Cloning and Sequence Analysis of GBSS Ⅰ and SSⅢ from the Leaves in Musa spp.

以香蕉栽培品种“天宝蕉”(Musa spp.cv.Tianbao)的叶片为材料,采用同源克隆法结合RT-PCR和RACE法,首次从香蕉中获得颗粒结合性淀粉合成酶Ⅰ (Granule-Bound Starch SynthaseⅠ,GBSS Ⅰ)基因的cDNA全长片段和可溶性淀粉合成酶Ⅲ(Soluble Starch SynthaseⅢ,SSⅢ)基因的ORF,并分别对其核酸序列及其推导的氨基酸序列进行了生物信息学分析.香蕉叶片GBSS Ⅰ基因全长2 277 bp,编码616个氨基酸；SSⅢ基因ORF长3009bp,编码1 054个氨基酸.GBSSⅠ和SSⅢ的克隆为从分子生物学水平上研究香蕉叶片中参与淀粉合成的关键酶的表达与调控奠定重要基础.     

颗粒结合型淀粉合成酶研究进展

本文综述了小麦胚乳中合成直链淀粉的关键酶——颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS)的研究进展，展望了GBSS的研究前景。小麦中的GBSS基因在种子中特异表达；控制3个Waxy，位点的基因Wx—A1、Wx—B1和Wx—D1，分别位于7AS、4AL和7DS上；六倍体小麦和二倍体小麦中3个GBSS的DNA序列从起始密码子到终止密码子，Wx—A1为2781bp，Wx-B1为2794bp，Wx—D1为2862bp。基因的完全编码区含有11个外显子和10个内含子，在核苷酸序列上三个糯基因彼此之间有惊人的同源性；研究表明，直链淀粉含量和淀粉糊化特性受Wx—B1的影响最大，其次是Wx-D1缺失蛋白，Wx-A1缺失蛋白的影响最小。GBSS的鉴定技术包括I2—KI染色、电泳和分子标记技术鉴定。     

甘蔗叶片蔗糖磷酸合成酶基因cDNA克隆及序列分析

蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase, SPS）是高等植物体内控制蔗糖合成的关键酶之一。根据已报道的甘蔗蔗糖磷酸合成酶基因SoSPE2（GenBank登录号：AB001338.1）序列，采用RT-PCR方法从甘蔗（Saccharum officinarum FN95-1702）叶片中克隆获得SPS基因的eDNA片段。测序结果表明，该eDNA长3013 bp，其中第59-2953位是该基因的开放阅读框（ORF），编码964个氨基酸。与GenBank上已公布的序列比对分析表明，二者序列相似性达99.07％，氨基酸序列相似性达98.86％。     

野生香蕉几丁质酶基因的克隆与序列分析

以野生香蕉叶片为试材,采用RT-PCR结合RACE法,通过T/A克隆测序,获得野生香蕉几丁质酶基因全长序列,并在GenBank登录(登录号为:FJ858155)。野生香蕉几丁质酶基因(ChiⅠ1)全长1115bp,包含924bp的ORF、14bp的5'非编码区、177bp的3'非编码区及17bp3'poly(A)尾。该基因开放阅读框编码307个氨基酸,分子量为32424.1u,预测的理论等电点为6.28,其结构包括信号肽、几丁质结合区、糖苷水解酶区。蛋白结构分析结果表明,该基因编码蛋白为跨膜蛋白,存在于胞外。野生香蕉几丁质酶基因(ChiⅠ1)属于酸性几丁质酶classⅠb,与大蕉几丁质酶classⅠb相似性仅为59.4%。结构分析结果表明,该基因可能具有几丁质酶/溶菌酶特点,且在过敏反应中起重要作用。     

香蕉ACC合成酶含3′末端的cDNA克隆

采用3′RACE方法对香蕉（Musa AAA Cavendish Subgroup）ACC合成酶含3′末端的cDNA进行扩增，扩增产物被克隆到pCR2.1载体上，转化大肠杆菌DH5α，筛选到重组质粒（pACS2），并对插入片段进行序列测定。结果表明，3′ARCE产物长1680bp，其中一个开放读框内的核苷酸序列编码444个氨基酸，氨基酸序列包括了ACC合成酶中所应具有的7个高度保守区。同时该产物还有长269bp的3′末端，并具有完整的Poly（A）尾（24mer）。     

