结球甘蓝花粉蛋白延伸因子基因的克隆及其序列分析

以结球甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L.）E1 花粉为试材,对萌发前后的花粉总蛋白进行双向电泳及差异蛋白质谱分析,发现延伸因子 BoEF-Tu 蛋白在花粉萌发后较萌发前表达上调。利用同源克隆得到甘蓝 BoEF-Tu 基因的全长 cDNA 序列,其长度为 1 728 bp,具有一个完整开放阅读框（ORF）,位于 112 ~ 1 473 bp 处,编码 453 个氨基酸残基,预测分子量为 49.17 kD,等电点为 6.52。生物信息学分析表明：BoEF-Tu 蛋白含有 9 个 α–螺旋结构,18 个 β–折叠结构,不含信号肽和跨膜区,在106 ~ 121 位氨基酸残基处有 1 个 GTP 结合区域（DKAPEEKKRGITIATA）。氨基酸同源性分析表明,BoEF-Tu 与拟南芥 EF-TuM 同源性较高,达到 93%;系统进化分析表明,BoEF-Tu 与拟南芥 EF-Tu 的亲缘关系最近。     

结球甘蓝花粉蛋白延伸因子基因的克隆及其序列分析

 以结球甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L.）E1花粉为试材,对萌发前后的花粉总蛋白进行双向电泳及差异蛋白质谱分析,发现延伸因子BoEF-Tu蛋白在花粉萌发后较萌发前表达上调。利用同源克隆得到甘蓝BoEF-Tu基因的全长cDNA序列,其长度为1 728 bp,具有一个完整开放阅读框（ORF）,位于112 ~ 1 473 bp处,编码453个氨基酸残基,预测分子量为49.17 kD,等电点为6.52。生物信息学分析表明：BoEF-Tu蛋白含有9个α–螺旋结构,18个β–折叠结构,不含信号肽和跨膜区,在106 ~ 121位氨基酸残基处有1个GTP结合区域（DKAPEEKKRGITIATA）。氨基酸同源性分析表明,BoEF-Tu与拟南芥EF-TuM同源性较高,达到93%;系统进化分析表明,BoEF-Tu与拟南芥EF-Tu的亲缘关系最近。     

接头连接介导的PCR 扩增马铃薯抗晚疫病基因侧翼序列研究

利用接头连接介导的PCR 技术，以前期NBS profiling 试验获得的1 条马铃薯抗晚疫病基因
片段为基础，设计巢式基因特异性引物，扩增获得两侧序列。结果表明：基因组DNA 经DraⅠ酶切后，
在已有536 bp 片段的左侧和右侧均得到序列延伸，右侧扩增得到2 301 bp，左侧扩增得到820 bp，去除
边界序列后，向左延伸789 bp，向右延伸2 273 bp，拼接后共长3 443 bp。采用GENSCAN 进行基因预测，
发现包含内含子在内的晚疫病抗性基因全长2 413 bp，在该预测基因 的UTR 区域设计特异性引物，在马
铃薯抗病和感病的基因型中扩增包含完整基因在内的2 571 bp 序列，发现该特异候选基因与晚疫病抗性相
连锁。     

甘蓝中硫氧还蛋白编码基因THL1的分子特性及表达研究

采用PCR和RT2PCR技术, 以‘E1’甘蓝基因组DNA和柱头cDNA为模板对THL1基因进行扩增克隆, 得到的片段长度分别为732 bp和455 bp。序列分析表明, 克隆的DNA和cDNA序列与甘蓝‘西园四号’THL1的DNA和cDNA同源性分别为97.9%和98.3%, 两条序列内含子的大小不同; 同时, 前者第2内含子不符合典型的GT2AG规则: 即第2个内含子3′端碱基为AT。将THL1基因cDNA序列定向克隆到原核表达载体pET-43.1a ( + ) , 构建融合表达质粒pET43.1a ( + ) -THL1, 在大肠杆菌BL21中表达出分子量为74kD的融合蛋白, 经胰岛素检测, THL1有氧化还原活性, 表明THL1在大肠杆菌中得到了正确表达。     

