木霉融合子Tpf-2的定殖及其对番茄防御酶系的影响

利用qPCR检测木霉融合子Tpf-2在番茄根际土中的定殖,并采用生理生化法测定Tpf-2对番茄叶片中相关防御酶活性的影响。结果表明,在整个番茄生育期内(0~150d),Tpf-2均可在番茄根际土中定殖,相对定殖数量随时间的延长呈下降趋势,同时接种木霉和瓜果腐霉处理组中Tpf-2相对定殖数量高于同期无病原菌处理组。不同处理组番茄叶片中的超氧化物歧化酶SOD、过氧化物酶POD及过氧化氢酶CAT的活性不同,同时接种木霉和瓜果腐霉处理组中上述3种酶活性增加显著,与只接种瓜果腐霉处理组间存在极显著性差异(P0.01)。综上可见,木霉融合子Tpf-2的厚垣孢子定殖周期长,定殖后可诱导番茄叶片中相关防御酶活性的提高,本研究为揭示其生防机理及菌株应用提供了科学依据。     

突脐蠕孢与弯孢原生质的双亲灭活融合

采用灭活原生质体方法,对致病力强、产孢量低的突脐蠕孢EM菌株和致病力较弱、但产孢量高的弯孢CL菌株两株稗草致病菌进行原生质体融合,通过观察形态、生物学及抑草活性等特性筛选融合子。结果表明,2%溶壁酶+2%蜗牛酶处理获得两亲株的原生质体释放数量最高,CL和EM分别达1.25×106个/ml和1.21×106个/ml;再生培养基○c处理的CL和EM原生质体再生率分别达14.7%和13.2%。EM利用热灭活55℃5min;CL利用紫外灭活30s,距离20cm,照射时间4min;聚乙二醇促融,获得3个融合子。融合子在孢子形态上与亲株存在明显差异,其菌丝生长速度、孢子产量、对稗草根生长的抑制作用等也与双亲菌株有差异。     

利用双亲灭活原生质体融合技术选育高效苏云金芽胞杆菌和枯草芽胞杆菌融合菌株

苏云金芽胞杆菌B7发酵液在药后96 h对小菜蛾2龄幼虫致死率高达85.06%;枯草芽胞杆菌TL2对黄瓜枯萎病和辣椒疫霉病有显著拮抗活性(对峙培养5 d对病原菌的平均抑制率在60%以上)。本文对菌株B7和TL2的原生质体形成、完全灭活及融合的最佳条件分别进行了筛选,研究结果表明菌株B7在溶菌酶1.0 mg/m L、酶解70 min的条件下,原生质体形成率和再生率最佳,分别为85.0%和29.41%;菌株TL2在溶菌酶1.25 mg/m L、酶解50 min的条件下,原生质体形成率和再生率最佳,分别为80.00%和25.00%。菌株TL2原生质体完全灭活的最佳条件为60℃水浴35 min,菌株B7原生质体完全灭活的最佳条件为紫外照射25 min。灭活后的两亲本融合最佳条件为30℃水浴融合20 min后涂布再生培养基,用影印法连续传代10次以上,最后筛选出17株稳定的融合子,经过杀虫防病检测最后筛选到一株兼具两亲本特性的高效融合子TLB15。TLB15发酵液在药后96 h对小菜蛾2龄幼虫校正死亡率为93.44%,TLB15发酵液对黄瓜枯萎病和辣椒疫霉病(对峙培养5 d)的平均抑制率分别为60.00%和62.79%。     

蔬菜灰霉病菌对腐霉利抗药性变异及其治理

蔬菜灰霉病菌（Botrytis cinerea）分生孢子经紫外光灯照射，可获得10^-4～10^-5频率的腐霉利抗药性突变体。获得的13个抗性突变体的抗性水平平均EC50值为18.45ug/ml,EC90值为305.17ug/ml。抗性突变体的可溶性蛋白谱带比其亲本敏感菌株多2～4条，其中Rf=0.38的蛋白谱带是抗性菌株所拥有而敏感菌株所共同缺乏的。抗性菌株对腐霉利抗药性稳定遗传，具有与亲本菌株相同的致病性。苗期抗、感测定结果表明，灰霉克杀菌剂对腐霉利突变体具有明显的克抗作用。田间抗性菌治理使用灰霉克400～800倍对大棚番茄灰霉病平均防效为95.93%～75.8%,优于腐霉剂600倍的平均防效(61.32%)。     

