鲤鱼cDNA-AFLP技术反应体系的建立

将cDNA扩增片段长度多态性（cDNA-amplified fragment length polymorphism）技术应用在鲤鱼基因的转录表达研究中,本文通过对cDNA-AFLP主要步骤的优化和改进,建立起鲤鱼cDNA-AFLP反应体系。结果表明,采用MseⅠ和BstYⅠ酶切鲤鱼cDNA100ng,分别处理2h和3h后,以接头浓度分别为2pmol/μL和0.2pmol/μL、T4连接酶浓度为0.12U/μL的反应体系进行连接。以稀释50倍的预扩增产物为模板、BstYⅠ和MseⅠ比例为1：4的引物配比进行选择扩增可得到稳定的扩增结果。本研究建立的cDNA-AFLP技术将为鲤鱼转录组研究建立基础和技术支持。     

栽培种花生AFLP标记体系的优化及多态性引物筛选

为建立并优化适合花生的EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ内切酶组合的AFLP标记技术体系,本试验对花生基因组DNA大样提取方法、双酶切反应、连接体系、预扩增和选择性扩增等影响因素进行反复调试与优化,并对适合花生AFLP分析的引物组合(E/M)进行多态性筛选。结果表明,高质量的模板DNA提取采用改进的SDS-CTAB法,DNA样品的浓度在150~200 ng·μL~(-1),37℃双酶切3.0 h,接头浓度为50pmol·μL~(-1),T4-DNA连接酶浓度为10 U·μL~(-1),16℃连接10 h。以2×Es Taq MasterMix(含有Es Taq DNA Polymerase,3 mmol·L~(-1)MgCl_2和400μmol·L~(-1)d NTP)作为PCR反应原料,其中,预扩增反应体系为50μL,预扩增引物(E00和M00)的浓度为50 ng·μL~(-1),预扩增产物最适稀释倍数为20倍;选择性扩增反应体系为20μL,扩增产物中加入10μL Loading Buffer,经95℃变性10 min后,立刻转移到冰浴中冷却备用。最终,从225对AFLP引物组合中,筛选出稳定且多态性丰富的42对引物组合,可用于后期作图群体基因型检测和种质资源遗传多样性分析。本研究结果为下一步构建花生高密度遗传连锁图谱和开展分子标记辅助育种奠定了基础。     

吉富罗非鱼AFLP反应体系的建立与优化

本文以我国水产养殖主导品种吉富罗非鱼(farmed tilapia)为研究材料,进行扩增片段长度多态性(AFLP)反应体系的研究,初步建立了一套适合罗非鱼的AFLP反应体系。对体系中关键环节的优化结果如下:基因组DNA要求无降解和RNA污染,OD260/OD280比值在1.8~2.0之间;基因组DNA EcoRⅠ/MseⅠ37℃双酶切6h、20℃连接20h,连接产物10倍稀释,PCR预扩增产物稀释45倍作为选择性扩增的模板,选择性扩增产物经6%变性丙烯酰胺凝胶电泳检测可获得条带清晰、背景干扰小的图像。该体系的构建为今后进行罗非鱼群体遗传多样性分析、种质鉴定、重要经济性状分子标记的开发及遗传连锁图谱构建等方面研究提供了参考。     

NaCl胁迫下珠眉海棠苹果中Na~+的组织细胞定位研究

本试验研究了水培条件下NaCl胁迫下珠眉海棠苹果组织细胞中Na+的分布及可能的耐盐机制。结果表明 :在一定NaCl胁迫浓度范围内 ,根系中Na+浓度高于地上部 ,根系对Na+有一定的再吸收作用 ,这是珠眉海棠耐盐的重要机制 ;当NaCl胁迫浓度达到一定阀值后 ,根、叶细胞Na+大量积累 ,当细胞液泡不再接纳Na+时 ,Na+大量积累于胞质和质外体 ,使质外体渗透势大大降低 ,胞质水分外流 ,破坏细胞膜系统和胞质新陈代谢 ,造成伤害。     

根瘤菌RAPD引物筛选及条件优化

用改良的SDS-CTAB酶裂解法提取了根瘤菌基因组DNA的模板,从100个10bp的随机引物中筛选出了16条在20个菌株上均能扩增出清晰的片段。应用L16(45)正交表研究了DNA模板、Mg2+、Taq酶d、NTPs和引物浓度对扩增迁移率重现性的影响,用这种方法建立的根瘤菌RAPD-PCR优化反应体系为:20μl体系中含2.5mg/L的DNA模板、2.00mmol/L的Mg2+、1.00U的Taq酶、0.05mmol/L dNTPs、0.35μmol/L随机引物。     