新疆红肉苹果PGIP基因的克隆及原核表达

【目的】研究克隆新疆红肉苹果[Malus sieversii f.neidzwetzkyana(Dieck)Langenf]PGIP基因并进行原核表达,探讨其抗病机制。【方法】根据Genbank中已经发表的‘金冠’苹果PGIP保守区域设计1对特异引物,以新疆红肉苹果叶片总RNA为模板,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段连接到原核表达载体pET30a(+)中,构建融合表达质粒,转化到E.coli BL21(DE3)中进行表达。【结果】序列分析表明,新疆红肉苹果PGIP基因cDNA编码区全长993 bp,编码330个氨基酸残基,命名为MsPgip,GenBank登录号为JQ001783。MsPgip分子质量为36.6 kD,等电点为7.05,有6个潜在的N-糖基化位点,信号肽为N端24个氨基酸残基。该蛋白质还具有2个连续的24个氨基酸残基大小的LRR基序(LSQLKNLTFLDLSFNNLTGAIPSSLSQ LPNLNALHLDRN-KLTGHIPIS)。与已克隆的‘澳洲青苹’、‘金冠’、‘富士’苹果PGIP氨基酸序列同源性均高达99%。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,表达蛋白的分子质量与预期一致。【结论】克隆了新疆红肉苹果PGIP基因,并可在大肠杆菌中表达。     

普通白菜1，5- 二磷酸核酮糖羧化/ 加氧酶小亚基基因BcrbcS 的克隆及表达分析

利用RACE 技术，从普通白菜抗霜霉病品种苏州青叶片克隆到1，5- 二磷酸核酮糖羧化/ 加氧酶小亚基（ribulose-1， 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit，BcrbcS）基因的全长cDNA 序列。采用qRT-PCR 分析该基因在普通白菜不 同组织的表达模式。利用SDS-PAGE 技术分析了该基因的原核表达特征。序列分析结果表明，BcrbcS 基因的cDNA 序列全 长为733 bp，其中开放阅读框长度为543 bp，共编码181 个氨基酸，分子质量为20.3×10³ Da，理论等电点为8.23。氨基酸 同源系统进化分析表明，普通白菜BcrbcS 基因与同科植物的进化关系相近。实时定量分析结果表明，BcrbcS 基因在普通白 菜叶中表达最强；在SA 和NaCl 处理下，BcrbcS 基因表达量均在处理24 h 后达到峰值。原核表达载体经IPTG 诱导表达出分 子质量约为20×10³ Da 的融合蛋白。     

鱼腥草糖基转移酶基因UGT75C1 的克隆及原核#br# 表达

 根据已经获得的鱼腥草UGT75C1 转录本序列设计1 对引物,采用RT-PCR 方法获得UGT75C1 基因cDNA 序列,并对UGT75C1 蛋白进行理化性质分析,并预测该蛋白功能;利用实时荧光定量PCR 方法检测了UGT75C1 基因在鱼腥草的地下茎、地上茎、叶、花中的表达情况,将克隆得到的UGT75C1 基因完整开放阅读框连接到原核表达载体pGEX4T-1 上,转化大肠杆菌E. coli BL21（DE3）,通过IPTG 诱导表达,SDS-PAGE 检测表达产物。克隆获得的UGT75C1 基因长为1 787 bp,开放阅读框1 461 bp, 编码486 个氨基酸。生物信息学预测UGT75C1 蛋白含跨膜区,不含信号肽,具有糖基转移酶的PSPG motif。 UGT75C1 在鱼腥草的叶片中表达丰度最高,其他器官中表达量相对较低,花中表达量最低;该基因原核 表达产物与预期大小一致,显示原核表达成功,为下一步研究其功能奠定了基础。     

鱼腥草糖基转移酶基因UGT75C1的克隆及原核表达

根据已经获得的鱼腥草UGT75C1转录本序列设计1对引物,采用RT-PCR方法获得UGT75C1基因cDNA序列,并对UGT75C1蛋白进行理化性质分析,并预测该蛋白功能;利用实时荧光定量PCR方法检测了UGT75C1基因在鱼腥草的地下茎、地上茎、叶、花中的表达情况,将克隆得到的UGT75C1基因完整开放阅读框连接到原核表达载体pGEX4T-1上,转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3),通过IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达产物。克隆获得的UGT75C1基因长为1 787 bp,开放阅读框1 461 bp,编码486个氨基酸。生物信息学预测UGT75C1蛋白含跨膜区,不含信号肽,具有糖基转移酶的PSPG motif。UGT75C1在鱼腥草的叶片中表达丰度最高,其他器官中表达量相对较低,花中表达量最低;该基因原核表达产物与预期大小一致,显示原核表达成功,为下一步研究其功能奠定了基础。     

