鹅GnIH基因克隆及其在卵泡发育中的表达规律研究

为研究促性腺激素抑制激素(Gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)基因表达与鹅卵泡发育间的关系,对鹅GnIH基因的CDS区序列进行了克隆与分析,并采用荧光定量PCR检测了该基因在产蛋高峰期鹅的不同大小卵泡中的表达量.序列分析结果表明,所获得的鹅GnIH基因CDS区长471 bp,编码157个氨基酸,与已知的其它鸟类GnIH相似性达87％.鹅GnIH前体包括3个“LPLRF”,具有典型的“LPXRF-酰胺”基序.荧光定量结果表明,鹅GnIH在所有不同大小的卵泡中均有表达,其表达量在卵泡发育过程中呈现规律性变化,总趋势是先增高后降低,且在直径4～5 mm的卵泡中表达量最高.研究结果显示,鹅卵泡GnIH基因的表达与卵泡选择性发育有关,且该选择过程可能发生在直径为4～5mm的卵泡.这一研究可为探讨季节性繁殖禽类卵泡发育的调控机理奠定基础.     

鹅不同繁殖时期GnRH和GnIH基因表达和激素浓度变化分析

旨在研究GnRH和GnIH基因和激素在鹅繁殖过程中的重要作用,本研究以产蛋性能差异显著的四川白鹅和溆浦鹅为试验材料,利用Real-time RCR方法检测产蛋前期、产蛋期和休产期两种鹅的下丘脑、垂体和卵巢组织中GnRH和GnIH mRNA的表达量;利用放射性免疫和酶联免疫吸附测定法测定血清中的GnRH和GnIH激素变化情况。结果表明:GnRH和GnIH基因在四川白鹅和溆浦鹅的下丘脑、垂体和卵巢组织中均有表达;产蛋前期和产蛋高峰期的下丘脑和卵巢组织中,四川白鹅的GnRH mRNA表达量显著(P0.05)或极显著(P0.01)高于溆浦鹅,在产蛋高峰期和休产期四川白鹅GnRH激素浓度也极显著(P0.01)或显著高于(P0.05)溆浦鹅,在高峰期和休产期四川白鹅GnRH血清浓度分别为51.13和51.10pg·mL-1,溆浦鹅分别为49.52和49.94pg·mL-1;GnIH在两种鹅的变化比较一致,仅在产蛋高峰期,四川白鹅下丘脑组织中GnIH mRNA表达水平极显著低于(P0.01)溆浦鹅,而两种鹅之间的GnIH激素在各个时期均无显著差异。这提示随着繁殖阶段的改变,在调控两种鹅产蛋性能的作用过程中GnRH可能较GnIH发挥着更为重要的作用,为进一步研究鹅繁殖分子机制奠定基础。     

海南原鸡PDCD10的克隆、表达及其蛋白的生物信息学分析

通过克隆、表达海南原鸡程序性细胞死亡分子10(Programmed cell death10,PDCD10)基因,对其蛋白进行生物信息学分析。采用RT-PCR方法克隆得到海南原鸡PDCD10基因CDS区,将扩增产物与原核表达载体pET42a连接,构建pET42a-PDCD10重组质粒,经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot分析;运用生物信息学软件对所获得基因的核苷酸序列进行分析,并预测其编码蛋白的理化性质及二级结构等。克隆获得了PDCD10639bp的CDS区核苷酸序列,融合蛋白分子量约为57ku,生物信息学分析发现,PDCD10CDS区包括1个639bp的开放读码框,编码212个氨基酸。该蛋白不含信号肽,无跨膜区,二级结构中存在大量α-螺旋。研究结果为进一步开展海南原鸡PDCD10的功能研究奠定了坚实的基础。     

京海黄鸡促性腺激素释放激素1基因克隆与原核表达研究

本试验根据GenBank公布的原鸡（Gallus gallus）促性腺激素释放激素1(gonadotropin releasing hormone 1,GnRH1)基因mRNA序列设计1对引物,采用RT-PCR方法,从京海黄鸡下丘脑组织克隆GnRH1基因编码区序列,对其进行生物信息学分析,并构建原核表达载体pET32a-GnRH1,在大肠杆菌BL21感受态细胞中表达。最终获得了包括编码区、大部分启动子区和部分3′区域在内的长度为352 bp京海黄鸡GnRH1基因序列,该核酸序列与火鸡、鸽子、人、牛、野猪、山羊、绵羊、藏羚羊、马和大鼠的GnRH1基因序列同源性分别为93%、81%、54%、58%、61%、76%、76%、59%、76%和66%。酶切测序鉴定结果显示,成功构建了原核表达载体pET32a-GnRH1;SDS-PAGE检测结果显示,构建的重组质粒在大肠杆菌BL21感受态细胞中成功表达,分子质量为25～28 ku,且上清表达量高于沉淀;Western blotting检测结果显示,在大肠杆菌BL21感受态细胞中表达的蛋白为目的蛋白,且主要为可溶性表达。结果表明,成功克隆了京海黄鸡GnRH1基因,构建了GnRH1原核表达体系,并成功表达目的蛋白,为后续相关研究打下了基础。     

