对根结线虫高毒力芽胞杆菌的鉴定及其活性测定

为筛选高效安全的杀虫资源,从海底淤泥中分离到一株对根结线虫(Meloidogyne spp.)高毒力的芽胞杆菌YBf-10,PCR扩增16S rRAN基因,经测序、序列比对分析和系统进化树构建,发现其与坚强芽胞杆菌(Bacillus firmus)Z1-7菌株16S rDNA同源性为99%,初步确定所分离的菌株为坚强芽胞杆菌。将该菌株培养至芽胞成熟,离心取上清,10倍稀释后进行生物测定,发现其对北方根结线虫二龄幼虫有很高的毒力。处理24h校正死亡率达到50%以上,72h达到100%。对根结线虫虫卵进行毒力测定表明,作用48h后能显著抑制虫卵孵化达到80%以上。在培养过程中分不同时段取样,并用所取样品上清进行生物测定,发现从稳定期开始表现出了对北方根结线虫的毒力,在整个稳定期毒力持续增强,直到衰亡期后期,毒力达到最高,表明坚强芽胞杆菌所产生的杀线虫活性物质主要是在稳定期合成的。将发酵上清80℃处理30min毒力无明显变化,通过饱和硫酸铵沉淀上清中蛋白,该蛋白对线虫无明显毒力,但是去蛋白后的上清对线虫仍然具有与未经处理上清相似的杀线虫活性,表明坚强芽胞杆菌产生的杀线虫活性物质是一种非蛋白类的小分子化合物。研究结果提示,本研究所分离的坚强芽胞杆菌在稳定期能够大量合成对线虫具有毒杀活性的小分子化合物,对根结线虫表现出极高毒力,为利用该菌株开发植物寄生线虫生防制剂提供了杀虫资源。     

菲对秀丽隐杆线虫、中杆属和拟丽突属线虫毒性效应研究

采用悉生培养系统,研究不同浓度菲对秀丽隐杆线虫、拟丽突属与中杆属线虫的毒性效应,以及3种线虫对菲的去除作用。结果表明:(1)随着菲浓度的增加,3种线虫存活率逐渐降低。秀丽隐杆线虫在不添加菲的处理中,48 h内出现繁殖,而在添加菲的处理中,即使在最低浓度5 mg/L下,繁殖现象也会消失。中杆属与拟丽突属线虫由于世代时间较长,在本试验周期内均未出现繁殖现象。(2)暴露24 h时,比较不同浓度菲处理下线虫的相对死亡率,得到3种线虫的耐性依次为中杆属线虫≥秀丽隐杆线虫≥拟丽突属线虫,且随菲浓度的增加,秀丽隐杆线虫耐性水平逐渐降低;暴露48 h时中杆属线虫耐性依旧高于拟丽突属,而72 h时中杆属与拟丽突属线虫的耐性趋于一致。(3)3种线虫受菲胁迫后均失去头部正常摆动能力,且秀丽隐杆线虫与拟丽突属线虫体长随菲浓度的增加而逐渐降低。(4)不同种类线虫的添加均能促进菲的去除,不同线虫之间无显著差异。因此,菲会显著抑制3种线虫的存活率和生长发育,抑制秀丽隐杆线虫的繁殖。线虫的存活率受线虫种类、暴露时间、菲浓度及其交互作用的影响显著,其中中杆属线虫对菲的综合耐性最强,3种线虫均能促进溶液中菲的去除。     

十溴联苯醚对秀丽隐杆线虫毒性研究

十溴联苯醚(BDE-209)是一类新型持久性有机污染物,可导致神经系统和生殖发育等多种生理毒性。本文以秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)为模式生物,通过分析十溴联苯醚(BDE-209)对其繁殖、寿命、细胞凋亡以及体内超氧化物歧化酶基因sod-3、类p-53蛋白基因cep-1、细胞色素P450基因cyp35a2以及谷胱甘肽转移酶基因gst-1的影响,来评价BDE-209的生理、细胞及分子水平毒性。试验结果表明,与空白对照相比,BDE-209低剂量(5 mg kg-1)短时间暴露,对秀丽线虫细胞凋亡及产卵影响不显著;高浓度长时间暴露(30 mg kg-1)会导致秀丽隐杆线虫产卵数目下降,寿命缩短,细胞凋亡。Real-time PCR试验表明,低剂量(5 mg kg-1)暴露使得sod-3、cep-1、cyp35a2基因表达显著增加;高剂量暴露(30 mg kg-1),虽然sod-3表达显著增加,但增加幅度低于低浓度暴露组,cep-1、cyp35a2基因表达显著受到抑制。说明长期暴露在高浓度(30 mg kg-1)十溴联苯醚环境中,会促使秀丽隐杆线虫产生氧化应激反应,秀丽隐杆线虫通过调控相关抗氧化基因的表达来修复这种损伤,而高浓度的BDE-209会造成其机体氧化损伤、细胞凋亡及产卵量下降。     