结球甘蓝花粉膜联蛋白基因的克隆及其表达分析

 对结球甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L.）花粉总蛋白双向电泳及差异蛋白质谱分析, 发现膜联蛋白在花粉萌发后较萌发前表达下调。通过同源扩增和RACE 等方法首次在结球甘蓝花粉中扩增得到BoAnnexin2 基因的cDNA 序列,该基因cDNA 全长1 157 bp,开放阅读框为951 bp,编码316 个氨基酸残基,预测分子量为36.02 kD,等电点6.33。BoAnnexin2 编码蛋白C 端有4 个膜联蛋白重复序列,共2 个Ⅱ型钙结合区域,在第4 个钙结合区位点包含GXXXGXS（T）/DXXG 基序。实时荧光定量试验表明,BoAnnexin2 在甘蓝成熟未萌发花粉中的表达量是萌发45 min 后表达量的8 倍,表明BoAnnexin2 在甘蓝花粉萌发起始阶段起到重要调控作用。     

低氮胁迫下黄瓜钙依赖蛋白激酶基因的克隆及表达分析

在低氮胁迫下，以黄瓜品种津研4 号叶片为供试材料，以cDNA 为模板，依据黄瓜基因组数
据库中Csa002986 基因编码区全序列，应用Primer Premier 5.0 软件设计引物，克隆得到黄瓜钙依赖蛋白
激酶基因（calcium-dependent protein kinase，CDPK）。该基因全长1 584 bp，编码527 个氨基酸。预测
该基因编码的蛋白是一个稳定的亲水蛋白，无跨膜结构，无信号肽，存在蛋白激酶结合区、EF 手型钙结
合区、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点、N 酰基化位点等多个位点。CDPK 基因在不同氮浓度处理下黄瓜
各部位表达分析结果显示，在无氮条件下，CDPK 基因在茎尖表达量最高，其次为叶和茎；在低氮条件下，
CDPK 基因在茎中表达量最高，其次为茎尖和叶；在正常及高氮条件下，CDPK 基因在茎尖表达量最高，
其次为茎和叶。CDPK 基因在叶中的表达模式分析结果显示，在无氮及低氮胁迫下CDPK 基因表达量增加，
随着氮浓度的降低，CDPK 基因的表达量增加并明显高于对照；在高氮胁迫条件下，CDPK 基因的表达量
低于对照。     

番茄果实特异性LYC-B 干扰载体的构建及在不同颜色果实中的表达特异性验证

为了研究番茄LYC-B 干扰对类胡萝卜素合成主要酶和主要代谢产物的影响，构建了果实特异性的番茄红素β- 环
化酶LYC-B 干扰载体，并验证了其在不同颜色番茄果实中的有效性。依据X13437.1 扩增番茄果实特异启动子E8，构建了果
实特异性载体E8-pBI121，其在粉色、红色、绿色和紫色的番茄果实中均能表达。依据X86452.1 扩增番茄LYC-B 从61～861
bp 间长度为801 bp 的片段LYC-B1 和从 480～781 bp 间长度为302 bp 的片段 LYC-B2，构建了以CaMV 35S 为启动子的LYC-B
干扰表达载体pBI121-B1B2，以E8 替换CaMV 35S，构建了果实特异性干扰载体E8-pBI121-B1B2。采用农杆菌注射法分别
侵染番茄叶片和果实，GUS 染色显示，pBI121-B1B2 在叶片、果实和种子中均表达，E8-pBI121-B1B2 只在果实和种子中表达。     

甘蓝BYPASS1 编码基因的克隆与表达分析

通过双向电泳结合MALDI-TOF-TOF/MS 质谱技术在甘蓝柱头内鉴定出1 个受自花授粉诱导
上调表达的BYPASS1 蛋白（BPS1）。利用PCR 技术扩增甘蓝BPS1 基因的编码序列, 序列分析结果表明：
该基因没有内含子,开放阅读框为1 059 bp,编码352 个氨基酸,蛋白质分子量为38.7 kD。氨基酸同源
性和系统发生树分析结果表明：甘蓝BPS1 与拟南芥BPS1 亲缘最近,氨基酸同源相似性达85%;与烟草
BPS2 关系较远。RT-PCR 检测结果表明：甘蓝BPS1 基因在开花前1～2 d 的花瓣、萼片、花药、柱头和
叶片中均有表达,柱头中的表达量最高。实时荧光 定量PCR 分析结果表明：甘蓝柱头内BPS1 表达水平在
自花授粉后逐渐升高,异花授粉后柱头内BPS1 表达水平先升高后降低再升高。     

