海南根瘤菌nodABC基因DNA片段的克隆、测序和功能验证*

从海南根瘤菌(Rhizobium hainanense)166提取总DNA，用EcoR I酶进行完全酶切和电泳，然后用苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)042B的nodABC DNA片段作探针进行Southern杂交，发现1条含有nodABC基因DNA片段的阳性条带，大小为2．1-2．5kb。通过电泳回收该DNA片段，用pUCl8作载体连接，并转化大肠杆菌(Eschedchia coli)DH5α，从而构建了含有nodABC的部分基因文库。提取该文库的质粒与nodABC探针做菌落杂交，筛选到nodABC的阳性克隆，称为pUER12。将含有nodABC的DNA片段与EcoR I酶切的pBBR-MCS-5连接，转化大肠杆菌DH5α，获得转化子pBER12。用三亲本杂交方法，把pBERl12转入苜蓿中华根瘤菌AK1657，将其接合子进行结瘤实验，验证了pBER12具有nodABC基因的功能。然后将含有166 nodABC片段的DNA与EcoR I酶切的pGEM-7Z( )连接、测序和进行同源性比较，发现166 nodABC编码的蛋白与苜蓿中华根瘤菌具有高度的同源性。     

抗线虫基因表达载体构建与转化甘蔗研究初报

试验研究利用德国引进的抗线虫基因Hs1pro 1构建表达载体并转化甘蔗 (SaccharumofficinarumL .) ,以获得抗线虫转基因植株。提取克隆载体P1832用NcoⅠ酶切、Klenow补平和SacⅠ酶切 ,回收基因片段 ;提取表达载体pBIL 1用KpnⅠ酶切、T4DNApolymerase补平和SacⅠ酶切 ,回收大片段 ;目的片段用T4DNAligase连接并转化E .coli,鉴定重组质粒 ;用基因枪轰击转化甘蔗品种“ROC”16获得 16株再生苗 ,其中 4株经PCR检测呈阳性 ,通过Southern杂交 ,证明Hs1pro 1基因已整合到其中 3株甘蔗基因组中     

酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因mleA的克隆

苹果酸-乳酸酶是进行MLF的关键酶.该研究以酒类酒球菌31DH(Oenococcus oeni 31DH)的基因组DNA为模板进行其苹果酸-乳酸酶基因mleA的PCR扩增.PCR引物为5'-CGGAATTCATGACAGATC-CAGTAAGTAT-3'和5'-TAGGTACCACACTCTCAACACTCGTAAT-3',引物的5端分别引入EcoRI和KpnI酶切位点.得到的PCR产物约1.6kb.PCR产物回收后用EcoRI-KpnI双酶切,与经同样双酶切的质粒YEp352(大肠杆菌-酵母穿梭载体)进行连接并转化大肠杆菌感受态细胞,筛选重组质粒并用酶切及PCR验证.获得的酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因的重组质粒命名为pLmleA.     

TES基因C端的分段克隆与表达

为了在大肠杆菌中分段表达人类TES基因C端3个顺次排列的LIM结构域,利用PCR技术从含有TES基因全长编码序列的质粒pCMV-HA-TES中扩增出这3个LIM domain基因片段,分别重组入pGEM-T载体,再经酶切后,将获得的目的片段亚克隆入原核表达载体pQE-N1进行融合表达。酶切鉴定及测序结果表明,扩增产物与已知基因序列一致,成功构建了3个目的片段的pQE-N1表达质粒;SDS-PAGE结果显示,IPTG诱导表达出与预期分子质量大小相同的3个融合蛋白。     

海南根瘤菌I66 nodD基因DNA片段的克隆

从海南根瘤菌（Rhizobium hainanense)I66提取总DNA，用XbaI完全酶切，然后用苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti)042B的nodDDNA片段作探针进行Southern杂交，杂现2条含有nodD基因DNA征段的阳性条带，分别为4.0和6.0kb，电泳回收含有4.0-6.0kb的DNA片段，用pUC18作载体连接，并转化E.coliDH5α，构建含有nodD的部分基因文库，提取该文库的质粒与nodD探针做点杂交，筛选到nodD的阳性克隆，称为pUOD75。再将pUOD75的nodD片段克隆到pBBR-MCS-5,构建成pBOD75。用两亲本杂交，把pBOD75转入豌豆根瘤菌蚕豆生物型（Rhizobium eguminosarum bv.viciae)根瘤菌I66nodD基因在毛地黄黄酮诱导下得到表达，说明其表达产物可能具有结瘤调节功能。     

