鸡血藤ISSR反应体系的建立与优化

为建立鸡血藤ISSR-PCR的优化反应体系,通过选用DNA模板量、Mg2+、Taq DNA聚合酶、d NTP、引物浓度等5个因素中各单因素的适宜浓度,利用正交试验方法,在5个因素4个水平条件下进行优化。结果发现,鸡血藤ISSR-PCR的最佳25μL PCR反应体系中含10×PCR buffer 2.50μL、DNA模板量70.00 ng、Mg2+1.50 mol/L、Taq DNA聚合酶1.50 U、d NTP 0.30 mmol/L,引物浓度0.35μmol/L。为鸡血藤种质资源遗传多样性的进一步研究奠定分子基础,也为同科属植物的种质资源遗传多样性研究提供参考。     

大叶石上莲ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为建立并优化大叶石上莲(Oreocharis benthamii)ISSR-PCR反应体系,采用改良的CTAB法提取大叶石上莲叶片DNA,利用正交试验设计方法,从Mg~(2+)、d NTP、引物、Taq DNA聚合酶以及模板DNA 5因素4水平,对大叶石上莲ISSR-PCR反应体系进行优化,确立了适用于大叶石上莲的扩增多态性高、稳定性强、条带清晰的ISSR最佳反应体系:2.0μL的10×PCR缓冲液,2.0 mmol/L Mg~(2+),0.25 mmol/L d NTP,0.7μmol/L引物,2.0 U TaqDNA聚合酶,30 ng DNA模板(20μL反应体系)。在此基础上,从100条引物中筛选出13条ISSR扩增引物,其中5条引物最为合适并已确定其最佳退火温度。     

葡萄ISSR-PCR反应体系的建立与正交设计优化

建立和优化稳定的葡萄ISSR-PCR反应体系,为进一步开展葡萄遗传多样性研究和品种选优提供理论依据。运用改良的CTAB法从葡萄嫩叶中提取基因组总DNA,通过单因素试验分析d NTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度、DNA模板用量、Taq DNA聚合酶用量等5个因素对葡萄ISSR-PCR反应体系扩增结果的影响,并采用正交设计试验方法优化建立葡萄ISSR-PCR最佳反应体系。优化的最佳ISSR-PCR反应体系(20μL)为:10×PCR buffer、0.225 mmol/L d NTPs、Taq DNA聚合酶1.0 U、1.00μmol/L引物、2.75 mmol/L Mg2+、DNA模板30 ng。利用优化的ISSR-PCR反应体系能够扩增获得清晰、稳定的DNA条带,可用于后续的葡萄种质资源遗传多样性分析。     

白花蛇舌草ISSR反应体系的建立与优化

通过单因素考察结合正交试验的方法,基于反应体系中Taq DNA聚合酶量、DNA模板用量、d NTPs浓度、引物浓度、Mg2+浓度等5因素4水平条件对ISSR反应体系进行优化。白花蛇舌草ISSR-PCR的20μL最佳反应体系为引物浓度0. 562 5μmol/L,Mg2+浓度2. 75 mmol/L,d NTPs浓度0. 375 mmol/L,DNA模板量60 ng,Taq DNA聚合酶1. 25 U,2. 0μL 10×Taq Buffer,其余用dd H_2O补齐。该试验建立并优化了白花蛇舌草ISSR-PCR反应体系,为白花蛇舌草种质资源遗传多态性的研究提供参考依据。     

濒危植物蒙古扁桃ISSR反应体系优化

为利用简单重复序列区间(inter simple sequence repeat,简称ISSR)技术研究蒙古扁桃资源遗传多样性评价和种质资源鉴定,利用正交试验法进行L_(16)(4~5)正交设计,从Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq聚合酶活性和模板DNA质量5种因素和4个浓度水平来优化蒙古扁桃ISSR-PCR反应体系。结果表明,最佳反应体系如下:在25μL反应体系中加入2.0 U Taq聚合酶,引物浓度0.80μmol/L,Mg~(2+)浓度2.0 mmol/L,dNTPs浓度0.25 mmol/L,模板DNA质量50 ng。对蒙古扁桃ISSR-PCR反应影响程度排序依次为Taq聚合酶活性引物浓度Mg~(2+)浓度dNTPs浓度模板DNA质量。     