堆形艾美耳球虫巨噬细胞移动抑制因子的克隆和表达

本研究扩增和克隆了堆形艾美耳球虫巨噬细胞移动抑制因子,并在大肠杆菌中表达出MIF重组蛋白。根据GenBank中的MIF mRNA序列,设计特异引物,采用PCR方法以堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库为模板扩增获得MIF基因,将MIF基因片段连接到原核表达载体pET-28a（＋）,构建重组表达质粒pET28a—MIF,并在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达,对表达产物进行Western blot分析。结果从堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库中扩增出MIF基因片段,长度为709bp;经序列分析,扩增片段的核苷酸序列与GenBank中登录的MIF序列的同源性为99．5％;经SDS-PAGE检测表明重组质粒pET（28a）-MIF在大肠杆菌中以包涵体形式表达;Western blot分析证明堆形艾美耳球虫抗血清可与重组表达蛋白特异性结合。本研究结果为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

猪肺炎支原体p97 R1区基因和大肠杆菌LTB基因的重组和表达

本研究从猪肺炎支原体的主要抗原蛋白及其免疫特点出发,将猪肺炎支原体纤毛粘附决定区R1区基因和具有黏膜免疫佐剂作用的大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(the B subunit of heat-labile enterotoxin LTB)基因重组表达,并且单独表达了R1区基因。将扩增的目的片段插入到表达载体pET-28a(+)中,分别构建了两个原核表达质粒pET28a(+)-rLTBR1和pET28a(+)-rR1,诱导表达了两个融合蛋白rLTBR1和rR1。对表达的目的蛋白进行了SDS-PAGE和Western blot检测,结果表明,表达的蛋白为特异的蛋白。本试验为进一步的研究rLTBR1融合蛋白在黏膜免疫方面的作用打下了基础。     

诺如病毒P-partical-GnIH抗原制备及抗原性初步检测

为探索调控家鹅繁殖性能的技术,本研究通过设计合成鹅促性腺激素抑制激素（gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH）序列片段,酶切后连接到诺如病毒（Nov）P基因重组pEGX-4T-1载体,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,提取阳性菌重组质粒,并通过测序和酶切进行验证。将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,利用IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE及Western blotting检测重组蛋白表达。进一步在不同IPTG浓度及诱导时间条件下进行原核表达,确定最佳诱导条件,在最佳条件下的诱导菌液经过离心收集菌体,并超声波破碎离心后对重组蛋白可溶性进行分析。利用xTractor Buffer和Glutathione Superflow树脂对重组蛋白进行纯化,并使用自制的抗GnIH鹅血清及抗鹅二抗通过Western blotting检测重组蛋白。结果显示,重组质粒Nov P-partical-GnIH经双酶切鉴定获得大小约为96 bp的目的基因条带,进一步测序结果证明重组质粒构建成功。诱导表达的重组蛋白分子质量约为64 ku,与预期大小一致,且在37℃、1.0 mmol/L IPTG、诱导2 h条件下表达量最高;菌体超声破碎后经SDS-PAGE检测,重组蛋白主要表达在沉淀中。重组蛋白与GST单抗及抗GnIH阳性血清均能反应,表明此重组蛋白具有较好的反应原性和免疫原性。本研究通过对Nov P-partical-GnIH蛋白原核表达及纯化成功获得了大量纯度较高的重组蛋白,将有助于进一步建立家鹅的繁殖性能免疫调控方法,为提高繁殖性能及调控繁殖机制的研究奠定基础。     

