黄瓜绿斑驳花叶病毒CGMMV及葫芦科作物 抗性遗传改良研究进展

黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）是侵染葫芦科作物的重要病毒之一,对葫芦科作物的生产造成了严重威胁。本文对CGMMV的分布和分类,全基因组序列、进化关系及结构,CGMMV的检测方法,以及葫芦科CGMMV抗性的遗传分析及遗传改良包括抗性材料的筛选及种间杂交、基于基因工程的遗传改良、miRNAs测序及人工miRNAs等方面的研究进展进行综述。另外,对葫芦科作物CGMMV抗性遗传改良中存在的问题及应对策略进行了探讨和展望。     

免疫斑点法和免疫捕获RT-PCR检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是葫芦科作物上重要的病毒之一.用提纯的黄瓜绿斑驳花叶病毒免疫新西兰大白兔制备CGMMV的多克隆抗体.该多克隆抗体的间接ELISA效价达1∶512 000,与CGMMV17.5 ku外壳蛋白有特异性反应,而与烟草花叶病毒、齿兰环斑病毒和健康植物没有任何反应.用ACP-ELISA分析多抗灵敏度表明多抗检测1∶40 960倍稀释的CGMMV病叶时仍呈阳性反应.用该多抗建立了检测CGMMV的免疫斑点法(dot-ELISA)和免疫捕获RT-PCR方法(IC-RT-PCR).病叶汁液可被dot-ELISA检出的最大稀释度为1∶10 240.IC-RT-PCR从感染CGMMV的病叶组织中扩增到与预期大小相同的480 bp DNA条带,且当CGMMV病叶稀释1∶163 840倍时检测仍呈阳性.检测CGMMV的dot-ELISA和IC-RT-PCR方法的建立为该病毒病的诊断和控制提供了技术支撑.     

检疫性有害生物——黄瓜绿斑驳花叶病毒

黄瓜绿斑驳花叶病毒是烟草花叶病毒属成员之一,对葫芦科作物生产造成巨大损失。近年来,我国葫芦科作物种子的进口数量逐年增加,特别是每年都要从CGMMV的发生地日本引进种子,该病毒随进境种子传入的风险很高。笔者就CGMMV的分子生物学特性,检测方法,以及防控措施等方面的研究结果进行了综述,望能为该病毒的检测和防治提供参考。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒多克隆抗体制备及检测应用

将黄瓜绿斑驳花叶病毒(cucumber green mottle mosaicvirus,CGMMV)辽宁分离物繁殖在葫芦(Lagenaria siceraria)上,用葫芦作为繁殖寄主进行病毒提纯,将提纯病毒制剂免疫家兔制备多克隆抗体,抗体效价为1∶320000,建立了间接ELISA检测黄瓜绿斑驳花叶病毒方法,检测病汁液的灵敏度为1∶32000,检测提纯病毒的灵敏度为4.75×10-5mg。     

多角体病毒琼脂免疫双扩散和ELISA检测研究

用提纯的SpltNPV、AcNPV病毒粒子分别为免疫抗原获得抗血清,以此抗血清为抗体,提纯的SpltNPV、AcNPV多角体裂解所得粗提纯病毒粒子为检测抗原,初步建立两种病毒的琼脂免疫双扩散法和ELISA间接检测方法.琼脂免疫双扩散结果表明：所得抗血清能识别粗提抗原,但不能与细胞培养的病毒粒子反应.两种病毒I-ELISA检测灵敏度分别达11.23、11.67 ng.     

大蒜茎尖组培苗的检测

从市售阿城紫皮蒜生长的叶片经ＰＥＣ沉淀差速离心提纯,获得复合病毒制剂,得率为４．９０ｍｍ（１００ｇ）－１叶。电镜观察病毒粒体为长度５５０～８００ｎｍ的线状物,经抗血清测定主要为洋葱黄矮病毒（ＯＹＤＶ）和大蒜潜隐病毒（ＧＬＶ）。用复合病毒制剂免疫制备的抗血清效价为１０２４～２０４８。ＯＹＤＶ抗血清检测茎尖脱毒组培苗,脱毒率为５０％左右,用ＧＬＶ抗血清检测,脱毒率为９５％～９７％,复合病毒抗血清检测结果与ＯＹＤＶ相同。证明复合病毒抗血清可用于组培苗的检测。组培脱毒大蒜在田间种植１年后发病率为５０％,３年后达８０％。茎尖组培脱毒率不高。需用抗血清逐株检测挑选,淘汰病苗,才能获得健康无毒的大蒜群体。     