松材线虫及其近缘种热激蛋白90基因(hsp90)克隆与序列分析

热激蛋白90家族(heat shock protein 90(HSP)family)是一种进化保守的蛋白质,在分子伴侣功能、细胞循环调控、抗原传递方面发挥着重要作用。本研究用RT-PCR和RACE技术,克隆得到了松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)和豆伞滑刃线虫(Bursaphelenchus doui)热激蛋白90基因的cDNA全长序列,分别命名为Bx-hsp90、Bm-hsp90和Bd-hsp90,(GenBank登录号分别为:GU013561、HMO34943和HM347331),其cDNA全长分别为2255、2193和2232bp,开放阅读框均为2127bp,编码708个氨基酸,5'端非编码区的长度分别为33、13和13bp,3'端非编码区的长度分别为95、53和92bp。其DNA全长分别为2440、2388和2407bp,包含3个内含子。三者氨基酸序列的一致性为98.78%。进化分析表明,松材线虫、拟松材线虫、豆伞滑刃线虫与秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)的亲缘关系较近,推测三...     

防治大豆胞囊线虫病的土壤真菌的筛选

以辽宁省大豆田土壤中分离筛选获得的39株真菌菌株为研究对象,通过测定不同真菌菌株代谢产物浸出液在不同处理时间对大豆胞囊线虫二龄幼虫(J2)的抑制作用,评价不同菌株对大豆胞囊线虫的生防效果,从而进一步筛选出生防效果较好的菌株。结果表明,与对照相比不同菌株对大豆胞囊线虫的抑制作用具有显著差异。39株被测菌株中有7株表现出较强的抑制作用。其中真菌snf 2455-2的浸出液对大豆胞囊线虫有较强的致死作用。随着处理时间的延长,大多数菌株的抑制效果增强,同时具有抑制效果的菌株也增多。在处理72 h时,与对照相比有17株菌株抑制效果达到了显著水平。     

苏云金芽孢杆菌cry1Aa14基因的分离、克隆及其表达

Bt25是中国自行分离的对小菜蛾(Plutella xylotella)具有高毒力的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis),经PCR-RFLP鉴定含有cry1Aa基因。以全长基因PCR产物的粘端定向克隆的方法,设计1对特异引物,以Bt25质粒DNA为模板扩增cry1Aa全长基因。序列测定结果表明,该基因编码区为3552bp,编码1183个氨基酸,分子量为133．7kD,pI4．755。该基因序列已在GenBank注册,登记号为AY197341,并获得正式命名cry1Aa14。在氨基酸序列918～1180间,和已知的11种cry1Aa存在22-23个氨基酸的差异(其中1094～1097的4个氨基酸无对应序列),而这段区域和Cry1Ab氨基酸序列的对应区域无差异。cry1Aa14全长基因插入Bt表达载体,获得了重组表达质粒pBYB1,转化Bt无晶体突变株HD73cry-,经过抗性筛选、DNA酶切分析和PCR检测,证实转化成功。SDS-PAGE分析表明,该基因在上述受体中能正常表达133kD蛋白。杀虫生物测定结果表明,cry1Aa14表达产物对小菜蛾幼虫具有显著的毒杀作用,与cry1Aa12进行比较,毒力无明显差异。这种单基因菌株的发现及其基因的获得,为害虫抗性研究和高效工程菌的构建提供了重要实验材料。     