几种水稻联合固氮菌吸氢酶(hup)基因的鉴定及分析

供试菌株Alcaligenes faecalis A15,Enterobacter cloacae EnSs.E·cl-oacae E26,Klebsiella planticola DWUL2.K·oxytoca NG13和Pseudomonassacharophila均能还原2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC),说明它们含有吸氢酶。以Rhizobium japonicum的hup基因为探针进行杂交的结果表明。除E·oloacae E26和K·oxytoca NG13外,其它菌株的DNA与hup探针具有同源性。A·faecalis A15 hup基因位于染色体上‘E·cloacae EnSs则位于较大的一个质粒上。A·faecalis A15和E·Cloacae EnSs的nif基因与hup基因位于同一复制子上。hup基因不具必然的保守性,因此异源hup基因探针不一定都适宜于探测hup基因。     

鸡生长激素受体基因的克隆与部分序列分析

利用高盐法从鸡血中提取高分子量ＤＮＡ，以λＥＭＢＬ３为载体构建了鸡染色体文库，用鸡生长激素受体ｃＤＮＡ基因的部分序列作探针，从文库中筛选得到３个阳性克隆。通过对阳性克隆Ｉ插入片段的酶切和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，表明它含有全长的鸡生长激素受体基因，建立了该基因的限制性酶切图谱。将插入片段亚克隆到ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）质粒上，对含有基因５’端序列的２．５ｋｂＥｃｏＲＩ酶切片段进行了序列分析。     

PRK基因原核表达质粒的构建

以拟南芥cDNA为模板,扩增出PRK基因,构建重组质粒pET-28a(+)-PRK转化大肠杆菌DH5α。经PCR鉴定和酶切鉴定筛选出阳性克隆,将阳性克隆的质粒转化到大肠杆菌表达载体BL21中,构建PRK基因原核表达载体。测序结果表明pET-28a(+)-PRK载体构建成功。     

牛Nanog 原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达

本研究的目的是构建牛Nanog基因原核表达质粒,并在大肠杆菌JM109中诱导其表达。从6周龄的胎牛原始生殖嵴中提取总RNA, 通过RT-PCR扩增Nanog 基因,将其克隆到PMD-18T载体,再从酶切鉴定和测序正确的质粒上切下目的片断,定向克隆到 pGEX-KG表达载体上,获得原核表达质粒pGEX-KG -Nanog ,限制性内切酶分析和DNA测序证明所插入片段为牛Nanog基因编码序列。重组质粒转化大肠杆菌JM109, 在不同的培养温度和不同浓度的IPTG诱导下均获得了高效表达,说明培养温度和IPTG浓度对GST-Nanog融合蛋白在大肠杆菌中的表达影响甚微;经Western Blotting 检测证实该蛋白约60KD, 大小合适,具有GST抗原活性,从而证实目的蛋白为Nanog 蛋白。     

产过敏素的耐氨固氮工程菌的构建

阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae)E26(pMC73A）是带有耐氨质粒的固氮工程菌。本研究通过三亲杂交的方法将带有梨火疫病菌hrp基因簇的重组粘粒pCPP430导入E26(pMC73A)。接合子在番茄叶片上出现也对照DH5（pCPP430）一样典型的过敏反应症状，而出发菌E26(pMC73A)测 没有过敏反应；从接合子抽提到2条质粒DNA带，一条与pCPP430位置相同，大小约50kb，另一条与pMC73A位置相同，大小约7kb；接合子质粒DNA的酶切图谱正好是pCPP430和pMC73A酶切图谱的叠加；用地高辛标亡的hrpN DNA上进行Southerm hybridization分析，在接合子的质粒酶切产物中得到预期的杂交带，而出发菌E26（pMC73A）无任何杂交信号。通过质粒抽提、酶切验证、Southern hybridization分析以及在番茄叶片上的过敏反应测定、均表明生产植物抗性诱导蛋白的耐氨固氮工程菌构建成功。     