抗药性链霉菌S89的诱变选育及对灰霉病菌的抑制作用

采用紫外线照射与药物培养基驯化相结合的方法选育抗药性链霉菌,筛选出4株对腐霉利有显著抗性的突变株(US-1,US-2,US-3和US-4)。US-1和US-3对灰葡萄孢菌的抑菌能力显著高于亲本菌株,US-2和US-4的抑菌能力显著低于亲本菌株。颉颃活性最强的US-1菌株与腐霉利的协同作用表明,7份菌液和3份药液混用后,对灰葡萄孢菌的抑菌圈直径为21.97mm,对离体番茄灰霉病的防效高达77.68%,显著高于菌株单独使用的抑菌效果。     

原生质体融合技术改良植病生防木霉菌株

以产孢量大，对苯菌灵有抗性，对潮霉素B敏感的哈茨木霉菌株T9和产孢量少，对潮霉素B有抗性，对苯菌灵敏感的康宁木霉菌株Tk7a为亲本，进行原生质体融合，筛选获得抗最高浓度杀菌剂的融合子。所有融合子的产孢量均比亲本菌株Tk7a大。融合子按照菌落形态的不同分成4组，大部分融合子的几丁质酶、葡聚糖酶和内切葡聚糖酶的活性比亲本菌株高。融合子对棉花猝倒病菌和小麦全蚀病菌的寄生能力基本等同于亲本菌株；融合子对小麦全蚀病的防效比亲本菌株稍好，其刺激麦苗根部生长的能力与亲本菌株相差不大。两个融合子根际竞争能力比亲本菌株T9强，和亲本菌株Tk7a相当。     

淡紫褐链霉菌NBF715防控黄瓜猝倒病及其机制的初步研究

为明确淡紫褐链霉菌NBF715对黄瓜猝倒病的防控效果和抑菌机制,对其进行了对峙培养、抑菌活性、抑菌物质测定和盆栽防效测定。结果表明,对峙培养条件下NBF715对瓜果腐霉抑菌率为55.6%,无菌发酵液稀释10、25、50倍和100倍对瓜果腐霉抑菌率分别为84.1%、69.2%、47.8%和36.5%。光学显微镜和扫描电镜下观察,与对照相比,NBF715处理后瓜果腐霉菌丝发生扭曲、肿胀变形和消解。NBF715菌株能产生淀粉酶、纤维素酶、β-1,3-葡聚糖酶和嗜铁素。发酵液原液和稀释5倍发酵液浸种处理,对黄瓜猝倒病防效分别为97.1%和80.2%。NBF715菌株具有较好的生防应用前景。     

一株多粘类芽孢杆菌的鉴定及其生防促生效果初步测定

菌株CF05是从浙江天目山柳杉中分离得到的1株细菌,经形态、16S rDNA序列、生理生化指标检测,鉴定为多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa。平板拮抗结果表明,该菌对9种植物病原真菌和3种病原细菌具有显著拮抗效果。室内生测结果表明,发酵液和菌悬液对番茄幼苗均具有明显的促生效果,其中发酵液处理最佳,鲜重增长272.0%,干重增长266.7%。菌株CF05接种27 d后,番茄根际细菌浓度仍很高。种子萌发测定结果表明,菌株CF05处理后发芽率提高11.7%,番茄猝倒病防治测定结果显示,发病率降低38.6%,效果均优于Bacillus subtilis 168处理。综上结果,表明P.polymyxa CF05是1株生防性状优良的促生细菌。     