基于Illumina测序技术挖掘Bt杀虫基因资源

苏云金芽孢杆菌作为应用最为广泛的生物农药,已经成为化学合成农药必要的补充或替代品,其杀虫蛋白基因已成功的应用到转基因抗虫作物中。本文基于海南五指山和吊罗山热带原始雨林区土壤样品筛选分离的Bt菌株资源,利用第二代测序技术Illumina对分离的特异Bt菌株的杀虫基因进行全面分析,鉴定出新型Bt杀虫蛋白基因25个,其中包括5个新型的营养期杀虫蛋白基因（vip）和3个新型cyt基因。本研究表明第二代DNA测序技术可以高效用于挖掘Bt杀虫基因资源,而获得的新型杀虫蛋白基因将进一步丰富我国能够应用的杀虫基因种类。     

苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白对植物寄生线虫生物测定方法的建立和高毒力菌株的筛选

本研究建立了一套利用苏云金芽胞杆菌伴胞晶体蛋白对植物寄生线虫的生物测定方法。通过该方法从本实验室收集保藏的苏云金芽胞杆菌菌株中筛选出了对植物寄生线虫有毒杀作用的菌株11株。通过复筛确定了10个菌株的伴胞晶体蛋白对植物寄生线虫有活性；SDS-PAGE显示这些菌株的伴胞晶体蛋白组成具有特异性和多样性。其中菌株YBT-021的杀线虫其半致死浓度（LC50）分别为：北方根结线虫(Meloidogyne hapla) 35.62μg/mL，苎麻短体线虫(Pratylenchus scribneri) 75.65μg/mL，苎麻矮化线虫（Tylenchornchus sp.）94.31μg/mL，甘薯茎线虫(Ditylenchus destructor) 215.21μg/mL。     

涕灭威及其复合物对茎线虫DNA的影响

选择了一种毒性很高的氢基甲酸酯农药涕灭威、一种最常见的阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠（SDBS）及一种土壤中普遍存在的天然物质腐殖酸、组成两种复合污染体系；研究了它们对茎线虫的生态毒理效应和对DNA的影响。结果发现，涕灭威-SDBS复合体系在4d内对茎线虫的DNA造成了明显的损伤，而涕灭威-SDBS-腐残酸复合体系在8d内对茎线虫DNA造成的损伤却远远低于未加入腐殖酸的复合体系。关于涕灭威及其复合污染物对茎线虫的生态毒理效应和对DNA损伤的研究尚未见文献报道。     

苏云金芽孢杆菌cry2Aa基因的克隆、表达与活性

B-8-G和Ly30是我国自行分离的对多种重要农业害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）菌株,经PCR-RFLP鉴定均含有cry2Aa基因.根据cry2Aa全长基因序列设计特异引物,以B-8-G总DNA为模板扩增其中的cry2Aa全长基因,与大肠杆菌（Escherichia coli）表达载体pET-21b相连接,获得含有cry2Aa全长基因的重组质粒pET2Aa,该基因在大肠杆菌BL21菌株能够正常表达65 kD蛋白.通过构建Ly30总DNA文库方法从中筛选获得cry2Aa基因,将其连接至Bt-E.coli穿梭表达载体pHT315上,转化Bt无晶体突变株HD-73中,该基因能正常表达65 kD蛋白,并形成立方体状晶体.这两种基因序列已被国际Bt基因命名委员会分别正式命名为cry2Aa9和cry2Aa10.杀虫生物活性测定结果表明cry2Aa基因表达产物对黄胫小车蝗（Oedaleusinfernlis）、尖音库蚊（Culex pipiens）、黑翅伊蚊（Aedes melanopterus）、水稻二化螟（Chilo suppressalis）和小菜蛾（Plutellaxylostella）幼虫均具有显著的毒杀作用.首次报道cry2Aa10基因表达蛋白对蝗虫、库蚊具有杀虫活性.这些基因的获得,将为高效工程菌和抗虫转基因植物的研制提供了新的基因资源.     

Call for Papers--Bt Research （ISSN 1925-1939）

Bt Research （ISSN 1925-1939） is a new launched, open access and peer-reviewed journal that disseminates significant creative reviews and opinions or innovative research work in the area of Bacillus thuringiensis, including the isolation and identification of novel Bt strains, identification of novel Bt toxic genes and their functions, the insecticidal mechanism Bt toxics, Bt genetic engineering, transgenic Bt plants, the resistance mechanism of target-insect to Bt toxins, and the development of novel experimental methods and techniques for Bt Research.     