茶氨酸合成酶基因的全长cDNA克隆及序列分析

采用SMART RACE技术成功克隆了安吉白茶茶氨酸合成酶基因（TS）的全长cDNA序列,并将其登录Genbank,登录号为JN226569。TS基因的cDNA全长为1503bp,开放阅读框（ORF）为1071bp,编码356个氨基酸。经生物信息学分析,TS蛋白的氨基酸残基数为356,分子量为39250.3Da,理论等电点（PI）为5.79,其氨基酸序列中可能不存在卷曲螺旋结构。TS蛋白不存在信号肽序列,不发生跨膜运动,属于亲水性的非分泌蛋白,其磷酸化位点有26个。通过亚细胞定位预测,安吉白茶TS蛋白是一种细胞质蛋白。克隆茶氨酸合成酶基因的全长cDNA序列,对于利用生物技术手段改良茶树品种,以调控茶树中茶氨酸的含量具有重要意义。     

香蕉ACC合成酶含3＇末端的cDNA克隆

采用3'RACE方法对香蕉(Musa AAA Cavendish Subgroup)ACC合成酶含3'末端的cDNA进行扩增,扩增产物被克隆到pCR*2.1载体上,转化大肠杆菌DH5α,筛选到重组质粒(pACS2),并对插入片段进行序列测定。结果表明,3'RACE产物长1 680 bp,其中一个开放读框内的核苷酸序列编码444个氨基酸,氨基酸序列包括了ACC合成酶中所应具有的7个高度保守区。同时该产物还有长269 bp的3'末端,并具有完整的Poly(A)尾(24mer)。     

小麦胚乳淀粉合成酶基因研究进展

很多研究表明。小麦胚乳淀粉的合成至少需要四类酶——腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶和淀粉去分支酶，这四类酶的基因克隆和特性的研究有重要进展。目前，已从六倍体小麦发育胚乳的eDNA文库中获得AGPase两个亚基、gbssⅠ、ssⅠ、ssⅡ、ssⅢ、sheⅠ、sbeⅡ和sul(dbe)等基因的cDNA；从六倍体小麦的D组供体Triticum tauschii基因组文库中获得ssⅠ、ssⅠ、ssⅢ、sbeⅠ和sbeⅡ的gDNAs；从六倍体中只获得野生型和突变型的gbssⅠ(wx)基因。除编码AGPase大亚基的基因和sul基因未进行定位外，ssⅢ位于第一群染色体上，sheⅡ位于2DL上，其余基因均位于第七群染色体上。     

木奈果实中花青素合成酶基因PsANS的克隆及原核表达分析

根据NCBI数据库中已知的蔷薇科植物花青素合成酶基因序列设计特异引物,从本实验室已经构建好的木奈成熟果实均一化全长cDNA文库中筛选分离得到了一个编码花青素合成酶的cDNA:基因命名为PsANS,登录号:JN560957。该cDNA长1 478 bp,包含137 bp 5’非编码区,267 bp 3’非编码区,开放阅读框长度为1 074 bp。PsANS编码358个氨基酸,分子量为40.41 ku,理论等电点为5.35。经BLAST分析对比发现,PsANS氨基酸序列与甜樱桃、苹果和草莓的ANS氨基酸同源性都很高,分别为98%、93%和89%。将PsANS亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1和pET-32a上,在大肠杆菌BL21中经1mmol/L ITPG诱导表达获得了木奈PsANS融合表达蛋白,其分子量大小与预期的一致,进一步确认本试验克隆得到的PsANS为木奈花青素合成酶基因。     

不同小麦品种籽粒淀粉合成酶基因的表达及其与淀粉积累的关系

为探寻不同专用类型小麦籽粒品质调控的途径,以不同专用类型小麦品种为材料,比较了其籽粒淀粉合成酶基因表达、淀粉合成酶活性以及淀粉积累速率动态特征,并分析了三者之间的相关性。结果表明,整个灌浆期间,籽粒淀粉合成酶基因（AGPase1、GBSSI、SSSIII、SBEI）相对表达量、淀粉合成酶（AGPase、GBSS、SSS、SBE）活性及直、支链淀粉积累速率均表现为强筋小麦中优9507〉中筋小麦淮麦18〉弱筋小麦宁麦9号〉糯小麦Wx11。相关分析表明,AGPase1、SSSIII、SBEI基因的相对表达量最大值与AGPase、SSS、SBE活性峰值均呈极显著正相关;GBSSI基因相对表达量最大值与GBSS活性峰值相关不显著;4种淀粉合成酶基因相对表达量最大值均与籽粒直、支链淀粉及总淀粉积累速率峰值呈极显著正相关;4种淀粉合成酶活性与籽粒直、支链淀粉及总淀粉积累速率均呈极显著正相关。     