苦瓜AFLP分子标记反应体系的建立

利用AFLP分子标记技术,采用MseI/EcoRI酶切组合,从64对引物中筛选出6对带型分布均匀、多态性高且分辨能力强的引物,分别为:E1/M5、E4/M8、E6/M4、E7/M5、E7/M7、E8/M3,并确定了适用于苦瓜AFLP反应的最佳酶切-连接、预扩增和选择性扩增反应体系,从而为今后利用AFLP分子标记技术对苦瓜进行深入研究打下基础。     

枣SRAP-PCR体系的正交优化研究

采用正交试验设计的方法,建立了枣SRAP分析的优化反应体系,即20µL反应体系中含有1×buffer,dNTP 200µmol/L、引物各30ng、MgCl2 2.5mmol/L、Taq酶1.0U和模板DNA 20ng。适宜的扩增条件为94℃预变性5min;94℃变性1min,33℃复性1min,72℃延伸1min,5个循环;94℃变性1min,53℃复性1min,72℃延伸1min,30个循环;最后72 ℃延伸5min。本研究建立的枣SRAP 体系重复性好,稳定性强。     

Gateway^TM系统快速构建番木瓜环斑病毒CP基因反向重复序列表达载体

设计含有attB侧翼序列的引物,用于番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus)的外壳蛋白基因(CP)基因的PCR扩增.在BP重组酶的作用下,将CP基因与受体载体pDONRTM221发生重组反应,产生入门克隆.在LR重组酶作用下,将入门克隆与目的载体pHellsgate12发生重组反应,再进行平板培养筛选及PCR扩增和酶切反应.结果证明,用限制性内切酶Xho I酶切消化后,琼脂糖凝胶电泳获得了预期长度为1700 bp的重组片段;以启动子和外壳蛋白基因及外壳蛋白基因和终止子序列为基础,分别设计2对引物,经PCR扩增分别获得582和773 bp片段.结果表明,获得了含有内含子的CP基因反向重复结构的表达载体.     

杨树ISSR反应体系的建立及正交设计优化

采用正交设计的方法,对杨树ISSR-PCR反应中5个因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP和引物)在4个水平上进行优化试验。建立了适合杨树的既稳定又能扩出最多数量谱带的ISSR-PCR最佳反应体系,即25μl的反应体系中含有1×buffer,0.12mmol/L dNTP,0.4μmol/L引物,3.5 mmol/L Mg2+,1.5UTaqDNA聚合酶和40ng模板DNA。对杨树ISSR-PCR最佳反应体系的退火温度进行梯度试验,发现引物W95142的最适退火温度为56.1℃,且最适退火温度因引物而异。这一优化的ISSR-PCR反应体系的建立为今后利用ISSR技术进行杨树种质资源分类、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。     

氮源比例和不同碳源对珠美海棠离体叶片再生不定芽的影响

摘要：以珠美海棠（Malus zumi Mats）苗叶片为试材,对影响离体叶片再生的因素进行了研究。结果表明：培养基的成分可以显著地影响叶片再生。在激素组合中,BA浓度变化对再生影响较小,而NAA浓度的变化影响较大。MS培养基氮源中,NO3-与NH4+比例以2∶1最好（2∶1MS,即常规MS）,3∶1MS和4∶1MS次之,1∶1MS最差。4种碳源（果糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇）中,果糖明显优于其它3种。适宜的培养基组成为：MS盐、维生素,BA（2.5 mg/L）+NAA（0.25 mg/L）,果糖（30 g/L）,琼脂8 g/L,pH 5.8。叶片再生率为97%,平均再生芽数为5.6个。对碳源影响再生的可能原因进行了讨论。     

盐胁迫下珠美海棠体内离子分配与叶片耐盐量研究

对NaCl胁迫下珠美海棠体内K~ 、Na~ 、Cl~-含量变化及电解质渗透率测定结果表明,NaCl胁迫下珠美海棠对K~ 的吸收及向地上部分运输能力基本保持不变,K~ 、Na~ 、C1~-含量随盐胁迫浓度的增加而显著增加,Cl~-向地上部分运输的能力大于K~ 、Na~ ,Na~ 对珠美海棠的伤害远远大于Cl~-,叶片耐Na~ 量为5.76g/kg,耐Cl~-量为14.17g/kg。     