雷公藤ISSR反应体系的建立与优化

[目的]建立适合雷公藤的ISSR-PCR反应体系,为雷公藤种质资源的亲缘关系鉴定和遗传多样性分析提供技术支持.[方法]采用单因素试验设计优化影响雷公藤ISSR-PCR扩增效果的Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+、引物浓度和DNA模板含量及退火温度,并以32份雷公藤样品对优化的ISSR-PCR反应体系进行验证.[结果]优化的雷公藤种质资源ISSR-PCR反应体系为:20.00μL反应液中含1.50 U Taq DNA聚合酶、0.30 mmol/L dNTPs、2.00 mmol/L Mg2+、0.40μmol/L引物、20 ng DNA模板和2.00μL 10×Buffer.ISSR-PCR扩增程序中最佳退火温度为54.7℃.[结论]建立优化的雷公藤ISSR-PCR反应体系具有较高的稳定性、重现性和适用性,可应用于雷公藤不同地理种源间的遗传多样性鉴定.     

珍稀濒危植物宝华玉兰ISSR-PCR反应体系建立及优化

为建立和优化宝华玉兰(Magnolia zenii Cheng)ISSR-PCR反应体系,采用正交试验和单因子试验方法对影响PCR扩增体系中的Mg~(2+)、d NTPs、DNA模板、引物和Taq聚合酶一定浓度的用量5个因子进行分析比较。结果显示,宝华玉兰ISSR-PCR 25μL反应体系中的5个因子最佳水平分别为DNA模板(20 ng/μL)3.5μL,引物(10μmol/L)1.25μL,Taq聚合酶(5 U/μL)0.2μL,Mg~(2+)(25 mmol/L)2.0μL,d NTPs(2.5 mmol/L)0.8μL。宝华玉兰ISSR-PCR反应的最优体系建立,为进一步利用ISSR对其进行分子标记辅助育种、分子身份证构建和遗传多样性分析等后续研究奠定了基础。     

吴茱萸ISSR-PCR反应体系优化

[目的]建立吴茱萸ISSR-PCR最佳反应体系。[方法]采用改良的CTAB法提取吴茱萸基因组DNA,研究模板DNA、dNTPs、Mg^2＋、引物（U834）、Taq DNA聚合酶的浓度对ISSR-PCR扩增结果的影响。[结果]20μl反应体系中含2μl 10×PCR buffer,0.15 mmol/LdNTPs,1.6 mmol/L Mg^2＋,0.4 mmol/L引物,20 ng模板DNA,1.2 U Taq DNA聚合酶。[结论]为研究吴茱萸种质资源遗传多样性和分子鉴定奠定了技术基础。     

正交设计构建陕北山杏ISSR反应体系

[目的]构建陕北山杏ISSR-PCR反应体系。[方法]以陕北山杏为试材,采用CTAB法提取其幼叶基因组DNA,利用正交设计L9(34)对山杏ISSR-PCR反应体系的4个因素(Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶)在3个水平上进行试验,最后应用SPSS统计软件对PCR结果进行分析。[结果]试验表明,各因素的不同水平对PCR反应体系结果都有显著影响,其中Taq DNA聚合酶用量影响最显著;建立了适合陕北山杏ISSR-PCR的最佳反应体系(20μl):Taq DNA聚合酶1.0 U、MgCl21.0 mmol/L、dNTPs 0.15 mmol/L、引物0.30μmol/L;对最佳反应体系进行验证,结果显示该体系稳定性好,操作性强。[结论]该研究为陕北山杏遗传多样性分析及种质资源研究等奠定了基础。     