甜菜黑色焦枯病毒BBSV的提纯与抗血清制备

用病毒分离提纯技术及血清学制备技术对甜菜黑色焦枯病毒进行生物学及血清学研究，探讨制备高效价抗血清的有关技术问题，本次试验中抗血清效价测定为1：512，用已知纯度BBSV做免疫电镜观察证明抗血清效果良好。     

黄瓜绿斑驳花叶病毒外壳蛋白基因原核表达及抗血清制备

将黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的外壳蛋白(coat protein,CP)基因克隆到原核表达载体pEHISTEV上获得pEHISTEV-CGMMV-CP,转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导,表达出分子量为19.5 kD的CGMMV CP融合蛋白。切胶回收诱导表达的CGMMV CP免疫家兔,制备抗血清。Western Blotting检测发现,制备的抗血清能与CGMMV CP发生特异性免疫反应,与同属的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)无反应。琼脂双扩散试验测定,制备抗血清的效价为1∶16,ELISA测定效价为1∶1024。该血清特异性强、效价高,可用于CGMMV的检测。     

苹果褪绿叶斑病毒的抗血清制备及其检测应用研究

用昆诺藜(Chenopodium quinoa)为诊断和分离寄主,从混合感染潜隐病毒的苹果花瓣中分离纯化出苹果褪绿叶斑病毒。经纯化的病毒,在繁殖寄主—昆诺藜上增殖扩大。采用聚乙二醇沉淀和差速离心技术,从感染病毒的昆诺藜中提纯出褪绿叶斑病毒作为抗原,免疫家兔,经心脏采血,制备出了该病毒的抗血清。用制备的抗血清进行了检测褪绿叶斑病毒的方法和对脱毒苗以及生产苹果树的带毒情况作了初步研究。A蛋白酶联免疫法适于检测苹果褪绿叶斑病毒。     

苹果茎沟病毒的分离纯化及血清学检测

 从苹果样品中分离到苹果茎沟病毒（ASGV）,汁液摩擦接种该病毒可侵染昆诺藜（Chenopodium quinoa）、苋色藜（C.amaranticolor）、心叶烟（Nicotiana glutinosa）、灰藜（C.niurale）、菜豆（Phaseolus vulgaris "pinto"）和西方烟（N.accidentalis"37B"）。在昆诺藜叶片汁液中,该病毒体外存活期为3d左右（25℃）,热钝化点60～65℃（10min）,稀释限点10#+(-4)。提纯病毒在-20℃下,存活期为6个月以上。提纯病毒液A260/A280=1.18。病毒粒子呈线状,大小为620～680nm×11～12nm。衣壳蛋白分子量为31.0kD。用提纯病毒免疫大耳白兔,所获抗血清用于检测提纯病毒样品和感染ASGV的昆诺藜叶片,其效价毛细管微量沉淀反应法为1:512,酶联免疫吸附法为1:10#+4以上。用该抗血清可检测出感染ASGV的苹果试管苗和田间生长植株叶片。     

侵染丝瓜的黄瓜绿斑驳花叶病毒山东分离物分子鉴定

2013年,在山东泰安采集到疑似感染黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的丝瓜样品,利用该病毒外壳蛋白(Coat protein,CP)特异引物CG-CPF/CPR对样品进行扩增并测序。所得序列(GenBank登录号:KJ187042)经NCBI BLAST比对,与已登录的CGMMV序列的相似性均大于92.6%,确定为黄瓜绿斑驳花叶病毒。系统进化分析表明,CGMMV山东丝瓜分离物(CGMMV-SDLoofah)与辽宁分离物(CGMMV-LN)等大多数国内CGMMV分离物同聚为一个进化组,从而进一步确定了CGMMV山东丝瓜病毒分离物为黄瓜绿斑驳花叶病毒。这是首次报道黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染丝瓜。     