Enterotoxigenicity and cytotoxicity of Bacillus thuringiensis strains and development of a process for Cry1Ac production

Bacillus thuringiensis is indistinguishable from Bacillus cereus except for the production of insecticidal crystal proteins (ICPs). B. thuringiensis strains may show enterotoxin profiles and toxin levels similar to those of B. cereus strains isolated from food-poisoning cases. It is important for the food industry and farmers to consider that with the application of B. thuringiensis strains to crops, their spores may be introduced into the human food chain. In this study, 59 B. thuringiensis strains were assayed for their hemolysin BL (HBL) using a BCET-RPLA kit and their cytotoxicity to Chinese hamster ovary (CHO) cells. The enterotoxin titer was as high as that of B. cereus diarrheal-type strain ATCC 49064. In an attempt to obtain a food safety strain for bioinsecticide use, in this study, a 3.5-kb cry1Ac DNA fragment was amplified with PCR from the total DNA of B. thuringiensis subsp. kurstaki CCRC 11502 and cloned into the Bacillus expression vector pHY300PLK. The alpha-amylase promoter, amyE, was then introduced into the promoter region and, afterward, the recombinant plasmid pHYe1Ac35 was introduced into a non-enterotoxigenic and non-cytotoxic B. thuringiensis subsp. kurstaki Tt14 strain. The transformant, without any detectable enterotoxigenicity or cytotoxicity, produced Cry1Ac toxin properly, and its insecticidal activity against Trichoplusia ni larvae was found to be satisfactory.     

苏云金芽孢杆菌高效杀蚊菌株BRC-ZLL13的鉴定

苏云金芽孢杆菌BRC-ZLL13是一株从白玉兰叶片中分离的高效杀蚊菌株。它对埃及伊蚊、白纹伊蚊和致倦库蚊的毒力均高于国际标准菌株以色列亚种IPS82,其生长速度也明显快于后者。本实验对该菌株毒力、血清型、生理生化反应、药敏实验、质粒、杀蚊基因和晶体蛋白等方面的生物学特性进行了研究。结果显示,BRC-ZLL13与对照菌株IPS82同属于以色列亚种,均含有cyt1、cyt2、cry4A、cry4B、cry10和cry11等杀蚊基因,二者在生理生化反应、药敏实验和晶体蛋白图谱等生物学特性上也表现出极高的相似性。另一方面,前者比后者少2条质粒带,这可能是导致BRC-ZLL13生长速度较快的主要原因。综上所述,笔者认为该菌株在公共卫生和生物防治领域具有开发和应用潜力。     

H5N1型禽流感病毒血凝素HA1蛋白在苏云金芽胞杆菌细胞表面的展示及其免疫原性

利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统研究在细胞表面展示H5N1型禽流感病毒HA1蛋白的可行性及其免疫原性，为研制既安全有效又能常温长期保藏和运输的禽流感口服基因工程疫苗奠定基础。用部分ha1基因（ha1p）代替S-层蛋白ctc基因中部且位于表面锚定序列slh下游的片段，构建了融合基因ctc-ha1p和 csa-ctc-ha1p；利用电脉冲转化法将含融合基因的重组质粒转入苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171中，获得了重组菌株BCCH（含ctc-ha1p，并导入一个载有协助细胞表面展示的csaAB操纵子的质粒）和CH（含csa-ctc-ha1p）。通过血凝和血凝抑制试验以及小鼠免疫学实验证实，2个重组菌株均成功地在细胞表面展示了重组HA1蛋白并具有一定的特异性和免疫原性，其中，CH的效果强于BCCH，说明csa-ctc-ha1p这种融合基因的构建方式更胜一筹。研究结果表明，苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统可用来研制禽流感口服疫苗。     

