棉花真叶原生质体分离及瞬时表达体系的优化

【目的】真叶细胞能模拟植物内源条件,建立基于棉花真叶原生质体的高效瞬时表达体系,为快速有效研究棉花基因功能提供方法。【方法】以陆地棉TM-1真叶为材料,采用常用的纤维素酶和离析酶组合分离原生质体,探究影响原生质体分离的叶龄、渗透压、酶解液成分和酶解时间,及渗透压和酶解时间对原生质体活力的影响,并分析渗透压、PEG浓度和培养液种类对原生质体瞬时转化的影响,进而优化棉花真叶原生质体瞬时表达体系。构建GhLTP-GFP表达载体,对比融合蛋白在拟南芥、棉花原生质体和烟草表皮细胞中的亚细胞定位,验证该体系。【结果】不同于棉花子叶,酶解液中高浓度CaCl₂会显著抑制真叶细胞壁的酶解,含10 mmol·L^-1 CaCl₂的酶解液能有效分离棉花真叶原生质体。甘露醇显著影响原生质体得率,含0.5 mol·L^-1甘露醇的酶解液分离原生质体得率最高,且细胞形态维持较好,而0.4 mol·L^-1甘露醇条件下原生质体活力降低一倍,表明0.5 mol·L^-1甘露醇能较好维持棉花真叶原生质体渗透压。陆地棉刚展平的真叶分离所得原生质体大小合适,而展平后的嫩叶分离得到的原生质体细胞较大,得率降低一倍。酶解处理7 h前,原生质体游离缓慢,酶解9 h原生质体产量达到高峰,继续酶解原生质体将破裂,得率降低。在等渗条件下用40% PEG4000转化所得原生质体,转化效率最高,而普遍采用的低渗条件不利于棉花真叶原生质体的转化。转化后,用WI溶液继续培养原生质体,会引起原生质体的大量破裂,用含0.5 mol·L^-1甘露醇的W5溶液继续培养,有利于原生质体形态的维持,转化率提高到90%。表达载体35S:GhLTP-GFP分别转入棉花、拟南芥原生质体和烟草表皮细胞,GFP信号在细胞中的定位结果一致。 【结论】建立的棉花真叶原生质体瞬时表达体系,可获得8.10×10⁶个/mL活力在95%以上的高质量原生质体,原生质体得率提高8倍,转化效率达到90%,可用于亚细胞定位、蛋白互作,以及代谢调控网络研究等。     

花椒原生质体分离与培养研究

以花椒试管苗叶片、愈伤组织和悬浮细胞为试验材料,通过单因素试验研究酶液浓度、渗透压调节剂浓度对花椒原生质体分离的影响,并以花椒试管苗叶片分离出的原生质体为试验材料,研究培养基种类、培养密度、不同激素配比对花椒原生质体培养的影响。结果表明,酶液浓度、渗透压调节剂浓度对花椒原生质体分离有显著影响。在适宜条件下,用甘露醇作花椒原生质体分离的渗透压调节剂,浓度在0.6~0.7 mol·L^-1时分离效果最佳。以花椒叶片为原生质体分离材料的最佳酶液组成为CPW-0.7 mol·L^-1甘露醇+1.0%(w/v)纤维素酶R-10+1.5%(w/v)果胶酶,酶解时间为10 h,纯化后的原生质体产量和活力分别可达82.36×10⁵ 个·g^-1和72.74%。以愈伤组织和悬浮细胞为分离材料的最佳酶液组成均为CPW-0.6 mol·L^-1甘露醇+2.0%(w/v)纤维素酶R-10+0.5%(w/v)果胶酶,酶解12~14 h,纯化后的原生质体产量及活力分别为31.26×10⁵ 个·g^-1、59.15%和53.87×10⁵ 个·g^-1、63.92%。以花椒试管苗叶片为原生质体分离材料,分离纯化后的花椒原生质体在无激素的WPM培养基中,培养密度为1×10⁵个·mL^-1,培养第3天原生质体第1次分裂,2周分裂3~5次,原生质体28 d后形成微细胞团,培养60 d后可形成2 mm左右的愈伤组织。     

