玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子的克隆和表达载体构建

以玉米基因组DNA为模板,通过LA-PCR技术扩增了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子序列,并将其克隆到pMD18-TVector上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析并测序。结果表明,该启动子和Genbank中发表的玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子同源性达98.52%,克隆片段长为934bp。再将经BamHⅠ和HindⅢ双酶切得到的启动子片段克隆到相同酶酶切的pBI121载体上,构建植物表达载体pBI121-sbeⅡb,并进行酶切鉴定和PCR检测。结果显示,启动子基因sbeⅡb已成功整合到植物表达载体pBI121上。序列中发现高等植物启动子所特有的基本核心序列和种子特异表达所需的特殊调控元件。     

草莓psy、pds和zds基因克隆及植物表达载体的构建

设计特异引物,分别克隆草莓类胡萝卜素合成关键基因psy、pds和zds开放阅读框,将psy和pds基因开放阅读框分别插入植物表达载体pBI121的CaMV 35S启动子和Nos终止子之间,构建了植物表达载体pBI121psy和pBI121pds.将psy和zds基因开放阅读框分别插入植物表达载体pCAMBIA1301的CaMV 35S启动子和Nos终止子之间,构建植物表达载体pCAMBIA1301psy和pCAMBIA1301zds.将带有完整启动子和终止子的pds基因引入pCAMBIA1301psy中,最终获得psy和pds的双价植物表达载体pCAMBIA1301psy-pds.经PCR、限制性内切酶酶切和测序鉴定后,成功将pBI121psy、pBI121pds、pCAMBIA1301psy、pCAMBIA1301zds和pCAMBIA1301psy-pds 5个重组表达质粒导入农杆菌EHA105中.该研究结果为进一步研究草莓psy、pds和zds基因的功能奠定基础.     

香蕉Maasr1基因RNAi植物表达载体的构建及鉴定

以香蕉Maasr1基因为目的基因,载体pBS为中间载体,pBBB、pBI121为表达载体,分别构建含有Maasr1基因的RNAi植物表达载体DBBB-S-I-A和含有Maasr1基因正义片段的植物表达载体pBl121-S,并通过农杆菌介导的方式对构建的该RNAi载体沉默效果进行鉴定.结果表明:(1)利用中间载体pBS和植物表达载体pBBB成功构建了香蕉Maasr1基因的RNAi植物表达载体pBBB-S-I-A;(2)利用载体pBI121成功构建了1个含有Maasr1基因正义片段的植物表达载体pBI121-S:(3)构建的RNAi载体pBBB-S-I-A可以抑制Maasr1基因的表达,具有较好的沉默效果.     

亚麻CAD基因克隆及反义表达载体的构建

本试验以亚麻(Linum usitatissimumL.)品种Argos为材料,分离了高纯度的RNA。用简并引物以RT-PCR的方法,克隆了亚麻CAD基因cDNA部分序列,长度为477bp,构建了pGEM-T-CAD质粒。用限制性内切酶EcoRI酶切pGEM-T-CAD质粒和载体pGEM-7Zf(-),进行连接,构建成中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒。用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒和pBI121载体,进行连接,构建了亚麻CAD基因反义植物表达载体pBI121-antiNTCAD。     

亚麻CAD基因克隆及反义表达载体的构建

本试验以亚麻(Linum usitatissimum L.)品种Argos为材料,分离了高纯度的RNA.用简并引物以RT-PCR的方法,克隆了亚麻CAD基因cDNA部分序列,长度为477bp,构建了pGEM-T-CAD质粒.用限制性内切酶EcoR I酶切pGEM-T-CAD质粒和载体pGEM-7Zf(-),进行连接,构建成中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒.用限制性内切酶Xba I和BamH I双酶切中间表达载体pGEM-7Zf(-)-CAD质粒和pBI121栽体,进行连接,构建了亚麻CAD基因反义植物表达载体pBI121-antiNTCAD.     