淀粉凝胶与植物组织培养II.玉米淀粉凝胶培养基对苹果砧木组培生根诱导的同步化作用

珠美海棠和M26苹果矮化砧木分别在琼脂培养基和玉米淀粉（corn starch）凝胶培养基上进行生根培养，结果玉米淀粉培养基不但提高了两种植物的生根率，而且对生根诱导具有同步化效应。珠美海棠生根苗游离氨基酸含量的高效液相色谱（HPLC）分析表明，琼脂生根培养基上，吲哚丁酸（IBA）诱导了天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、苏氨酸、色、蛋氨酸和谷氨酰胺、丙、酪氨酸的降低，但却提高了精氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和鸟氨酸的含量。当玉米淀粉替代琼脂后，玉米淀粉培养基不但进一步促进了上述氨基酸含量的降低，而且抑制了精氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等的升高。     

猪基因组AFLP指纹图谱的构建

摘要：对猪（Sus scrofa）基因组AFLP指纹图谱构建的各项条件进行了优化,包括双酶切消化、接头连接、预扩增和选择性扩增、凝胶电泳银染技术及荧光标记检测法等,建立了稳定的猪基因组DNA的AFLP指纹图谱构建方法,采用E32/T32引物组合在45个猪种基因组混合DNA中检测到28个多态标记。     

淀粉凝胶与植物组织培养I.玉米淀粉凝胶培养基对苹果砧木组培分化和生长的影响

本文报告了玉米淀粉凝胶取代琼脂凝胶组培苹果砧木珠美海棠和M26的研究结果，发现玉米淀粉凝胶培养基不但使组培成本降低30%以上，而且能提高两种植物的生根率达34%和生根诱导的同步性，生根培养时间明显缩短。在增殖培养中玉米淀粉凝胶培养基能明显促进M26砧木的芽分化和生长，叶片宽度增加和叶色加深，但株美海棠增殖培养初期芽苗高生长受到抑制，茎粗显著增加，绿色加深。     

龙眼成花逆转相关基因表达的cDNA-AFLP分析

摘要：以龙眼正常成花花芽和成花逆转花芽为试材,应用cDNA-AFLP技术,研究龙眼正常成花与成花逆转花芽cDNA的差异表达,并利用RT-PCR技术验证,探讨了龙眼成花逆转的分子机制。通过64对引物组合的cDNA-AFLP分析获得了2 560条扩增片段。选择其中有明显差异的片段进行回收、测序,获得了14条核苷酸序列。其中有13个片段在GenBank数据库中发现同源序列,1个功能未知。通过核酸和氨基酸比对分析,与龙眼成花逆转相关的112基因片段同源于银灰杨（Populus tremula x Populus alba）中编码Nek激酶家族(NIMA related protein kinases)基因（83 ％）, 331的核苷酸序列（80％）同源于与拟南芥（Arabidopsis thaliana）中编码内切-1,4-β-葡聚糖酶(EGases)的基因,313的核苷酸序列（78%）同源于与柑橘（Citrus sinensis）中的几丁质酶（chitinase CHI1）基因。     

Identification of PCR-amplified genetically modified organisms (GMOs) DNA by peptide nucleic acid (PNA) probes in anion-exchange chromatographic analysis

PCR products obtained by selective amplification of transgenic DNA derived from food samples containing Roundup Ready soybean or Bt-176 maize have been analyzed by anion-exchange HPLC. Peptide nucleic acids (PNAs), oligonucleotide analogues known to bind to complementary single-stranded DNA with high affinity and specificity, have been used as specific probes in order to assess the identity of the peaks observed. Two different protocols were adopted in order to obtain single-stranded DNA: amplification with an excess of one primer or digestion of one DNA strand. The single-stranded DNA was mixed with the PNA probe, and the presence of a specific sequence was revealed through detection of the corresponding PNA:DNA peak with significantly different retention time. Advantages and limits of this approach are discussed. The method was tested with reference materials and subsequently applied to commercial samples.     

太空诱变玉米核雄性不育材料的cDNA-AFLP分析

利用cDNA-AFLP技术对太空诱变玉米核雄性不育材料的花药进行差异表达分析,并对差异片段进行回收、克隆和测序,结合半定量RT-PCR方法,分析差异片段在可育株和不育株的表达情况。利用16对引物共回收得到9个差异序列,其中2个为来自不育株的特有片段,7个为来自可育株的特有片段。序列分析发现,来自不育株的 2个EST序列未检测到同源性较高的序列。来自可育株的4个EST序列分别与水稻上推断的查尔酮合成酶、脂酰CoA脱氢酶、蛋白激酶PK12、甘氨酸脱羧酶具有较高的同源性。这些物质可能参与小孢子发育过程中的物质代谢、能量代谢及信号传导等。半定量RT-PCR分析表明,与查尔酮合成酶同源性较高的Z3片断在可育花药发育的早期有较高的表达。而与甘氨酸脱羧酶同源性较高的片断Z8在可育花药发育的中间阶段呈增量表达。这可能与花药发育过程有较高的能量和物质需求有关。