乳脂率显著低于A₂A₂和A₂B₂型个体（P<0.05）。以上结果表明,甘南牦牛、西藏牦牛和天祝白牦牛LF基因存在多态性,甘南牦牛LF基因5'UTR、内含子4突变分别影响无脂固体物质含量和乳脂率,可以作为潜在的分子遗传标记。     

基于mtDNA D-loop序列探究门源白牦牛与天祝白牦牛间的遗传差异

为从分子水平上探究青海省门源白牦牛与甘肃省天祝白牦牛间的母系遗传差异,本研究对31头门源白牦牛mtDNA D-loop区部分序列进行测定,结合GenBank中已报道的235条天祝白牦牛相应序列,对共计266条白牦牛D-loop序列进行了综合分析。结果表明,在截取的638 bp白牦牛D-loop区分析序列中,排除64处插入或缺失后共检测到80个多态位点,包括5个单一多态位点和75个简约信息位点。根据序列间核苷酸变异共确定了56种单倍型,其中门源白牦牛拥有特有单倍型7种,天祝白牦牛包含特有单倍型43种,二者共享的单倍型只有2种。门源白牦牛单倍型只分布在A、B和C单倍型组中,而天祝白牦牛单倍型分布在A、B、C、D、E和F单倍型组中,并含有4种普通牛单倍型序列,提示天祝白牦牛中存在普通牛遗传渗入。门源白牦牛单倍型多样度为0.862,核苷酸多样度为0.007,而天祝白牦牛单倍型多样度为0.946,核苷酸多样度为0.014,表明天祝白牦牛的遗传多样性水平高于门源白牦牛。门源白牦牛与天祝白牦牛间的遗传分化指数(Fst)为0.114,表明2个品种(群体)间呈中等分化水平。系统发育分析结果显示,56种单倍型可分为2个明显的分支(即Ⅰ和Ⅱ),表明白牦牛有2个母系起源。综上所述,天祝白牦牛的遗传多样性水平高于门源白牦牛,门源白牦牛母系遗传多样性较低;2个品种(群体)间呈中等遗传分化水平,天祝白牦牛存在一定程度的普通牛基因渗入;2个品种(群体)均由2个母系支系组成,提示白牦牛有2个母系起源。鉴于2个品种(群体)间呈中等遗传分化水平,且都拥有特有的单倍型遗传信息,故建议将其均作为独立的"遗传单元"进行遗传资源保护进而开展保种和选育实践。     

大通牦牛和天祝白牦牛DRA基因外显子的多态性分析

本实验通过对大通牦牛和天祝白牦牛DRA基因外显子的部分CDS区序列进行分析,测序分析后发现,两种不同牦牛的基因突变位点有所不同,大通牦牛的有一个错位突变,而天祝白牦牛只有沉默突变,从中可以看出两种牦牛在基因上的具体差异。可能是由于生活环境的差异,导致出现这种情况。     

以GH基因多态性探讨中国南北黄牛及牦牛系统

以中心产区典型群随机抽样的方法,采用PCR产物直接测序的方法测定了18头雷琼牛、19头巴音郭楞州蒙古牛和18头巴音郭楞州牦牛GH基因外显子654 bp核苷酸碱基序列,引用GenBank中牛属普通牛、瘤牛、牦牛以及亚洲水牛GH基因同源区资料,作外类群以最大简约（MP）法与邻接（NJ）法构建分子系统发育树。旨在为探讨牛亚科家畜GH基因变异特点、牦牛跟我国南北黄牛关系的亲疏,以及牛亚科物种进化特征提供部分客观依据,适应进化与分子进化之间的关系提供局部的原始试验根据。结果发现雷琼牛GH基因序列中存在3个变异位点,定义了5种单倍型。在巴音郭楞州蒙古牛GH基因序列中存在2个变异位点,定义了4种单倍型。在巴音郭楞州牦牛GH基因序列中存在2个变异位点,定义了3种单倍型。确认GH基因的分化早于普通牛,瘤牛和牦牛的分化,就GH基因本身而言,牦牛与中国南北黄牛的关系无远近之分。     

三个牦牛群体DRB3.2基因PCR-RFLP多态性研究

为了研究牦牛DRB3.2基因exon 2遗传多样性,试验采用PCR-RFLP对天祝白牦牛、甘南牦牛、大通牦牛3个类群757头个体的MHC-DRB3.2基因进行PCR-RFLP分析。结果表明:共检测出8个HaeⅢ酶切位点、11种基因型;在3个牦牛类群中,HaeⅢC基因型(225 bp/175 bp/85 bp/35 bp)在大通牦牛、天祝白牦牛中是优势基因型,基因型频率分别为0.387和0.366;而在甘南牦牛中,HaeⅢA基因型(175 bp/85 bp/35 bp)为优势基因型,基因型频率为0.306。3个群体的多态信息含量分别为0.739,0.754,0.743,均达到了高度多态(PIC>0.50)。说明牦牛DRB3.2基因具有高度多态性,在研究牦牛抗病育种和提高牦牛生产性能方面具有独特的效力和广泛的应用前景。     