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因RNAi载体的构建

采用PCR技术扩增得到胰蛋白酶抑制剂KTi基因正义和反义片段、大豆种子特异性启动子7αP和作为内含子的GUS基因片段,将其分别连入克隆载体pMD18-T Vector中.然后以植物表达载体pCAMBIA1301为基础,通过AHLG作为中间载体,根据RNAi原理将组成RNAi 结构的4个目的片段分别连入其中,成功构建了种子特异性RNAi表达载体p1301-KTiRi.研究结果为RNAi技术在大豆品质改良中的应用提供了基础.     

蓖麻毒蛋白A链基因克隆与重复表达载体构建

利用降落PCR的方法,从蓖麻基因组DNA中克隆毒蛋白A链基因的560bp片段;利用一步法将该基因的2个正义片段和2个反义片段分别与pBI-121质粒连接,构建含该基因的正义重复和反义重复表达载体,为利用共抑制技术抑制蓖麻毒蛋白A链基因表达的研究奠定基础。     

大豆铁蛋白cDNA的克隆及植物表达载体的构建

以大豆为材料,利用RT-PCR法扩增得到大小约750bp的片段,将这个片段连接到克隆载体pBlueskript SK＋上进行测序,结果证明,此片段就是大豆的铁蛋白基因。将此片段再正向插入到植物表达载体pBI121的CaMV35s启动子和NOS终止子之间,构建了植物表达载体pBIFe,并成功地将该载体导入根癌农杆菌EHA105。此项工作为获得表达铁蛋白的转基因植物奠定了基础。     

甘蓝型油菜GPAT6基因启动子的克隆与表达载体构建

通过同源PCR克隆的方法,首次从甘蓝型油菜中克隆了甘油-3-磷酸酰基转移酶6（sn-glycerol-3-phosphate acyltransferase6,GPAT6）基因长1110bp的启动子,并将其成功构建到植物表达载体pBI121上.重组载体可用于转化拟南芥,探究甘蓝型油菜GPAT6基因的组织表达特征.     

PRSV-CP基因小hpRNA植物表达载体的构建

将获自海南(prsv-cp hno1～4)、云南(prsv-cp yunnan)和广西(prsv-cp guanxi)的番木瓜环斑病毒株系外壳蛋白(PRSV-CP)基因序列与DQ340771、X97251(来自中国台湾的PRSV株系)以及AY162218、AY231130、DQ374153、S46722、X97251(分别来自泰国、墨两哥、巴西、美国的PRSV株系)等外壳蛋白(CP)基因序列进行比对,在CP基因高保守区设计靶向目标序列进行亚克隆,获得长度为50bp的DNA片段,并通过一步套叠PCR把50 bp 正向片段和反向片段与拟南芥内含子拼接,成功构建了小hpRNA结构的植物表达载体,为进一步培育安全性好、抗谱广的番木瓜转基因新种质奠定了基础.     

番茄CYP71基因的克隆及其功能的初步分析

分析番茄的EST数据库,获得一条在番茄果实中表达的EST序列CYP71,通过RT-PCR分析表明,该基因在番茄的叶、花、果实中均有表达,其中幼果中表达最强,并受到乙烯的负调控,推测可能与果实的发育成熟相关.进而通过RACE(rapid amplification of cDNA ends)的方法获得了全长为1 637 bp的番茄CYP71基因(GenBank accession No.GQ370622).该片段包括一个完整的开放阅读框(1488 bp),编码495个氨基酸.通过系统进化树分析,属于CYP71家族.将番茄的CYP71基因定向克隆到植物表达载体pBI121中,获得CYP71基因的正、反义植物表达载体pBI121-CYP71s和pBI121-CYP71as,为深入研究该基因的功能奠定基础.     