作物淀粉合成关键酶及其基因表达的研究进展

ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase polypetide,AGPase)、颗粒结合淀粉合成酶(Granule-bound starch synthase,GBSS)、可溶性淀粉合成酶(Soluble starch synthase,SSS)、淀粉分支酶(Starch branching enzyme,SBE)、淀粉去分支酶(Starch debranching enzyme,DBE)等是淀粉合成过程中的关键酶.本文主要介绍了前人关于这五种酶各同工型的结构、功能、各同工酶基因在不同组织和不同生育时期的表达特异性,及它们的基因表达与淀粉合成的关系等方面的研究进展,旨在为相关研究提供参考.     

茶树黄酮合成酶Ⅱ基因全长cDNA序列的克隆和实时荧光定量PCR检测

利用RT-PCR和RACE技术,克隆得到茶叶中合成黄酮类化合物的关键酶基因—黄酮合成酶Ⅱ,该基因属于细胞色素P450家族,在GenBank登录号为FJ169499。黄酮合成酶ⅡcDNA全长序列1824bp,其中1605bp为编码区,编码534个氨基酸,分子量为60.4kD。通过SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测,发现黄酮合成酶Ⅱ在茶树一芽二叶春梢、当季成熟叶、花瓣、花蕊、种子中都有表达,成熟叶的表达量显著高于其他四种组织。     

香蕉ACC合成酶cDNA的PCR扩增及序列测定

从香蕉果实中提取总ＲＮＡ,经反转录成ｃＤＮＡ第一链,根据已知植物ＡＣＣ合成酶的ｃＤＮＡ及其所编码的氨基酸序列合成引物,经ＰＣＲ扩增香蕉ｃＤＮＡ得到一长约１．１Ｋｂ的产物,对该序列测定结果表明,该ｃＤＮＡ所编码的氨基酸序列包括了ＡＣＣ合成酶８个高度保守区中的７个,并且包括该酶的活性中心。     

水稻谷蛋白基因GluB-6的cDNA克隆及表达

根据已克隆谷蛋白基因的保守氨基酸序列搜索基因组数据库,获得与之高度同源的水稻基因组序列,通过生物软件进行基因预测和验证,用RT PCR法克隆得到1个新的谷蛋白基因的cDNA克隆。核酸序列分析和体外表达结果表明,该基因cDNA序列全长为1517 bp,含有1个编码495个氨基酸残基的开放阅读框（ORF）,推导的氨基酸序列与谷蛋白基因家族的相似性介于53.6%~82.8%,并与B亚族谷蛋白基因的同源性更高,因此命名为GluB 6（GenBank注册号AY429651）。Northern杂交显示,GluB 6基因具有高度的胚乳表达特性。     

水稻分支酶基因 Sbe1和 Sbe3 cDNA的克隆及全序列分析

 通过改良的RT PCR法合成了水稻未成熟种子胚乳cDNA库，并以此为模板，用PCR技术从粳稻品种武运粳7号中克隆了分别编码淀粉分支酶SBEⅠ和SBEⅢ的2个基因Sbe1和Sbe3。序列分析表明，克隆Sbe1和Sbe3基因的大小分别为2490 bp和2481 bp，包含了基因完整的编码序列。Sbe3基因与已发表基因全序列完全相同，同源性达100%；Sbe1基因与已发表基因序列有4个碱基不同，同源性为99.84%，推导氨基酸序列的差异为2个。     