NaOH对类芬顿预处理的玉米秸秆酶解性能影响

【目的】探究NaOH对类芬顿预处理(heterogeneous Fenton pretreatment, HFP)的玉米秸秆酶解效果影响及高效酶解的机制。【方法】在HFP体系(0.16 g·L^-1 FeOCl, 0.8 mol·L^-1 H₂O₂,6 h)对玉米秸秆预处理的前期进行NaOH前处理，以酶解后还原糖产率为指标，考察NaOH浓度和反应温度对NaOH-HFP体系的影响。对比未处理玉米秸秆和3种不同预处理体系(HFP体系、NaOH预处理体系和NaOH-HFP体系)处理后玉米秸秆的理化表征(成分分析和结构表征)。【结果】当NaOH浓度0.1 mol·L^-1,反应温度75℃时，经NaOH-HFP体系预处理玉米秸秆酶解后还原糖产率为92.5%,分别比NaOH预处理体系及HFP体系提高了31.0%和181.2%。成分分析结果表明，NaOH-HFP体系能够去除部分半维素和木质素。扫描电子显微镜、X-射线衍射、固态核磁和比表面积和孔隙率分析表征结果表明，预处理没有造成底物表面化学结构显...     

响应面法优化酿酒酵母发酵产谷胱甘肽工艺

为了探索酿酒酵母发酵生产谷胱甘肽(Glutathione, GSH)的最佳工艺条件。在单因素试验基础上,通过Plackett-Burman试验结合响应面设计方法对液体发酵培养基进行优化。结果表明：酿酒酵母发酵生产GSH的最优培养基配方为葡萄糖71 g·L^-1、酵母膏4 g·L^-1、NH₄Cl 6 g·L^-1、KH₂PO₄ 2.0 g·L^-1、MgSO₄ 0.5 g·L^-1,pH 6.0,在此条件下,GSH理论产量达79.51 mg·L^-1。经3批次平行试验验证,GSH实际产量均值为80.5 mg·L^-1,与预测值相近,较优化前产量(65.03 mg·L^-1)提高了约19.2%。     

烟曲霉降解玉米秸秆生产乙醇工艺研究

为有效降低纤维乙醇生产成本，本研究以玉米秸秆作为原料，烟曲霉作为产酶及酶解菌株，采用嗜鞣管囊酵母以半同步糖化发酵方法生产乙醇，对烟曲霉酶解过程、嗜鞣管囊酵母发酵生产乙醇的酶解和发酵条件分别进行了优化。结果表明，在10 g玉米秸秆中加入90 m L 0.2 mol/L Na OH溶液，121℃灭菌20 min并冷却到室温后用5 mol/L无菌H₂SO₄或10 mol/L Na OH调节p H至4.5，加入无菌饱和硫酸铵至终浓度为10 g·L^-1，该组成的发酵培养基中接入8%烟曲霉种子，酶解12 h后接入4%酵母种子，酶解发酵共计28 h，玉米秸秆降解率可达94.2%，获得乙醇31.8 g·L^-1。这说明预处理后无需固液分离及脱毒，采用烟曲霉酶解稀碱预处理玉米秸秆，以及嗜鞣管囊酵母发酵能经济有效低成本获得生物乙醇。     

食用菌菌渣高效降解菌的筛选及主菌株产酶环境优化

为筛选出高效降解食用菌废弃菌渣的复合菌系，有效促进菌渣的降解速率，明确复合菌系主要功能菌株最佳发酵环境。利用富集培养、限性继代培养和低温逐代驯化技术对205份采集的菌源材料进行筛选，通过对纤维素酶活性的测定，选取最佳菌源提取物料。同时采用划线分离培养，分离主要功能菌株，对菌株的产酶条件进行优化。结果表明，从205份菌源提取物质中分离纯化的1个具有较强的纤维素降解能力的材料，发现该菌属于曲霉属，产酶较高的主菌株是聚多曲霉(Aspergillus sydowii),对该菌株的产酶环境优化发现，产半纤维素酶和纤维素酶的最优环境是菌渣35 g·L^-1、硫酸铵3.5 g·L^-1、吐温-80为1.4 mL·L^-1、KH₂PO₄ 1.0 g·L^-1、MgSO₄·7H₂O 1.0 g·L^-1、NaCl 0.5 g·L^-1、FeSO₄·7H₂O...     

紫萼组织培养技术

试验以紫萼(Hosta ventricosa)的幼嫩花序为起始材料,研究其组织培养方法。结果表明:2%次氯酸钠溶液灭菌14 min为最佳灭菌方式;最适合的诱导培养基为MS+6-BA 4 mg·L^-1+NAA 0.2 mg·L^-1。将诱导的健康芽转至6-BA 4 mg·L^-1、NAA 0.5 mg·L^-1和2,4-D 0.25 mg·L^-1的增殖培养基中,伸长倍率为3.5,增殖倍率为3.9。将健康不定芽转至生根培养基,以1/2 MS+ABT 0.5 mg·L^-1为佳,在此培养基上可形成粗壮健康的白色根,长度2~9 cm,数量4~6根。将完整植株转移至园土∶泥炭∶珍珠岩体积比为1∶3∶1的基质中炼苗2个月,成活率达97%以上,可地栽。     