黑龙江凉水自然保护区苏云金芽孢杆菌的收集与鉴定

黑龙江凉水自然保护区是我国现有保存下来的较大片原始红松林基地之一,总面积6394hm^2,森林覆盖率95％以上。本研究从小兴安岭凉水自然保护区采集土样782份,采用醋酸钠培养基结合高温方法筛选土壤中的芽孢杆菌,通过光学显微镜观察鉴定产生伴胞晶体的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis．Bt）。总计分离得到芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌分别为1735株和33株,Bt菌株的分离率和出菌率分别为1．90％和4．22％。利用SDS-PAGE和PCR—RFLP方法对筛选获得的成分离株进行了杀虫晶体蛋白和基因型分析,结果表明14株产菱形伴胞的＆菌株,SDS-PAGE电泳分析芽孢后期产生分子量大小130kD蛋白带,PCR-RFLP分析初步鉴定为crylAc基因,其它产圆形或其它不定形晶体蛋白的＆分离菌中,芽孢后期主要蛋白大小为20～150kD不等,PCR—RFLP方法鉴定结合PCR片段测序分析这些菌株含有新型cry4、cry39和cry40基因等。本研究是“中国助资源收鉴与利用”项目组成部分之一,凉水自然保护区苏云金芽孢杆菌的收集与鉴定目的是要对整个东北地区成资源分布和多样性作一个初步评估,实验结果表明东北森林地区具有丰富多样的威菌株和杀虫基因资源。     

苏云金芽孢杆菌对新秀丽小杆线虫的作用

新秀丽小杆线虫是一种模式生物，能够在室内培养。本研究采用大肠杆菌饲养，获得大量虫源，通过观察该线虫对不同Bt菌株产生毒力反应的情况，筛选含有毒力的Bt菌株。经筛选获得6个菌株的伴孢晶体对新秀丽小杆线虫进行毒性比较，野生菌株Bt-010杀虫快速而持久，毒力强，作用时间大约在36h左右，测得其理想的LC50为0.498µg/ ml。初步纯化其毒性蛋白，发现其主要作用成分是大小为25 – 35 kD的蛋白。DNA Ladder检测发现在这个毒性蛋白不象化学农药一样对线虫的DNA造成损伤。     

Plasmid transfer between introduced and indigenous bacteria in leaf litter, soil and vermicompost as affected by soil invertebrates

 Plasmid transfer between introduced strains of Pseudomonas stutzeri JM302 (pLV1013), Pseudomonas putida PAW340 (pLV1017), Pseudomonas aeruginosa PAO5 (RP4), and Enterobacter cloacae MF10 (RP4), all of them harbouring genetically modified or naturally occurring plasmids and bacteria indigenous to oak leaf litter, soddy-podzolic soil or vermicompost was monitored using non-sterile laboratory microcosms inhabited by the millipede Pachyiulus flavipes, the woodlouse Armadillidium vulgare, or the earthworms Aporrectodea caliginosa and Eisenia fetida, respectively. Plasmid transfer from genetically modified Streptococcus faecalis JH2-2 (pAMβ₁) to Bacillus thuringiensis var. israelensis 1-5 under similar conditions was also followed. A recombinant conjugative plasmid (pLV1017) encoding resistance to antibiotics and expressing catechol 2,3-dioxygenase was transferred into two facultatively anaerobic gram-negative bacteria, isolated from the excrement of A. vulgare. Presumed transconjugants of the facultatively anerobic gram-negative bacteria given above were isolated from the leaves and soil (four strains) and the excrement of the invertebrates (11 strains). They carried the same plasmids and exhibited the same enzymatic activity as the respective inoculant strains; for most of them, however, DNA fingerprints were slightly different. Transfer from S. faecalis JH2-2 to B. thuringiensis var. israelensis of a naturally occurring plasmid, pAMb₁, encoding resistance to erythromycin was observed in vermicompost. Received: 18 November 1997     