罗汉果葡萄糖基转移酶基因的克隆及原核表达

 从罗汉果（Siraitia grosvenorii）转录组中获得一条与罗汉果甜苷Ⅴ生物合成相关的葡萄糖基转移酶（UDPG）的unigene片段,以罗汉果授粉后70 d的果实RNA为模板,利用RACE和RT-PCR技术克隆UDPG全长基因,将克隆得到的SgUDPG1基因连接到原核表达载体pEASY-E1上,构建融合表达载体,转化到大肠杆菌BL21（DE3）,通过IPTG诱导表达,重组蛋白纯化,SDS-PAGE检测表达产物以及Western-blotting和质谱鉴定蛋白产物。结果表明,获得了1条SgUDPG1,全长为1 959 bp,开放阅读框ORF为1 365 bp,编码1条454 aa的肽链,理论分子量为51.2 kD,等电点为5.39,具有植物中次生代谢产物糖基转移酶特有的保守结构域PSPG-box motif。SgUDPG1在授粉后50 d和70 d的果实中表达逐渐升高,是对照授粉后3 d的5.16倍和13.12倍,与果实中甜苷Ⅴ含量呈相同趋势。此基因的ORF可以在大肠杆菌中表达,并且可以纯化出比理论分子量大5.3 kD的融合蛋白,通过Western-blotting和质谱鉴定,确定该蛋白属于罗汉果葡萄糖基转移酶。     

甘蓝自交不亲和相关转录因子BosiPA1 蛋白基因的克隆与表达分析

 通过自交不亲和甘蓝‘A1’自花授粉1 h 和未授粉柱头蛋白质表达谱的对比,鉴定出1 个受 自花授粉诱导上调表达的蛋白,通过PCR 技术获取了其编码序列,命名为BosiPA1 蛋白,其基因全长为 3 730 bp,具有1 个1 092 bp 的完整编码框（KF314579）。BosiPA1 由6 个外显子、5 个内含子组成,编码 363 个氨基酸。序列分析表明BosiPA1 蛋白具有典型的basic helix-loop-helix（bHLH）功能域,在SCR、SRK、 Exo70A1 基因的ATG 上游启动子序列中存在可以被bHLH 功能区识别并结合的E-box（CANNTG）序列。 在分子进化上甘蓝BosiPA1与AtbHLH128 距离最近,与AtHEC1/2/3 和TgGBOF-1 处在同一个分支。RT-PCR 检测表明甘蓝BosiPA1 基因在花瓣、萼片、花粉、柱头和叶片中均有表达;荧光定量PCR 分析表明BosiPA1 基因在自花授粉10 min、30 min、1 h 的柱头中呈逐渐上升趋势。上述结果说明BosiPA1 与bHLH 的进化 分支较早,可能是一个参与甘蓝多器官发育的自交不亲和相关的转录因子。     

马铃薯卷叶病毒缺失突变CP基因的原核表达及抗血清的制备

 利用RT-PCR扩增马铃薯卷叶病毒（PLRV）外壳蛋白（CP）基因（PLRV-CP）,回收大小约630 bp的特异性扩增片段并进行T-A克隆,测序表明该基因长度为627 bp,与已报道的36个PLRV-CP基因的核苷酸序列的同源性大于96%。以pBAD/Thio-TOPO为起始载体,构建了PLRV-CP基因的原核表达载体pBAD-LRCP。以pBAD-LRCP为模板,用PCR法删除了该基因富含精氨酸稀有密码子的第52 ~ 177核苷酸,获得了PLRV缺失突变CP基因的原核表达载体pBAD-LRCP-126。用阿拉伯糖诱导工程菌TOP10（pBAD-LRCP-126）,获得了34 kD的诱导表达的融合蛋白（重组CP）。用镍离子亲和层析法从包涵体中纯化出了高纯度的重组CP,用纯化的重组CP作抗原免疫家兔获得了PLRV特异性的抗血清,间接ELISA检测显示效价为1︰12 800。本研究结果为利用重组CP作抗原大量制备PLRV抗血清奠定了基础。     