侵染广东连州葫芦的黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子特征 及致病性分析

【目的】黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)是侵染瓜类作物的主要病毒之一,对瓜类产业造成巨大的危害。本研究旨在探明侵染广东省连州市葫芦的CGMMV分离物(CGMMV-GDLZ)分子特征及其在系统进化中的地位,并测定其对黄瓜、葫芦和西瓜的致病性,为CGMMV的防控提供理论依据。【方法】从广东省连州市葫芦种植基地采集2个疑似CGMMV侵染的病样以及1个无症状样品,提取总RNA,根据CGMMV参考序列（GenBank登录号：KX883801）设计引物进行RT-PCR检测,引物序列为F：CCACGAGTTGTTTCCTAATGCTG/R：TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT,退火温度53℃,扩增长度890 bp。将CGMMV全长序列分为前后两段,前半段1—3 511 nt,扩增引物序列为F：AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGTTTTAATTTTTATAA TTAAACAAA/R：AGTTCTGCATTAATTGCTATTTGGTAGGCACAGTGGTAG;后半段3 301—6 423 nt,扩增引物序列为F：GTGCGTGCTACCCCGACTCCAATAGGTTTGATTGCCCGTG/R：GGTGGAGATGCCATGCCGACCCTGGGCCCCTACCCGGGGAAAGG。将前后两段PCR产物通过同源重组的方法克隆到pCB301双元载体上,测序得到CGMMV-GDLZ分离物全长序列。利用CGMMV-GDLZ分离物全长序列在NCBI中进行Blast分析,然后通过MEGA7软件对CGMMV-GDLZ以及其他已经报道的CGMMV分离物进行系统进化树分析。将构建好的pCB301-CGMMV侵染性克隆注射接种本生烟验证其侵染性,然后再注射接种黄瓜、葫芦和西瓜的子叶,测定CGMMV-GDLZ分离物的致病性。【结果】RT-PCR结果证实,广东省连州市葫芦病样感染了CGMMV。CGMMV-GDLZ分离物全长序列为6 423 nt,编码4个蛋白,分别为129K复制酶（61—3 495 nt）、186K复制相关蛋白（61—5 007 nt）、运动蛋白MP（4 994—5 788 nt）和外壳蛋白CP（5 763—6 248 nt）。CGMMV-GDLZ核苷酸序列与CGMMV-eWT分离物（GenBank登录号：KY753928）同源性最高,为99.97%。系统进化树分析结果显示,CGMMV-GDLZ分离物与日本、韩国等东亚CGMMV分离物同属Group 1,在遗传距离上与山东、浙江和河南的CGMMV分离物最接近。pCB301-CGMMV侵染性克隆可以系统侵染本生烟,造成本生烟上部叶片出现皱缩、斑驳、凸起等症状,RT-PCR和Western blot进一步确认了侵染性克隆的侵染性。注射接种CGMMV-GDLZ分离物后15 dpi,葫芦和西瓜即可产生斑驳、花叶、突起、生长迟缓等症状,24 dpi时症状更明显。而15 dpi时,CGMMV-GDLZ分离物在黄瓜上的症状不明显,与未接种对照植株几乎没有区别;将植株从控温接种室移入网室中,30 dpi时,黄瓜植株上部叶片开始出现斑驳和花叶,40 dpi时,症状已经非常明显。RT-PCR和Western blot检测进一步确认了上述结果。【结论】侵染广东省连州市葫芦的CGMMV-GDLZ分离物与山东、浙江和河南的CGMMV分离物很可能具有相同的传染源;CGMMV-GDLZ分离物可以侵染本生烟、黄瓜、葫芦和西瓜等作物,但对这些作物的致病性存在差异。     

TC/IC-RT-PCR检测黄瓜绿斑驳花叶病毒

根据GenBank上登录的黄瓜绿斑驳花叶病毒(CGMMV)外壳蛋白基因保守序列,设计特异性引物,利用试管捕捉RT-PCR(TC-RT-PCR)和免疫捕捉RT-PCR(IC-RT-PCR)技术对黄瓜绿斑驳花叶病毒进行检测.结果表明,TC-RT-PCR和IC-RT-PCR均具有良好的特异性,检测灵敏度分别比DAS-ELISA高10和100倍;通过对一批进境黄瓜样品的检测,验证了2种检测技术的实际应用效果.因此,本研究建立的TC-RT-PCR和IC-RT-PCR检测技术,可有效应用于CGMMV的快速检测.     

甘蔗花叶病毒的提纯及抗血清制备

以ＳｃＭＶ－Ａ为材料,采用ＰＥＧ沉淀结合差速离心技术,经１０－４０％蔗糖密度梯度离心后再经浓缩后即为提纯病毒制剂。该提纯病毒具有典型的核蛋白吸收曲线,最大紫外吸收值在２５７ｎｍ处,最小紫外吸收值为２４０ｎｍ,Ａ２６０／２８０＝１．６８,病毒产量可达１．２５－１．３７ｍｇ／ｋｇ。将提纯病毒免疫家兔制备抗血清,所制备的抗血清经Ａ蛋白酶联免疫吸附法测定,其效价为１／１０２４,且可用于检测甘蔗花叶病毒。     

引进种质西瓜中黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测

从日本引进的西瓜种子隔离种植后,采用生物学、双抗体夹心酶联方法及反转录PCR(RT-PCR)技术对其幼苗样品进行了黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)的检测,结果表明:生物学试验接种的黄瓜健康植株全部发病;双抗体夹心酶联试验结果均为阳性;RT-PCR反应后进行1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果出现预期的715 bp特异性扩增产物。3种方法均表明此次从日本引进的西瓜种质已经受到黄瓜绿斑驳花叶病毒的侵染,须做销毁处理。试验结果表明,采用3种方法中的2种对样品进行检测,即可以根据检测结果确诊被检对象是否带有CGMMV病毒。     