中国南方黄牛生长激素基因遗传分化的研究

对雷琼瘤牛18个个体生长激素(GH)基因外显子序列654bp进行分析,发现3个变异位点,定义了5种单倍型;引用巴州牦牛2个个体GH基因同源区序列并结合GenBank中牛属普通牛、其他瘤牛和牦牛3个种群与水牛1个远缘种GH基因外显子序列,分别采用邻接(NJ)法和最大简约(MP)法构建分子系统发育树,得到基本一致的拓扑结构。结果显示,GH基因的分化早于雷琼瘤牛、其他瘤牛、普通牛、牦牛和水牛的分化,瘤牛物种内存在多型现象,GH基因外显子区有着较高的突变率。     

牦牛Ihh基因组织表达分析、SNP检测及其基因型组合与生产性状的关联分析

为了研究牦牛Ihh基因多态位点基因型组合与生产性状间的相关性,发现与牦牛生产性状相关的分子标记,同时进一步研究Ihh基因在牦牛和黄牛各个组织的分布和表达,试验采用高分辨率熔解曲线分析技术(High resolution melting curve,HRM)进行基因型分型和统计等位基因频率,同时,运用荧光定量PCR分析Ihh基因在牦牛和黄牛不同器官的表达差异。试验结果表明,Ihh基因在牦牛和黄牛的所有组织中均表达。然后采用SHEsis和PHASE软件对Ihh基因多态位点进行配对连锁不平衡和单倍型分析,采用SPSS17.0进行多态位点单倍型组合与生产性状关联性分析。结果检测到牦牛Ihh基因外显子3的2个多态位点5855(C/T)和6383(G/A)。群体遗传学分析显示,2个多态位点均表现为高度多态(PIC0.25);χ2检验表明,甘南牦牛和大通牦牛群体在两个突变位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P0.05),而天祝牦牛在2个突变位点处未达到Hardy-Weinberg平衡(P0.05);多态位点配对连锁不平衡分析发现,2个突变位点之间存在强连锁平衡,有4种单倍型组合;基因型组合主要发现了3种。关联分析表明,Ihh基因2个突变位点的3种基因型组合对牦牛体斜长、体高、胸围、管围和体重有显著差异(P0.05),具有CTGA基因型组合的牦牛个体在体斜长、体高、胸围、管围和体重方面显著高于CCGG和TTAA型(P0.05)。因此,综上推断Ihh基因基因型组合与牦牛体斜长、体高、胸围、管围和体重存在相关性。     

Polymorphism Study on DRB3 Gene Exon 2 in Tianzhu White Yak and Gannan Yak Arlud

In this study,CDS sequence of DRB3 gene exon 2 in Tianzhu White yak and Gannan yak were analyzed,a clean single chain was obtained to get the accurate haplotype by direct sequencing and amplification refractory mutation system (ARMS) method,the double chain of high heterozygosity was typed.The results showed that 65 SNPs and a codon insertion and deletion were discovered,all together separated to 30 haplotypes,in which seven haplotypes were found firstly,it should be peculiar to Tianzhu White yak and Gannan yak.Compared with published bovine DRB3 gene exon 2 haplotypes,the analysis results showed Tianzhu White yak and Gannan yak shared haplotypes of cattle (Bos taurus) and zebu (Bos indicus),which meaned they might crossed with cattle (Bos taurus) and zebu (Bos indicus).PAML analysis showed that 4,25,30,53,59,62,63,66,78 amino acid sites were affected by positive selection,and mainly occurred in Tianzhu yak,it had a certain relation with breeding history of Tianzhu White yak.     

Cloning and Protein Structure Analysis of Hypoxia Inducible Factor-1α Gene in Yak

In this study,hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α) gene was cloned from yak spleen by RT-PCR,and it was divided into two sections for amplification.The sequence and protein structure were analyzed using related bioinformatics tools.The length of the coding region was 2 472 bp,which encoded 823 amino acids.Its molecule mass was 92.13 ku,and PI was 5.09.It displayed as a hydrophilic protein,whose secondary structure was mainly composed of random coil and α-helix.It had 69 phosphorylation sites and 4 N-glycosylation sites.Phylogenetic tree displayed that Maiwa yak,Bos grunniens,Bos mutus and Bos taurus gathered into one cluster.Maiwa yak HIF-1α gene was successfully cloned in this study,it provided a viable reference for further study of genetic characteristics of HIF-1α.     