外源水杨酸对2个绣球品种耐热性影响的研究

选择2个绣球品种‘含羞叶’和‘银边’为试验材料,采用叶片喷施不同浓度水杨酸（SA）溶液（0.25、0.50、0.75 mmol·L^-1和1.00 mmol·L^-1）并结合人工气候室模拟高温胁迫43℃/33℃（昼/夜）的处理方法,从形态表现、光合色素、膜脂过氧化酶、抗氧化酶活性、渗透调节物质等方面研究外源SA在提升绣球耐热性过程中的生理功能及其作用机理。结果表明,施用SA浓度为0.50 mmol·L^-1和0.75 mmol·L^-1后,2个绣球品种叶片受热害影响程度较轻,且施用适当浓度的SA能有效抑制高温胁迫下光合色素的分解,减缓细胞膜的氧化损伤,抑制丙二醛的积累,提升超氧化物歧化酶、过氧化物酶及过氧化氢酶的活性,增加细胞内的可溶性糖、可溶性蛋白和游离脯氨酸等细胞渗透调节物质的含量,进而减轻高温胁迫对绣球造成的伤害,诱导绣球耐热性提升,以0.75 mmol·L^-1浓度的SA处理对绣球耐热性提升效果最佳。     

基于响应面法的粘质沙雷氏菌BRC-CXG2发酵培养基优化

为了将粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）应用在松墨天牛（Monochamus alternatus）防治上,对粘质沙雷氏菌的培养基配方进行了优化。通过单因素试验筛选粘质沙雷氏菌发酵培养基的碳源、氮源和无机盐,利用Plackett-Burman试验设计确定3个主要影响因素,通过最陡爬坡试验,结合Box-Behnken Design试验设计及响应面分析法优化培养基组成成分,获得培养基最佳配方与发酵条件：葡萄糖23.27 g·L^-1、蚕蛹粉22.37 g·L^-1、酵母粉10 g·L^-1、硫酸镁2 g·L^-1、磷酸氢二钠3 g·L^-1,氯化钠2 g·L^-1;在28 ℃、150 r·min^-1条件下发酵36 h,装液量体积分数为50 mL/250 mL,接种量4.73 %,pH 7.1~7.3。最后,根据最优培养条件验证发现优化后培养基中生长的菌落数为6.0×10⁹ cfu·mL^-1,是初始培养基的9.42倍,与模型预测值相符。研究结果为粘质沙雷氏菌的发酵生产提供了理论基础,为松材线虫病（pine wilt disease）的防治提供了新的途径。     

以橘渣为原料间歇振荡法生产细菌纤维素

以筛选于腐败柑橘表面的细菌纤维素(bacterial cellulose,BC)高产菌——中间葡糖酸醋杆菌CIs26为发酵菌株,以间歇振荡法为培养方式,研究橘渣预处理工艺、碳源、氮源和增效因子等营养条件对BC产量的影响。优化后的工艺条件为:橘渣与水混合比例1:6,添加0.3 g·L^-1果胶酶和0.1 g·L^-1纤维素酶,45 ℃酶解2 h。以滤液代替去离子水复配培养基,以蔗糖(70 g·L^-1)为碳源、硫酸铵(3 g·L^-1)为氮源、酵母粉(7 g·L^-1)为生长因子、乳酸(1 g·L^-1)与磷酸氢二钠(2 g·L^-1)为增效因子,在此条件下,BC产量达10.26 g·L^-1。说明橘渣经适当预处理与复配后,能够作为CIs26菌株间歇振荡法生产BC的优良培养基。     

洋虫内产β-葡萄糖苷酶内生菌发酵液转化人参皂苷产物分析及其抗肿瘤活性研究

为提高人参皂苷生物利用度，明确人参皂苷药用洋虫体内生物转化规律及其代谢产物抗肿瘤活性，通过MRS（含七叶苷和柠檬酸铁）培养基筛选洋虫内生菌中高产β-葡萄糖苷酶的菌株，制备复合菌发酵剂液体转化人参皂苷提取物，利用高效液相色谱-串联质谱法分析发酵产物中人参皂苷的化学组成及其动态变化规律，采用四甲基噻唑蓝（methylthiazoletrazolium，MTT）染色法阐明发酵产物低（0.5 mg·L^-1）、中（2 mg·L^-1）、高（5 mg·L^-1）剂量对A549细胞抗肿瘤活性的影响。人参提取物中共检测出Re、Rg1、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd 7种皂苷，代谢产物中有去糖基化人参皂苷Rh1、Rg3和compoud K产生，发酵产物MTT试验显示高剂量组（5 mg·L^-1）反应72 h抑制肿瘤细胞率可达85%。由此表明，利用洋虫内生菌复合菌液转化人参皂苷提取物可提高中药人参和洋虫的药用价值，为中草药的发酵改性提供了新思路。     