新型cry7Ab基因的鉴定克隆、表达与杀虫活性

本文应用PCR-RFLP法鉴定出Bt菌株HQ40中含有cry7Ab基因,并根据cry7A全长基因序列设计特异性引物,成功克隆了该基因。该基因核苷酸序列已经在国际基因库GeneBank中登记,其登录号为EU380678,并由Bt δ-内毒素基因国际命名委员会正式命名为cry7Ab4。通过穿梭载体pSTK 将该基因导入Bt 无晶体突变株中,获得工程菌HD7Ab4。SDS-PAGE分析表明cry7Ab4 基因在其中能正常表达,并形成菱形晶体。提取工程菌HD7Ab4和野生菌HQ40晶体蛋白,并在体外用胰蛋白酶酶解活化。分别对直翅目、鳞翅目和鞘翅目的害虫进行了杀虫活性测定。生测结果表明：Cry7Ab4蛋白trypsin酶解液对鞘翅目的大猿叶甲显示了一定的杀虫活性,其野生菌蛋白及表达蛋白酶解液LC50分别为231.59µg/ml及293.79µg/ml。表达产物虽不能使鳞翅目的小菜蛾、甜菜夜蛾和亚洲玉米螟死亡,但对它们的生长发育有明显的体重抑制作用。另外对马铃薯甲虫以及榆蓝叶甲也有体重抑制作用,而对直翅目的东亚飞蝗无毒。     

Environmental fate and effects of Bacillus thuringiensis (Bt) proteins from transgenic crops: a review

This paper reviews the scientific literature addressing the environmental fate and nontarget effects of the Cry protein toxins from Bacillus thuringiensis (Bt), specifically resulting from their expression in transgenic crops. Published literature on analytical methodologies for the detection and quantification of the Cry proteins in environmental matrices is also reviewed, with discussion of the adequacy of the techniques for determining the persistence and mobility of the Bt proteins. In general, assessment of the nontarget effects of Bt protein toxins indicates that there is a low level of hazard to most groups of nontarget organisms, although some investigations are of limited ecological relevance. Some published reports on the persistence of the proteins in soil show short half-lives, whereas others show low-level residues lasting for many months. Improvements in analytical methods will allow a more complete understanding of the fate and significance of Bt proteins in the environment.     

Multiple receptors as targets of Cry toxins in mosquitoes

Bacillus thuringiensis (Bt) produces inclusions that are composed of proteins known as crystal proteins or Cry toxins. Due to their high specificity and their safety to humans and the environment, these Cry toxins are considered to be valuable alternatives to chemical pesticides in insect control programs. It is believed that Cry toxin-induced membrane pore formation is responsible for insect toxicity. The molecular mechanism of pore formation involves recognition and subsequent binding of the toxin to membrane receptors. This binding is accompanied by toxin oligomerization and transfer of domain I helices of the toxin to the lipid-water interface. This toxin insertion creates pores that lyse the cells. Several receptors from lepidopteran, coleopteran, and dipteran insects have been well characterized. This paper provides an overview of the understanding of the interactions between Cry toxin and multiple receptors in mosquitoes, in particular Aedes aegypti and reviews the manner by which the receptors were identified and characterized, with a focus on three proteins, cadherin, alkaline phosphatase, and aminopeptidase-N.     

苏云金芽孢杆菌WB9菌株cry2Ac4基因的克隆及表达

WB9是我国分离自武夷山的对多种重要农业害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)菌株,经PCR-RFLP鉴定含有cry2Ac基因。根据cry2基因序列设计引物,以WB9质粒为模板扩增cry2Ac全长基因,与大肠杆菌(Escherichia coli)克隆载体pMD18-T连接获得含有cry2Ac全长基因的重组质粒pMD2Ac并测序。该基因在GenBank上登录号为DQ361267,被Bt国际命名委员会正式命名为cry2Ac4。通过亚克隆方法将cry2Ac4基因插入穿梭表达载体pHT315获得重组表达质粒pHT2Ac,将其转化大肠杆菌SCS110和Bt无晶体突变株HD73 Cry-,得到的工程菌能正常表达70 kD蛋白,形成方形晶体。生物测定结果表明,cry2Ac4基因表达产物对桔小实蝇(Bactrocera dorsalis Hendel)幼虫具有显著的毒杀作用,但对小菜蛾(Plutella xylostella)和致倦库蚊(Culex fatlgans)幼虫基本没有效果。     