黔产苦参ISSR-PCR反应体系正交优化研究

[目的]确定适合苦参稳定的ISSR-PCR反应体系。[方法]采用经典的CTAB法提取苦参新鲜幼嫩叶片DNA;针对Mg2+、d NTPs、引物、模板DNA和Taq DNA聚合酶进行正交设计L_(16)(4~5),优化黔产苦参ISSR-PCR反应体系。[结果]最适ISSR-PCR反应体系为:模板DNA 90 ng、0.4μmol/L引物、2.0 mmol/L Mg~(2+)、TaqDNA聚合酶0.5 U、0.5 mmol/L d NTPs。[结论]建立的苦参ISSR-PCR反应体系,经过19份苦参样品检验,证明该体系稳定可靠,可用于苦参遗传多样性分析。     

正交设计优化油松ISSR-PCR反应体系

采用正交设计的方法对油松ISSR-PCR反应体系5因素(Taq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物的浓度)在4水平上进行优化试验,PCR结果用SPSS数据软件分析。结果表明:各因素不同水平对PCR反应结果都有显著的影响,且除dNTP因素外其他4因素影响均较大;筛选出各反应因素的最佳水平,建立油松ISSR-PCR的最佳反应体系(20μL)为:Taq DNA聚合酶1 U、模板5μg/μL、Mg2+2.0 mmol/L、dNTP 0.20 mmol/L、引物0.4μmol/L;进行梯度退火试验,筛选出针对不同引物的最适的油松ISSR退火温度。该优化体系的建立为油松及其近缘种的系统学和种质资源鉴定及遗传多样性的研究奠定基础。     

正交设计优化荷花品种ISSR-PCR反应体系

以东方明珠荷花为试验材料,应用L9(34)正交设计,探讨反应体系中引物、Taq DNA聚合酶等4个不同因素的3个水平对荷花品种反应体系的影响,正交设计所用引物为UBC843,PCR结果应用MINITAB软件进行方差分析和极差分析。结果表明,荷花最佳ISSR-PCR反应体系(25μL):2.5μL 10×buffer,2.0 mmol/L Mg2+,0.20 mmol/L d NTPs,0.40μmol/L引物,20~80 ng模板DNA,1.00 U Taq DNA聚合酶。优化的ISSR-PCR反应体系稳定性高、重复性较好,为从分子水平对荷花品种进行各项研究奠定了基础。     

褐苞薯蓣ISSR-PCR反应体系的建立与优化

通过单因素考察结合正交试验的方法,基于反应体系中Taq DNA聚合酶量、DNA模板用量、dNTPs浓度、引物浓度、Mg~(2+)浓度等因素对简单重复序列间扩增(ISSR)反应体系进行优化。结果表明,褐苞薯蓣ISSR-PCR的20μL最佳反应体系为Taq DNA聚合酶1. 875 U,DNA模板量52. 5 ng,d NTPs浓度0. 25 mmol/L,引物浓度0. 437 5μmol/L,Mg~(2+)浓度1. 5 mmol/L,10×Taq Buffer 2. 0μL,其余用dd H_2O补齐。     

安祖花ISSR-PCR反应体系的优化和确立

为建立适宜安祖花DNA的ISSR-PCR扩增体系,采用单因子试验对影响ISSR-PCR反应的各组分(Taq DNA聚合酶、模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+浓度)进行了优化,确立了适合安祖花的条带清晰、多态性高、重复性好的最佳ISSR-PCR反应体系,即在20μL PCR反应体系中含有10×PCR Buffer 2.0μL、25 mmol/L MgCl21.2μL、10 mmol/L dNTPs 0.8μL、5 U/μL Taq酶0.2μL、10μmol/L引物3.0μL、20 ng/μL模板2.0μL;并利用2条引物对15个安祖花品种进行了稳定性鉴定,为安祖花的遗传多样性分析及育种工作提供技术支持。     