灌木幼苗对镉毒害的敏感性差异

为探究灌木幼苗及不同测试终点对镉（Cd）毒害的抗性和敏感性差异,选取了12种常见的灌木植物,通过Cd对灌木幼苗毒害的水培试验,测定不同含量Cd处理［0（对照）、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 mg·L^-1］下植物的生长状况（表观毒害症状、株高、地上部鲜重和干重、根系生长状态）,比较不同测试终点稳定性,并运用Burr-Ⅲ模型制作物种敏感性分布图（species sensitivity distributions,SSD）,分析不同灌木幼苗对Cd的敏感性。结果表明,供试植物在Cd含量为1.0~4.0 mg·L^-1时开始出现表观毒害症状;Cd对不同的植物地上部和根系毒害阈值差异较大,地上部干重减少10%（EC₁₀）和50%（EC₅₀）对应的毒性阈值变化范围分别为0.11（海桐）~1.30 mg·L^-1（八角金盘）和2.58（金森女贞）~10.90 mg·L^-1（八角金盘）,差异分别达到了11.8和4.2倍;根分支数对应的EC₁₀和EC₅₀变化范围分别为0.08（金森女贞）~1.27 mg·L^-1（八角金盘）和2.40（金森女贞）~10.30 mg·L^-1（八角金盘）,差异分别达到了15.8和4.3倍;不同测试终点的敏感性从大到小依次为根分枝数>总根长>总根表面积>总根尖数>地上部分干重>株高>地上部分鲜重,说明根系指标对Cd毒性更为敏感;基于地上部干重和根分支数的EC₅₀数据得到的SSD表明,大部分植物的敏感性分布趋于一致,其中金森女贞和海桐对Cd毒害最为敏感,八角金盘为Cd毒害的抗性品种;同时,根据SSD得出保护95%林木品质不受Cd毒害的生态风险阈值HC₅。     

低磷胁迫下3种不同种源葛藤的生长生理响应

为揭示葛藤（Pueraria lobate）幼苗对低磷胁迫的适应机制，选取来自澳大利亚和我国湖南和江苏的3个不同种源的葛藤为试验材料，设置0.5（常磷）、0.05（低磷）和0.005 （极低磷） mmol·L^-1 3种不同KH₂PO₄浓度处理，测定不同磷处理下3个不同种源葛藤幼苗的生长及生理响应。结果表明，0.05 mmol·L^-1磷处理下，3个不同种源葛藤的根长、根表面积、根直径等根系指标和叶面积、叶周长等叶片指标均呈显著上升趋势（P<0.05），表明葛藤具有一定的耐低磷性；在0.005 mmol·L^-1磷处理下，湖南和江苏葛藤的根系指标较澳大利亚葛藤受到了明显抑制，但湖南葛藤的叶片形态指标呈增长趋势。3个不同种源葛藤在低磷胁迫下的根和叶中脯氨酸、可溶性糖、丙二醛含量及抗氧化酶活性均显著增加（P<0.05），但可溶性蛋白含量下降。综上所述，澳大利亚葛藤的耐低磷能力强，具有较高的种植推广价值。     

混合盐胁迫对白榆幼苗形态及生理指标的影响

为揭示混合盐胁迫对白榆幼苗形态及生理指标的影响,以白榆幼苗为试验材料,采用盆栽法,设置6个混合盐（等浓度NaCl和NaHCO₃溶液）浓度［0（CK）、10（T1）、30（T2）、50（T3）、70（T4）、100（T5） mmol·L^-1］对白榆幼苗进行不同时间胁迫处理,分析混合盐胁迫下白榆幼苗的生长及生理指标的变化。结果表明,白榆幼苗生长对盐胁迫反应敏感,当盐浓度（10 mmol·L^-1）较低时即表现出明显的抑制作用,胁迫35 d后,随着盐浓度的升高,白榆幼苗的总生物量、株高及地径增长量均显著降低,当混合盐浓度高于50 mmol·L^-1时,各处理间降幅趋于稳定。不同盐浓度胁迫下,根冠比值均大于对照组;随着盐胁迫程度的加剧,丙二醛含量和相对电导率在不同处理时间下均逐渐增大,而可溶性糖、过氧化物酶及超氧化物歧化酶均呈现先升高后降低的趋势;不同处理时间下,叶绿素含量随着盐胁迫浓度的增加显著降低,混合盐浓度为100 mmol·L^-1时,不同处理时间下叶绿素含量均为最小值。混合盐胁迫对白榆幼苗的生长具有一定程度的抑制作用,但白榆幼苗可通过渗透调节及提高保护酶活性主动适应逆境,从而表现出较强的抗盐能力。研究结果旨在为白榆在盐碱地区的种植提供理论依据和技术参考。     