牦牛PRLHR基因的克隆、序列分析及组织表达研究

试验旨在对牦牛催乳素释放激素受体（prolactin releasing hormone receptor,PRLHR）基因进行克隆、序列分析及组织表达研究。采集5头母牦牛和5头母黄牛的下丘脑、脑垂体前叶、卵巢、输卵管和子宫组织,采用RT-PCR技术扩增得到PRLHR基因cDNA全长,通过生物信息学方法分析该基因编码蛋白的生物信息学特征,利用实时荧光定量PCR技术测定PRLHR基因在牦牛及黄牛各组织中的表达量。结果显示,牦牛PRLHR基因序列长1 625 bp,其中CDS区1 113 bp、5'-UTR 22 bp和3'-UTR 490 bp,编码370个氨基酸,与黄牛、水牛、绵羊、猪和人的核苷酸序列有较高的同源性,在进化过程中十分保守;牦牛PRLHR为不稳定疏水蛋白,无信号肽,存在7个跨膜结构域;有13个丝氨酸磷酸化位点、6个苏氨酸磷酸化位点和4个酪氨酸磷酸化位点;有3个N-糖基化位点和10个O-糖基化位点;蛋白二级结构中α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-转角分别为49.19%、31.89%、15.68%和3.24%;蛋白质三级结构预测显示,牦牛PRLHR蛋白具有GPCRs超级家族中PrRP家族的典型结构域。实时荧光定量PCR结果表明,PRLHR基因在牦牛输卵管组织中的表达量显著高于其他组织（P<0.05）;在牦牛下丘脑、脑垂体前叶、子宫和输卵管组织中的表达量极显著高于黄牛（P<0.01）。试验成功克隆得到牦牛PRLHR基因序列,并对其进行了生物信息学和组织表达特性分析,为进一步研究PRLHR基因在牦牛繁殖活动中的调控作用奠定了基础。     

牦牛FASN基因多态性及其与肉质性状的相关性研究

利用PCR-SSCP技术,对甘南牦牛、大通牦牛和天祝白牦牛的FASN基因第3内含子进行SNPs筛选,并将筛选到的突变位点与牦牛部分肉质性状进行相关性分析.结果发现,3个牦牛群体在第3内含子检测到g.5477 C→T的突变,由此产生3种基因型：HH、HG、GG.相关性分析表明,HH基因型和HG基因型个体的脂肪含量显著高于GG基因型个体（P＜0.05）.HH、HG、GG 3种基因型对失水率、熟肉率、pH24值和剪切力的影响差异不显著（P＞0.05）.     

牦牛低氧诱导因子-1α基因克隆及蛋白质结构分析

试验采用RT-PCR方法,以麦洼牦牛脾脏cDNA为模板扩增牦牛低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)基因,并运用生物信息学软件对其序列进行分析。结果发现,扩增得到的麦洼牦牛HIF-1α基因编码区长为2 472 bp,编码823个氨基酸;蛋白质预测结果显示,该蛋白质分子质量为92.13 ku,等电点5.09,为亲水性蛋白,二级结构以随机卷曲和α-螺旋为主,有69个磷酸化位点和4个N-糖基化位点;系统进化树显示,麦洼牦牛与牦牛、野牦牛、普通牛亲缘关系最近。本试验成功克隆麦洼牦牛HIF-1α基因并对其序列进行了分析,为进一步研究HIF-1α基因的功能提供参考。     

氯前列烯醇诱导牦牛同期发情效果的研究

本研究用氯前列烯醇分别对青海大通牦牛(n=12)两次注射;对天祝白牦牛(n=17)和天祝黑牦牛(n=21)一次注射进行同期发情处理。三批处理结果为,一次注射后的发情率分别为:青海大通牦牛(9/12),75.0%;天祝白牦牛(10/17),58.8%;天祝黑牦牛(12/21),57.1%;平均一次性注射发情率为(31/50)62.0%。青海大通牦牛在第二次注射后的发情率为(12/12)100%,注射后发情的时间分别为:24h内发情的占8.0%、24～36h的占20.0%、36～48h的占30.0%、48～60h的占4.0%、60～72h的占0%。结果表明:氯前列烯醇对繁殖季节牦牛进行同期发情处理效果明显,二次注射处理后的发情率高于一次注射,处理后牦牛发情时间集中24～48h之间。     

中国牛亚科6个物种MSTN基因外显子2多态性及分化研究

采用PCR扩增了6个中国牛种共101个样本的MSTN基因外显子2的编码区,序列分析显示,MSTN基因外显子2编码区含372个碱基对,在所检测样本中,存在10个核苷酸多态位点,定义了7种单倍型,雷琼牛、蒙古牛、独龙牛与巴音郭楞牦牛享有共同的单倍型;MSNT基因外显子2在6个牛种中多态性较丰富。结果表明:两水牛与牛属群体间分化明显;牛属群体中牦牛独自聚成一类;大额牛存在一个独立分支;雷琼牛与一部分独龙牛、大部分蒙古牛和瘤牛聚成一支,说明蒙古牛、雷琼牛、独龙牛种间存在着基因交流。牦牛与普通牛、瘤牛的分化较明显,亲缘关系较远;研究证实了水牛的属分类地位,一定程度上支持牦牛及大额牛划为牛亚科中单独的一个属。