紫菜薹快速碱化因子基因BcMF14p的序列与表达分析

快速碱化因子是近年来新发现的一种植物多肽类信号分子。根据已知的普通白菜两用系中可育株系特异表达的快速碱化因子基因BcMF14序列,在其编码框两侧设计引物,从紫菜薹中克隆出该类信号分子基因,命名为BcMF14p(登陆号:EF523517),全长273 bp,不含内含子,编码框包含222个核苷酸,编码73个氨基酸。NCBI在线同源比对结果表明该基因属于快速碱化因子家族,与花椰菜、拟南芥等的快速碱化因子核苷酸序列相似性达到86%以上。对该信号分子的表达进行RT-PCR分析,结果显示BcMF14p只在紫菜薹花蕾、花、角果等生殖器管中表达,在茎、叶等营养器官中不表达,说明BcMF14p可能参与紫菜薹生殖发育过程中的信号传导。     

Purification and characterization of a chimeric Cry1F delta-endotoxin expressed in transgenic cotton plants

Cotton plants were genetically modified through the introduction of a synthetic gene that encodes a Bacillus thuringiensis insecticidal protoxin referred to as Cry1F(synpro). This protoxin is a chimeric, full-length delta-endotoxin of 130 kDa, comprised of the core toxin of Cry1Fa2 protein and parts of the nontoxic portions of Cry1Ca3 and Cry1Ab1 proteins, all of which originated from Bacillus thuringiensis. The Cry1F(synpro) expressed in cotton plants confers resistance to lepidopteran pests. The current study was conducted to characterize the Cry1F(synpro) protein expressed in the transgenic cotton event 281-24-236. Results showed that the full-length Cry1F(synpro) produced in the transgenic cotton plants was sensitive to the host cell protease cleavage, resulting in a truncated, biologically active form (core toxin) with an apparent molecular mass of 65 kDa. This truncated toxin was purified by immunoaffinity chromatography from the cotton leaf extract. N-terminal sequencing, peptide mass fingerprinting by MALDI-TOF MS, and internal peptide sequencing by MS/MS confirmed the identity of the truncated core toxin of Cry1F. The mechanism of truncation was explored with Cry1F(synpro) derived from a recombinant Pseudomonas fluorescens. The transgenic cotton-produced Cry1F showed equivalent insecticidal activity to that of Pseudomonas fluorescens-derived Cry1F.     

来自海南等地的17个Bt分离株质粒多样性分析

本研究采用琼脂糖凝胶电泳对分离白海南岛的12个反菌株与分离自广西、黑龙江的5株＆菌株及2株胁模式菌株进行质粒数量、大小等特征分析。19个供试菌株可区分为16种独特的质粒电泳图谱,充分显示出不同来源肪菌株的质粒多样性。进一步选择了其中的10个菌株,利用包埋法制备琼脂块进行脉冲场凝胶电泳（PFGE）,结果表明苏云金芽孢杆菌大质粒组成特征也具有丰富多样性。但是供试菌株的质粒电泳图谱并未体现与地理和生态特征相关联的特征差异。研究结果初步证实海南分离株S3078—1是一株无内生质粒的助菌株,而S3031-1和S3073—1两个分离株仅有一个大质粒存在,这三个分离株将为进一步研究质粒功能提供初始菌株。本研究进一步暗示将琼脂糖凝胶电泳和脉冲场凝胶电泳结合起来研究质粒特征提高了结果的可靠性。     

人工合成的GFM cry11B基因在大肠杆菌中表达、纯化及抗体制备

摘要: 用限制性内切酶酶切的方法把人工合成的GFM cry11B基因编码区克隆到原核表达载体pGEX-4T-3中，构建成重组表达质粒pGC。在大肠杆菌(Escherichia coli )中表达了GST-GFMCry11B融合蛋白，表达量约占菌体总蛋白的21%，其表达产物主要以包涵体的形式存在。对包涵体蛋白进行可溶性处理，用Glutathione Sephrose 4B纯化出GST-Cry11B融合蛋白。Thrombin酶切后得到Cry11B蛋白，将其作为抗原免疫家兔获得了滴度（ELISA）为1∶8000的抗血清，并具有较强的特异性。