ALA对设施灵武长枣光合作用与坐果的影响

采用0.5、1.0 mg·L^1-与2.0 mg·L^-1的5-氨基乙酰丙酸(ALA)喷施处理设施栽培的灵武长枣,研究ALA对设施灵武长枣光合作用与坐果的影响。结果表明: 1.0 mg·L^-1ALA处理下其净光合速率比对照增高了1.07 μmol·m^-2·s^-1; 2.0 mg·L^-1ALA处理下叶绿素含量SPAD比对照增加了4.6,果实含糖量提高了2.575%; 对设施枣的水分利用效率、坐果率以及产量的影响不显著。可见,在设施栽培条件下,喷施外源ALA有利于提高灵武长枣光合作用、叶绿素含量以及果实含糖量。     

盐胁迫下樱桃砧木的光合响应和光谱特性

为研究不同盐胁迫对樱桃砧木幼苗叶片光合作用的影响及反射光谱的变化,以樱桃砧木大青叶为试验材料,设置0、75、150和300 mmol·L-1 NaC1盐胁迫处理,采用分光光度计、CI-340-便携式光合测定仪和CI-710光纤光谱仪测定叶绿素含量、光合及光谱,研究盐胁迫下樱桃砧木幼苗叶片色素含量、光合指标、反射光谱变化...     

不同培养基组分对5个蜡梅品系花粉萌发和花粉管生长的影响

以河南省许昌市3个类型5个品系的蜡梅花粉为试验材料,研究了不同培养基组分对蜡梅花粉萌发和花粉管生长的影响,以筛选出适宜不同类型蜡梅花粉萌发的最佳培养基,为生产实践中科学授粉和杂交育种提供理论依据。结果表明:聚乙二醇是蜡梅花粉萌发和花粉管生长的关键因素,当培养基中没有聚乙二醇时,花粉不能萌发;蔗糖不是蜡梅花粉离体萌发的必需因素,高浓度蔗糖还会抑制花粉萌发;硼酸和硝酸钙能够有效促进花粉萌发,在花粉萌发中起辅助作用;素心和红心类蜡梅花粉萌发和生长最佳培养基配方为PEG-4000 250 g·L^-1+Ca(NO₃)₂·4H₂O 10 mg·L^-1+H₃BO₃ 20 mg·L^-1,豫素1号、豫素2号、豫红1号花粉萌发率分别为25.38%、25.34%、23.46%,花粉管长度分别为302.31、297.64、285.68 μm;乔种蜡梅花粉萌发和生长最佳培养基配方为:PEG-4000 250 g·L^-1+Ca(NO₃)₂·4H₂O 5 mg·L^-1+H₃BO₃ 15 mg·L^-1,豫乔1号、豫乔2号花粉萌发率分别为24.43%和24.93%,花粉管长度分别为288.27 μm和286.37 μm。综合比较,5种花粉受培养基中相同因素影响的趋势相同,但在最适宜条件下,素心类型蜡梅的花粉活力较好,其萌发情况略好于其他2种类型。     

烟草秸秆绿原酸提取工艺优化及其抑菌效果研究

为扩展烟草秸秆的利用途径，探究烟草秸秆绿原酸对烟草疫霉的抑菌效果，采用单因素试验和响应面分析法优化烟草秸秆绿原酸微波辅助提取工艺，并通过离体培养探讨烟草秸秆绿原酸对烟草疫霉菌的抑制作用。单因素及响应面结果表明，烟草秸秆绿原酸最佳提取工艺为料液比1∶15(g·mL^-1)，提取温度50.03℃，乙醇体积分数50%，此时粗提物中绿原酸含量为3.48 mg·g^-1；离体条件下，烟草秸秆绿原酸的添加均抑制了疫霉菌的生长，其中175 mg·L^-1烟草秸秆绿原酸对菌落直径的抑制效果最为显著，抑菌率高达32%。此外，碘化丙啶(PI)染色结果表明，175 mg·L^-1的烟草秸秆绿原酸可通过破坏烟草疫霉菌细胞膜的完整性抑制菌丝生长。研究结果为烟草秸秆有效利用和新型天然植物源杀菌剂开发奠定了基础。