哈茨木霉T2-16的GFP标记及其生防特性

优化高效拮抗生防菌哈茨木霉T2-16的转化条件，筛选出与野生型菌株具有相似生防特性的阳性转化子，为生防木霉菌T2-16的定殖动态、分布规律等研究打下基础。通过PCR和分子克隆技术构建具有G418抗性基因的绿色荧光（GFP）表达载体pKN-sGFP，利用PEG-CaCl₂介导的原生质体转化法，获得强荧光表达的哈茨木霉T2-16转化子，并将其与野生型菌株的生物特性进行比较，筛选出与野生型菌株具有相似生防特性的阳性转化子。试验结果显示，哈茨木霉T2-16在20℃培养条件下对1000 μg/mL G418敏感，在上述优化条件下，转化获得稳定遗传的阳性转化子TG2-10；进一步比较其与野生型菌株的生物特性发现，两者之间无明显差异，可用于下一步哈茨木霉T2-16生防机理的研究。     

番茄灰霉病菌对腐霉利的抗药性检测及生物学性状研究

采用区分剂量法,检测了来自福建省、上海市、辽宁省和内蒙古自治区不同采样点的番茄灰霉病菌Botrytis cinerea对腐霉利的抗性频率;选取未施药地区的敏感菌株,建立了灰霉病菌对腐霉利的敏感基线;比较了常年施药地区与未施药地区灰霉病菌的抗性频率差异,测定了施药10年以上地区番茄灰霉病菌的抗性指数;研究比较了抗、感菌株的生物学性状。结果表明:腐霉利对127株敏感菌株的平均EC50值为(0.31±0.08) μg/mL;供试4省市灰霉病菌对腐霉利均表现出了很高的抗性频率,其中内蒙古自治区和辽宁省采样点的抗性菌株频率高于90%;在施药历史超过10年的215株田间菌株中,抗性水平最高的菌株来自辽宁省,抗性指数为44.3;施药地区灰霉病菌的抗性频率均高于未施药地区;抗性菌株的抗药性可稳定遗传;供试11株抗性和敏感菌株在产孢量和孢子萌发率、菌丝生长速率、活体致病力等生物学性状方面的差异与其抗性水平之间无明显相关性。     

哈茨木霉LTR-2双价基因重组菌株的构建及其防治效果

本文利用限制性内切酶介导法转化哈茨木霉LTR-2,获得具有双价基因(glu14、chi42)的重组生防菌株.试验得到的木霉转化子具有遗传稳定性,于无药PDA平板上连续转接6次后,在Hyg 200 μg/mL的PDA平板上仍可继续生长.PCR扩增及Southern杂交证实目的基因已随机插入木霉基因组DNA上,本试验转化子均为单拷贝插入.转化子的β-1,4-葡聚糖酶和几丁质酶水解活性较出发菌株LTR-2显著提高(P＜0.01),其中转化子L-15的两种水解酶活性均最高.转化子在温室条件下对番茄晚疫病、茄子猝倒病和黄瓜灰霉病均有较好的防治作用,但不同处理间存在显著性差异(P＜0.01),其中转化子L-15最高,对3种病害的防治效果分别达到了91.5％、94.9％和83.8％,较出发菌株LTR-2处理分别提高了53.5％、55.9％和33.5％.结果表明,利用REMI技术,将β-1,4-葡聚糖酶基因glu14和几丁质酶基因chi42重组到木霉染色体DNA上,是获得高效重组菌株的有效手段.     

腐霉对甲霜灵抗性测定及其生物防治

测定了腐霉属的8个种209个菌株对甲霜灵在浓度为0.5和50ug/ml时的抗性，从实验中观察到不同菌株对甲霜灵抗性变化的范围非常大，有95株在0.5ug/ml时，菌丝即停止生长，在20株在50ug/ml时，菌丝生长速度与对照几乎一样。经鉴定，这209株菌中，优势种为终极腐霉(Pythium ultimum）和刺腐霉(P.spinosum)。20株高抗菌中,P.ultimum占16株，P.irregulare占2株，P.spinosum和P.graminicola各占1株。盆栽试验表明：假单胞菌株Pseudomonas sp.CR56对高抗菌株P.ultimum ONCUR01引起黄瓜苗期猝倒病具有显著的防效，防效与甲霜灵和五氯硝基苯相比，达到极显著差异。     