基于单因素试验的大豆CDDP-PCR反应体系优化

[目的]优化大豆CDDP-PCR反应体系。[方法]采用单因素试验方法对影响大豆CDDP-PCR反应的Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶用量、引物浓度、d NTPs浓度和模板DNA用量等因素进行优化。[结果]优化后的大豆CDDP-PCR体系为:Mg2+浓度2.0 mmol/L、Taq聚合酶用量1.5 U、引物浓度0.375μmol/L、d NTPs浓度0.3 mmol/L、DNA模板用量40 ng。运用24个大豆品种验证了该反应体系稳定、可靠。[结论]该反应体系的建立为大豆种质遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建及分子标记辅助育种奠定了基础。     

大豆孢囊线虫ISSR反应体系的建立与优化

采用正交设计对大豆孢囊线虫ISSR-PCR反应体系的4因素(Taq酶、模板DNA、d NTPs、引物),在4个用量水平上进行优化试验。结果表明:大豆孢囊线虫ISSR-PCR的最佳反应体系为在25μL反应体系中,含Taq DNA聚合酶(5 U/μL) 0. 34μL、模板DNA 1. 2μL、d NTPs(2. 5 mmol/L) 1. 5μL、引物(10μmol/L)0. 8μL、10×PCR Buffer 2. 5μL。引物PTY26最适退火温度为55℃。用引物PTY188和PTY888对大豆孢囊线虫最佳ISSR-PCR的反应体系进行验证,结果表明该反应体系和程序有较好的重复性和稳定性。     

黄芪ISSR-PCR反应体系的建立及优化

为获得最优黄芪ISSR-PCR反应体系,以山西省浑源县官儿乡蒙古黄芪为试验材料,利用单因素试验法对反应体系中的4个因素(模板DNA,dNTPs,Taq DNA聚合酶,ISSR引物)分别设置浓度梯度进行体系优化。结果表明,20μL黄芪ISSR-PCR最优体系为:模板DNA质量浓度6.0 ng/μL,dNTPs浓度0.03 mmol/L,Taq DNA聚合酶浓度0.05 U/μL,引物浓度0.80 mmol/L。最后用不同产地的黄芪检测该体系,结果发现,PCR产物多态性良好。优化体系的确立为今后黄芪种质资源的分子评价奠定了技术基础。     

叶子花SSR-PCR体系的优化

[目的]优化叶子花SSR-PCR体系。[方法]以乔木叶子花为材料,通过Touchdown PCR扩增程序和正交试验,对影响叶子花SSR-PCR体系的引物浓度、Taq DNA聚合酶用量、Mg2+浓度和d NTPs浓度进行优化。[结果]叶子花20μl SSR-PCR体系的最优条件为引物浓度0.4 mmol/L、Taq DNA聚合酶用量1.5 U、Mg2+浓度1.5 mmol/L、4种d NTPs浓度均为0.15 mmol/L,模板100 ng左右。[结论]该反应体系的扩增条带清晰、稳定、重复性好,可用于后续叶子花遗传多样性分析和种质资源鉴定等研究。     

梨属野生种质资源SRAP-PCR反应体系优化研究

采用正交直观分析法和新复极差法对影响梨属野生种质资源SRAP-PCR反应的5种因素(Mg2+浓度、d NTPs浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶、模板DNA)4个水平进行优化筛选。结果表明,优化后的梨属SRAP-PCR反应体系为25μL,包括10×PCR buffer 2.5μL,2.0 mmol/L Mg2+,200μmol/L d NTPs,0.4μmol/L引物,1.5 U Taq酶,60 ng模板DNA。     

沙地云杉ISSR-PCR反应体系的初步优化

以沙地云杉叶基因组DNA为材料,采用单因素试验方法对ISSR-PCR体系中的主要成分Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物浓度、退火温度进行筛选,建立并优化沙地ISSR-PCR反应体系。结果表明,UBC835是最适引物,适宜退火温度为50℃。沙地云杉ISSR-PCR分析的最适反应体系(20μL PCR反应体系)为:2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、0.25μmol/L引物、50 ng/μL模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性4 min;94℃变性45 s,50℃退火45 s,72℃延伸2 min,40个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。