Effects of physicochemical interactions and microbial activity on the persistence of Cry1Aa Bt (Bacillus thuringiensis) toxin in soil

Genetically modified crops, that produce Cry insecticidal crystal proteins (Cry) from Bacillus thuringiensis (Bt), release these toxins into soils through root exudates and upon decomposition of residues. The fate of these toxins in soil has not yet been clearly elucidated. Persistence can be influenced by biotic (degradation by microorganisms) and abiotic factors (physicochemical interactions with soil components, especially adsorption). The aim of this study was to follow the fate of Cry1Aa Bt toxin in contrasting soils subjected to different treatments to enhance or inhibit microbial activity, in order to establish the importance of biotic and abiotic processes for the fate of Bt toxin. The toxin was efficiently extracted from each soil using an alkaline buffer containing a protein, bovine serum albumin, and a nonionic surfactant, Tween 20. The marked decline of extractable toxin after incubation of weeks to months was soil-dependent. The decrease of extractable toxin with incubation time was not related to microbial degradation but mainly to physicochemical interactions with the surfaces that may decrease immunochemical detectability or enhance protein fixation. Hydrophobic interactions may play an important role in determining the interaction of the toxin with surfaces.     

黑龙江凉水自然保护区苏云金芽孢杆菌的收集与鉴定

黑龙江凉水自然保护区是我国现有保存下来的较大片原始红松林基地之一,总面积6394hm^2,森林覆盖率95％以上。本研究从小兴安岭凉水自然保护区采集土样782份,采用醋酸钠培养基结合高温方法筛选土壤中的芽孢杆菌,通过光学显微镜观察鉴定产生伴胞晶体的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis．Bt）。总计分离得到芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌分别为1735株和33株,Bt菌株的分离率和出菌率分别为1．90％和4．22％。利用SDS-PAGE和PCR—RFLP方法对筛选获得的成分离株进行了杀虫晶体蛋白和基因型分析,结果表明14株产菱形伴胞的＆菌株,SDS-PAGE电泳分析芽孢后期产生分子量大小130kD蛋白带,PCR-RFLP分析初步鉴定为crylAc基因,其它产圆形或其它不定形晶体蛋白的＆分离菌中,芽孢后期主要蛋白大小为20～150kD不等,PCR—RFLP方法鉴定结合PCR片段测序分析这些菌株含有新型cry4、cry39和cry40基因等。本研究是“中国助资源收鉴与利用”项目组成部分之一,凉水自然保护区苏云金芽孢杆菌的收集与鉴定目的是要对整个东北地区成资源分布和多样性作一个初步评估,实验结果表明东北森林地区具有丰富多样的威菌株和杀虫基因资源。     

苏云金芽孢杆菌Cry1Ac杀虫晶体蛋白及其分子设计

Cry1Ac编码的杀虫晶体蛋白是苏云金芽孢杆菌（Bt）产生的多种杀虫晶体蛋白中对鳞翅目昆虫有很高毒性的蛋白。第一个Cry1Ac杀虫晶体蛋白最早在库斯塔克亚种HD73中以伴胞晶体形式分离获得,其编码区为3534bp,编码蛋白分子量为133kD,含1178个氨基酸,等电点为4.84。白此以来,Cry1Ac杀虫晶体蛋白结构、功能以及应用研究一直是Bt杀虫晶体蛋白研究的重要方向。本文介绍了苏云金芽孢杆菌中应用最广泛的Cry1Ac杀虫晶体蛋白家族的结构、功能及其基因分类,并进一步就基于苏云金芽孢杆菌Cry1Ac杀虫晶体蛋白的基因工程研究做了分析,提出了持续利用Bt Cry1Ac杀虫晶体蛋白的一些见解。     

苏云金芽孢杆菌基因组研究概况

迄今为止，全球已有2个Bt株菌株完成了全基因组测序，1个Bt菌株正在拼接中，15个Bt菌株正在进行测序中。已有22个晚质粒完成了全序列测定。助是作为生物农药使用最广泛的微生物菌株，也是最为成功地将其杀虫晶体蛋白基因应用于植物转基因的微生物。在基因组进化、新基因发现、基因表达调控等方面一直是科学家研究的热点，并取得了相当多的成果。本文概述了苏云金芽孢杆菌基因组测序现状、基因组特征及比较基因学等方面的研究进展。