KMnO_4和H_2O_2刺激掘氏疫霉卵孢子萌发对单卵孢株生物学性状的影响

本文对经KMnO_4、H_2O_2刺激掘氏疫霉(Phytophthora drechsleri)卵孢子萌发建立的单卵孢株群体应用于掘氏疫霉遗传研究的可行性做了研究。2个掘氏疫霉菌株(A_1、A_2交配型各1株)经聚碳膜间隔配对产生的卵孢子用KMnO_4、H_2O_2以及不用上述氧化剂处理分别建立K、H、C 3个单卵孢株群体(卵孢子萌发率8—16%)。在群体水平上对来自同一亲本的上述3个群体生物学性状比较结果表明,H_2O_2处理刺激卵孢子萌发不影响生长速度、菌落形态、耐35℃高温生长、致病力及交配型的遗传稳定性,所建立的单卵孢株群体可用于上述性状的遗传研究;KMnO_4处理导致掘氏疫霉A_1和A_2交配型在自交后代各自分离为A_1、A_2、A_1A_2和A_2、A_1A_2,但不影响其他生物学性状的遗传稳定性,所建立的单卵孢株群体可用于除交配型性状以外的其他生物学性状的遗传研究,不宜用于交配型正常遗传规律的研究。用KMnO_4处理掘氏疫霉A_1或A_2交配型菌株单株自交产生的卵孢子,从A_1菌株自交后代获得A_2和A_1A_2以及从A_2菌株自交后代获得A_1A_2交配型单卵孢株的结果说明,掘氏疫霉异宗配合菌株体内可能同时包含控制A_1和A_2交配型的遗传因子,在正常条件下有1种交配型遗传因子不表达。KMnO_4处理可望作为揭示交配型遗传本质的有用试验手段。     

河南省番茄灰霉病菌对3种杀菌剂的抗药性检测

为了明确河南省番茄灰霉病菌对苯并咪唑类杀菌剂多菌灵、二甲酰亚胺类杀菌剂腐霉利和氨基甲酸酯类杀菌剂乙霉威的抗药性状况,2013年从河南省不同保护地中采集番茄灰霉病病果或病叶,经单孢分离共获得番茄灰霉病菌菌株139株。采用最低抑制浓度法（MIC）测定了其对多菌灵、腐霉利和乙霉威的抗药性。结果显示：番茄灰霉病菌对多菌灵、腐霉利和乙霉威产生抗性菌株的频率分别为81. 29%、80.58%和93.53%; 所测菌株对3类杀菌剂的抗性类型有BenRDicSNPCS、BenRDicRNPCS、BenRDicSNPCR、BenSDicRNPCR、BenSDicSNPCR和BenRDicRNPCR 6种,所占比例分别为2. 88%、3.60%、3.60%、5.04%、13.67%和71. 22%。表明河南省番茄灰霉病菌已对多菌灵、腐霉利和乙霉威产生抗药性,迫切需要筛选新的杀菌剂防治番茄灰霉病。     

枯草芽孢杆菌HL29与根瘤菌XJ83097原生质体融合以及融合子特性的初步研究

原生质体融合即细胞融合,是20世纪70年代发展起来的基因重组技术;近几十年来,随着研究方法的不断改进,研究手段的日益更新,围绕着原生质体的研究,已经形成了一整套的成熟的原生质体技术。利用原生质体融合技术可以获得具有双亲优良特性的融合子,对于提高作物产量、改善品质、提高抗逆性以及实现高产稳产优质农业具有重要意义。本试验旨在将具有高效固氮活性的根瘤菌XJ83097和具有良好生防效果的枯草芽孢杆菌 HL-29进行原生质体融合,并通过室内和田间试验对融合子进行生理生化性状和抑菌、固氮活性等方面进行测定,以期筛选获得同时具有高效固氮和生防效果的融合子。     

番茄疫霉根腐病生防菌的分离鉴定及其防治效果

 利用平板对峙法从山东寿光采集的土样中筛选出1株对番茄疫霉根腐病菌Phytophthora capsici Leonian具有较好拮抗作用的生防菌株ZF50,抑菌率为76.26%。经形态学、生理生化特性以及系统发育树分析,确定菌株ZF50为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis。该菌株具有较广谱的抑菌能力,且在活体盆栽和田间小区条件下,将浓度为1×10⁸ cfu·mL^-1 ZF50菌悬液10 mL灌根后,对番茄疫霉根腐病的防治效果最好,盆栽防效为55.55%,田间小区防效为43.52%;且该菌株还具有明显的促生效果和产吲哚乙酸的能力。     