筇竹CBF1基因的原核表达和多克隆抗体的制备

以筇竹（Qiongzhuea tumidinoda Hsueh et Yi）叶片为试材,采用RT-PCR方法克隆其CBF1基因,并将CBF1连接到原核表达载体pET32a（+）上,经克隆测序确定所构建的重组载体pET32-QZ开放阅读框正确。将重组载体pET32-QZ转化大肠杆菌Rosetta2（DE3）菌株,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE凝胶电泳,考马斯亮蓝染色,证明CBF1蛋白得到了高效表达,所表达蛋白是大小约为45 kD的融合蛋白。经镍柱纯化后作为抗原免疫家兔,制备CBF1蛋白特异性抗血清。所制备的多克隆抗体能够与融合蛋白和经冷诱导的筇竹叶片总蛋白在25 kD处出现杂交条带。上述结果表明,表达的目的蛋白可用于免疫组织化学、蛋白质印迹检测。     

芋淀粉合成酶AGPase基因的克隆及表达分析

通过对‘靖江香沙芋’转录组数据进行功能注释,克隆获得‘靖江香沙芋’淀粉合成酶AGPase的基因,序列全长为1 596 bp,命名为CeApS1（NCBI：Colocasia KU288757,未公布）。该基因编码532个氨基酸,蛋白含有1个NTP_transf_3结构域（Gly¹⁰⁴ ~ Pro³⁰⁶）和1个PbH1结构域（Gly⁴⁷³ ~ Ser⁵¹⁵）,编码产生AGPase小亚基,等电点和分子量分别为6.73和57.6 kD。ApS1在单子叶和双子叶植物中广泛存在,CeApS1与紫萍（AIZ00992.1）中相应蛋白的亲缘关系最近,相似性为83.4%,与草莓（AAS00541.1）、苜蓿（XP_003617925.1）、水稻（AAK27313.1）和小麦（CAA46879.1）等植物中相应蛋白的亲缘关系较远。CeApS1在‘靖江香沙芋’的母芋和子孙芋中表达量较高,在叶片、叶柄和根中低表达。芋球茎中的CeApS1表达水平与球茎发育密切相关,在播种160 d后达到最大值。该基因的表达模式与球茎淀粉含量的积累显著正相关。     

马铃薯卷叶病毒CP基因水溶性原核表达的研究

采用两种策略增强了马铃薯卷叶病毒(PLRV)CP基因的水溶性原核表达。首先,用5种可表达出分子伴侣的质粒分别转化重组菌TOP10(p BAD-LRCP),获得了既含p BAD-LRCP又含分子伴侣质粒的转化子;诱导转化子中PLRVCP基因与分子伴侣基因同时表达,SDS-PAGE结果表明,从转化子提取的水溶性蛋白中有明显的PLRV重组CP条带,即分子伴侣增进了重组CP的水溶性表达。其次,将PLRV-CP基因定向插入p ColdⅠ中构建了该基因的冷激诱导原核表达载体p Cold-LRCP,15℃、IPTG诱导24h,SDS-PAGE分析表明,从重组菌BL21(p Cold-LRCP)提取的上清蛋白中有明显的PLRV重组CP条带。试验结果表明,分子伴侣与冷激蛋白基因csp A的启动子均可提高PLRV-CP基因的水溶性表达,且后者的表达水平高于前者。     

桃果实PpSIZ1基因对低温和外源褪黑素处理的响应

为了探索SUMO E3连接酶（SIZ1）基因与桃（Prunus persica L. Batsch）果实采后低温贮藏期间冷害发生的关系,对桃基因组中的SIZ1基因进行生物信息学分析,同时采用qRT-PCR分析该基因在‘湖景蜜露’桃果实低温贮藏以及外源褪黑素减轻冷害进程中的表达特征。结果表明,PpSIZ1开放阅读框全长2 637 bp,编码878个氨基酸组成的蛋白质多肽。进化树分析发现,PpSIZ1与梅PmSIZ1的同源性最高,含有与拟南芥AtSIZ1相似的SAP、PHD、PINIT、SP-RING和SXS保守结构域,属于SUMO E3连接酶家族。qRT-PCR分析表明,低温（0 ℃）胁迫能诱导桃果实PpSIZ1表达水平的提高;100和200 μmol · L^-1褪黑素处理能显著减轻桃果实低温贮藏期间冷害的发生,其中100 μmol · L^-1褪黑素处理抑制冷害的效果最好,这种效果可能与PpSIZ1介导的SUMO化有关。