香石竹斑驳病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清制备

 香石竹斑驳病毒（Carnation mottle virus,CarMV）是侵染香石竹的主要病毒。本研究从已鉴定的CarMV毒源植物中提取总RNA, 克隆外壳蛋白（cp）基因后构建pET30a CP重组质粒,并转入BL21（DE3）pLysS进行原核表达。通过对诱导温度、初菌浓度、IPTG的浓度等表达条件进行优化,目的蛋白在37℃, IPTG 终浓度为10mmol/L的条件下,诱导表达6h后获得最高表达量。采用割胶的方法纯化cp蛋白,纯化后的目的蛋白免疫小鼠获得了特异性抗血清。经Western blot检测,结果表明所制备的抗血清与诱导表达的重组蛋白及接种CarMV的香石竹样品均发生特异性结合。利用所制备抗血清对昆明地区的48个香石竹样品进行抽检,结果表明香石竹样品的带毒率为79.2%。本研究为大规模抗血清生产、检测应用和深入研究该病毒cp基因与寄主的互作奠定基础。     

Small RNA deep sequencing reveals the presence of multiple viral infections in cucurbit crops in Guangdong,China

Viral diseases are among the most critical damaging factors that impose a global threat to the cucurbit industry. China is the world's leading country for the production and consumption of cucurbits. Guangdong, a province in southern China dominated by the tropical and subtropical climate, favors the survival of different plant viruses and their vectors. Five main cucurbit crops showing various disease symptoms were surveyed and collected to identify viruses infecting cucurbits in Guangdong during 2018–2020. In the field, the incidence ranged from 5–30%, or even 60–100% in the case of severely infected cucurbits. A total of 357 symptomatic samples were collected and subsequently screened for cucurbit viruses by small RNA deep sequencing and assembly (sRSA). Seventeen virus species belonging to 10 genera were identified in the five main cucurbit crops. The most common viruses were papaya ringspot virus (PRSV; Potyvirus), zucchini tigre mosaic virus (ZTMV; Potyvirus), zucchini yellow mosaic virus (ZYMV; Potyvirus), and watermelon silver mottle virus (WSMoV; Orthotospovirus), with infection rates of 24.4, 19.0, 17.1, and 14.3%, respectively. Notably, the most prevalent viruses were melon yellow spot orthotospovirus (MYSV) in cucumber, PRSV in squash, cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV; Tobamovirus) in bottle gourd, WSMoV in white gourd, and ZYMV in luffa. Mixed infections were prevalent, and the types of mixed infections varied substantially in different cucurbit crops. Moreover, the full-length nucleotide sequences of watermelon green mottle mosaic virus (WGMMV), CGMMV, and watermelon virus A (WVA; Wamavirus) identified in bottle gourd were cloned and analyzed. This study is the first reporting WGMMV infecting bottle gourd in China mainland. In summary, the results demonstrate that in Guangdong, the most prevalent viruses belong to potyviruses, orthotospoviruses, and tobamoviruses groups. The findings will facilitate agricultural researchers and farmers to plan and implement effective disease control strategies aiming at timely detection and management of cucurbit-infecting viral pathogens.     

茶尺蠖核型多角体病毒多克隆抗体的制备及检测应用

以纯化的茶尺蠖核型多角体病毒(Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus,EcobNPV)作为抗原免疫大耳白兔,获得多克隆抗体,Indirect-ELISA效价为1∶51 200;工作浓度分别为EcobNPV 1∶1 600、兔抗血清1∶3 200。用所制备的多克隆抗体对提纯的多角体进行Western-blot分析表明制得的抗体对茶尺蠖核型多角体病毒有良好的特异性。应用于不同来源茶园昆虫多角体病毒分离株的检测,取得了理想的检测效果。     

水稻条纹叶枯病的研究 Ⅲ.病害的病原性质

水稻条纹叶枯病系由水稻条纹病毒(Rice stripe virus,RSV)所致.病毒由灰飞虱(Laodelphax striatellus)以持久性方式并经卵传播,介体灰飞虱有明显的间歇传毒现象.提纯病毒制剂具有典型的核蛋白紫外吸收曲线,最大吸收260nm,最小吸收245nm,A260/280=1.54.病毒粒体长丝状,粒体直径约8nm,与日本的水稻条纹病毒抗血清呈阳性反应.将提纯病毒制剂免疫家兔制备抗血清,其效价可达1∶2048.采用该抗血清,通过免疫扩散和ELISA间接法反应,可很灵敏地检测病叶中的RSV.