番茄疫霉根腐病生防菌的分离鉴定及其防治效果

 利用平板对峙法从山东寿光采集的土样中筛选出1株对番茄疫霉根腐病菌Phytophthora capsici Leonian具有较好拮抗作用的生防菌株ZF50,抑菌率为76.26%。经形态学、生理生化特性以及系统发育树分析,确定菌株ZF50为贝莱斯芽胞杆菌Bacillus velezensis。该菌株具有较广谱的抑菌能力,且在活体盆栽和田间小区条件下,将浓度为1×10⁸ cfu·mL^-1 ZF50菌悬液10 mL灌根后,对番茄疫霉根腐病的防治效果最好,盆栽防效为55.55%,田间小区防效为43.52%;且该菌株还具有明显的促生效果和产吲哚乙酸的能力。     

哈茨木霉重组株L-15与野生株LTR-2贮存稳定性及生防活性研究

为比较哈茨木霉重组株L-15与野生株LTR-2在贮存稳定性及生防活性方面的差异,采用平板菌落计数法检测木霉可湿性粉剂中分生孢子的存活率,测定菌株的生物学特性,并在温室条件下评价制剂对番茄立枯病的防治效果。结果表明,分生孢子存活率达80.0%时,在5℃和室温(2℃～36℃)下,L-15可湿性粉剂的货架期分别为24个月和9个月,显著高于LTR-2可湿性粉剂的12个月和6个月。L-15的潮霉素抗性在贮存后稳定遗传,其β-1, 4-葡聚糖酶水解活性、几丁质酶水解活性及平板拮抗活性较LTR-2明显提高。5℃贮存60月后,L-15可湿性粉剂10×和100×稀释处理对番茄立枯病的温室防治效果分别达89.27%和86.52%,与LTR-2处理间存在极显著性差异(P0.01)。重组株L-15的货架期和生防活性较野生株LTR-2明显提高,在生物防治领域具有潜在应用价值。     

粉红螺旋聚孢霉高效生防菌株的筛选与评价

粉红螺旋聚孢霉Clonostachys rosea是一种重要的植物病原生防真菌。本研究测定了不同地理来源的42株粉红螺旋聚孢霉菌株对核盘菌Sclerotinia sclerotiorum菌核的寄生能力,以及菌株几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性,同时测定了不同菌株对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea的拮抗作用以及对番茄果实灰霉病的防治效果。结果表明,不同来源的粉红螺旋聚孢霉菌株对核盘菌菌核均有一定的寄生能力,45.2%的菌株寄生能力达到4级,β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性与其寄生能力呈极显著正相关。研究发现,粉红螺旋聚孢霉菌株对番茄灰霉病菌有一定的拮抗作用,抑制率最高可达78.4%;HN-56、STG-21-1、GS6-1等菌株对离体番茄果实灰霉病的防效达到75%以上,显示出良好的生防潜力。本研究为丰富植物真菌病害生防资源和高效粉红螺旋聚孢霉生防制剂的研发奠定了基础。     

拮抗放线菌A03的生防作用及其分类鉴定

从京郊菜园土壤中分离到一株拮抗放线菌,编号为A03。为了科学评价该菌株在植物病害生防中的应用潜力,采用平板对峙培养法和温室盆栽防治法测定了其抑菌活性,并通过形态学、化学和分子分类的方法研究其分类地位。结果表明,该菌株对供试的多种植物病原真菌均有抑制作用,其中对果蔬灰霉病菌、番茄早疫病菌、小麦纹枯病菌和瓜果腐霉的抑制作用较强,平板抑菌带宽度达11．0～12．0 mm。温室防病试验结果表明,其发酵上清液对甜椒灰霉病和番茄灰霉病具有良好的生防作用,防治效果分别为84．97%和79．51%。根据其菌株形态特征、培养性状、生理生化特性、细胞壁化学组分及16S rDNA序列分析,将菌株A03归入链霉菌属,并鉴定为吸水链霉菌Strep- tomyces hygroscopicus。