鸽GnIH和GnRH基因克隆及其在不同繁殖阶段下丘脑中的表达

为研究促性腺激素抑制激素（gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH）和促性腺激素释放激素（gonadotropin-releasing hormone,GnRH）基因在鸽繁殖不同阶段下丘脑组织中的表达变化,探讨GnIH和GnRH基因与鸽繁殖调控之间的关系,本研究以鸽cDNA为模板扩增GnIH和GnRH基因CDS区序列并进行克隆测序,采用实时荧光定量PCR技术检测了产蛋前、产蛋后及哺乳期鸽下丘脑组织中GnIH和GnRH基因mRNA表达水平。序列分析结果表明,鸽GnIH基因CDS区全长522 bp,已提交GenBank,登录号：MG589638,编码173个氨基酸,与已知其他鸟类GnIH同源性达85%以上;鸽GnRH基因CDS区全长276 bp,已提交GenBank,登录号：MG589639,编码91个氨基酸,与已知其他鸟类GnRH同源性达80%以上。鸽GnIH前体包含1个GnIH和2个GnIH相关肽（GnIH-RP-1、GnIH-RP-2）,具有典型的"LPXRF"基序;GnRH前体包含1个信号肽、1个GnRH和1个GnRH相关肽（GAP）。实时荧光定量PCR结果表明,产蛋前鸽下丘脑中GnIH基因表达量最高,且极显著高于产蛋后和哺育期（P<0.01）;产蛋后鸽下丘脑中GnRH基因表达量最高,且极显著高于产蛋前和哺育期（P<0.01）;产蛋前鸽下丘脑中GnIH基因表达量极显著高于GnRH基因（P<0.01）,而产蛋后和哺育期鸽下丘脑中GnRH基因表达量极显著或显著高于GnIH基因（P<0.01;P<0.05）。结果表明,GnIH和GnRH基因的表达与母鸽不同繁殖阶段的转变有关,为进一步研究鸽繁殖分子机制奠定基础。     

鸽GnIH和GnRH基因克隆及其在不同繁殖阶段下丘脑中的表达

为研究促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)和促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)基因在鸽繁殖不同阶段下丘脑组织中的表达变化,探讨GnIH和GnRH基因与鸽繁殖调控之间的关系,本研究以鸽cDNA为模板扩增GnIH和GnRH基因CDS区序列并进行克隆测序,采用实时荧光定量PCR技术检测了产蛋前、产蛋后及哺乳期鸽下丘脑组织中GnIH和GnRH基因mRNA表达水平。序列分析结果表明,鸽GnIH基因CDS区全长522bp,已提交GenBank,登录号:MG589638,编码173个氨基酸,与已知其他鸟类GnIH同源性达85%以上;鸽GnRH基因CDS区全长276bp,已提交GenBank,登录号:MG589639,编码91个氨基酸,与已知其他鸟类GnRH同源性达80%以上。鸽GnIH前体包含1个GnIH和2个GnIH相关肽(GnIHRP-1、GnIH-RP-2),具有典型的"LPXRF"基序;GnRH前体包含1个信号肽、1个GnRH和1个GnRH相关肽(GAP)。实时荧光定量PCR结果表明,产蛋前鸽下丘脑中GnIH基因表达量最高,且极显著高于产蛋后和哺育期(P0.01);产蛋后鸽下丘脑中GnRH基因表达量最高,且极显著高于产蛋前和哺育期(P0.01);产蛋前鸽下丘脑中GnIH基因表达量极显著高于GnRH基因(P0.01),而产蛋后和哺育期鸽下丘脑中GnRH基因表达量极显著或显著高于GnIH基因(P0.01;P0.05)。结果表明,GnIH和GnRH基因的表达与母鸽不同繁殖阶段的转变有关,为进一步研究鸽繁殖分子机制奠定基础。     

梭梭HabHLH74转录因子基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用分子生物学技术从梭梭中克隆了HabHLH74转录因子基因, 在大肠杆菌中表达HabHLH74蛋白, 旨在为梭梭抗逆分子机理提供研究基础。研究结果表明：①利用RT-PCR技术成功扩增了HabHLH74的完整编码区cDNA序列, HabHLH74编码区cDNA序列长度为1 218 bp。根据HabHLH74编码区序列预测出其编码蛋白的理化性质。②成功构建了HabHLH74基因的原核表达载体pET28a（+）-HabHLH74, 并在大肠杆菌中成功表达了梭梭HabHLH74蛋白, 其分子量为43.6 kDa。③对诱导条件进行单因素试验后获得的最佳诱导表达条件：诱导剂IPTG浓度为0.5 mmol/L, 诱导温度为37 ℃, 诱导时间为6 h。④对在优化条件下诱导后的菌体进行超声破碎后发现梭梭HabHLH74蛋白主要以包涵体形式存在;降低诱导温度（16 ℃、25 ℃诱导）未能得到可溶性表达的梭梭HabHLH74蛋白。