块根特异启动的木薯SBE Ⅰ、SBE Ⅱ基因RNAi载体的构建及鉴定

利用基因重组技术,分别克隆木薯SBEⅠ基因ORF中的494 bp的片段和SBEⅡ基因ORF中的340 bp的片段;并通过重叠延伸PCR方法,扩增融合SBEⅠ、SBEⅡ基因片段的大片段SⅢ,将其正向、反向插入植物RNAi表达载体pART27中,同时克隆块根特异性启动子取代原来载体上自有的35S启动子,构建块根特异启动的可编码发夹结构的RNAi表达载体Sp-pRNAiSⅢ,为后续培育高直链淀粉含量的木薯新品种等实验打下基础。     

块根特异启动的木薯SBE I、SBE Ⅱ基因 RNAi载体的构建及鉴定

利用基因重组技术,分别克隆木薯SBEⅠ基因ORF中的494 bp的片段和SBEⅡ基因ORF中的340 bp的片段;并通过重叠延伸PCR方法,扩增融合SBEⅠ、SBEⅡ基因片段的大片段SⅢ,将其正向、反向插入植物RNAi表达载体pART27中,同时克隆块根特异性启动子取代原来载体上自有的35S启动子,构建块根特异启动的可编码发夹结构的RNAi表达载体Sp-pRNAiSⅢ,为后续培育高直链淀粉含量的木薯新品种等实验打下基础。     

花后高温胁迫对春小麦籽粒淀粉合成的影响

为揭示高温胁迫对春小麦籽粒淀粉合成的影响机制,以宁春4号小麦为材料,分别于花后5、10、15和20 d进行高温（35 ℃±3 ℃）胁迫,利用实时荧光定量PCR法（qPCR）研究花后不同时期高温胁迫下小麦籽粒淀粉合成相关酶基因表达,并将基因表达量与对应籽粒淀粉合成酶活性进行相关性分析。结果表明,束缚态淀粉合成酶Ⅰ（GBSSⅠ）基因对高温不敏感,而腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）基因、淀粉分支酶（SBE）基因、可溶性淀粉合成酶（SSS）基因的表达均被高温胁迫抑制;被测的4种淀粉合成相关酶的活性均被高温协迫抑制。自然生长温度下,除GBSSⅠ酶外,SBE、AGPase和SSS酶活性与其对应基因的表达量极显著或显著正相关;高温胁迫使4种被测的淀粉合成相关酶活性与其对应基因表达量的相关性降低。高温胁迫通过抑制小麦籽粒淀粉合成相关酶基因的表达而影响对应酶活性,使小麦籽粒淀粉的积累发生改变;高温胁迫发生时间越早,对小麦籽粒淀粉积累影响越大。     

茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆和序列分析

从茶树叶片中提取总RNA ,经反转录合成cDNA第一链。以cDNA第一链为模板 ,分别用三对PCR引物扩增SAM合成酶基因的中间主片段、 3 端和 5 端片段 ,最后经BLAST比较及重叠区域拼接得到完整的SAM基因序列。所得序列长 130 3bp ,编码 394个氨基酸。与中华猕猴桃、番茄、长春花SAM合成酶基因的核苷酸序列的同源性分别为 87% ,83 %和 83%。氨基酸序列与三角杨、猕猴桃、番茄、长春花等的SAM氨基酸序列的同源性为 92 %～ 90 %。证实所获得的基因序列为茶树SAM合成酶基因     

缺失不同Wx蛋白对小麦籽粒直链淀粉合成及淀粉特性的影响

以缺失不同Wx蛋白小麦为试验材料,研究缺失不同Wx蛋白对小麦籽粒直链淀粉合成及淀粉特性的影响。试验结果表明,缺失不同Wx蛋白对小麦籽粒直链淀粉含量、积累量和积累速率、束缚态淀粉合成酶基因（GBSSI）基因相对表达量以及束缚态淀粉合成酶（GBSS）活性的影响顺序表现为：缺ABD型>缺AB型>缺B型>缺D型>缺A型>正常型;对淀粉最终粘度、反弹值以及糊化温度影响的表现顺序与其一致;对淀粉峰值粘度、低谷粘度、稀懈值以及膨胀势影响的表现顺序与此相反。相关分析表明,直链淀粉积累速率峰值、GBSSI相对表达量最大值以及GBSS活性峰值三者之间相互呈极显著正相关。说明GBSSI基因可能通过编码GBSS酶,从而控制小麦籽粒中直链淀粉的合成。