亚麻木质素合成相关基因COMTRNAi表达载体构建及转化

以已经克隆到亚麻木质素合成关键酶咖啡酸-O-甲基转移酶基因(COMT)全长cDNA序列为基础,通过扩增RNAi顺式及反式片段(均为249 bp),先连接到中间载体pBSK,再连接表达载体pCAMBIA-1301-multi,构建成COMT基因的RNAi表达载体,通过农杆菌介导转化亚麻,获得转基因植株,通过GUS染色和PCR检测,表明干扰载体已经转入亚麻中。这为推进亚麻纤维品质改良的分子育种提供了基础。     

基因枪介导甘蔗遗传转化研究初报

将从灰树花（Grifola frondosa）中分离克隆到的海藻糖合酶cDNA以正向插入植物表达载体pBI121/BamHI Sst1位点，获得一植物表达载体pBT；又用Ubi-L启动子插入植物表达载体pBI121/HindⅢ＋Xbal位点，获得重组质粒pUB,再把海藻糖合酶cDNA正向插入pUB/BanHI SstI位点，获得另一植物表达载体pUBT。然后通过基因枪法分别用植物表达载体pBT和pUBT转化甘蔗。再生植株的点杂交和PCR－Southern杂交表明海藻糖合酶基因已整合进甘蔗的基因组中。     

甘蔗锌指蛋白ShZP基因正义反义植物表达载体的构建及转化烟草

根据本实验室克隆的甘蔗锌指蛋白ShZP基因cDNA序列,在开放阅读框两侧设计特异引物,通过PCR扩增引入相应的酶切位点,把甘蔗ShZP基因的编码区(大小为725bp)cDNA片段,分别以正向和反向插入到中间载体pCRBI的Prd29A启动子和NOS终止子之间,构建了其正义植物表达载体pCRBIShZP和反义表达载体pCRBIantiShZP.采用冻融法分别将pCRBIShZP和pCRBIantiShZP导入根瘤农杆菌菌株EHA105中,通过农杆菌介导法对烟草进行转化,经过12mg/L的PPT连续抗性筛选,共获得23株抗性植株,对其中的5株转正义基因烟草植株和9株转反义基因烟草植株进行PCR检测,分别获得3株转正义基因的阳性植株和4株转反义基因的阳性植株.PCR检测结果初步证明外源甘蔗锌指蛋白ShZP基因已成功整合到烟草基因组中,这一研究为植物抗逆基因工程研究打下了一定的基础.     

水稻精细胞优势表达基因RSG6启动子的克隆及表达

利用已知的[i]RSG6[/i]基因序列和GenBank中提供的[i]RSG6[/i]前导序列设计引物,通过基因组DNA的PCR扩增得到长度为1 408 bp和1 173 bp的两个[i]RSG6[/i]启动子片段PB、PS,测定序列分析发现,PB、PS分别位于水稻第10和第4染色体上,PB、PS序列之间具有较高的同源性,且都含有大量的启动子元件。通过设计带有酶切位点的引物扩增出PB和PS的各两条缺失片段PB1、PB2、PS1、PS2,与质粒pBI221连接后得到中间载体pBI221 PB1、pBI221 PB2、pBI221 PS1、pBI221 PS2,再与质粒pBIN19连接构建出双元表达载体pBIN GUSB1、pBIN GUSB2、pBIN GUSS1、pBIN GUSS2,转化农杆菌EHA105,感染烟草叶片和烟草花粉,瞬时表达显示缺失片段PB1、PB2、PS1、PS2均具有启动子功能,且PB1、PS1的启动效率较PB2、PS2高。     

香蕉Actin1启动子的分离及启动活性的分析

从香蕉基因组DNA中分离香蕉Actin1启动子序列，序列测定结果表明，该片段1253bp，包含完整的G-box和TATA box，5’非翻译区和其下游的内含子，与文献报道序列的同源性达97．53％。以全长序列取代植物表达载体pCAMBIA3300上的35s启动子序列构建成瞬间表达载体pCAMBIA—Act1，以内含子序列Hind Ⅲ和XbaⅠ双酶切片段（584bp）取代植物表达载体pBI121上的35 S启动子，构建成瞬间表达载体pBI121-Act1-1。采用基因枪法对香蕉根、叶和果实的薄片进行转化，转化材料经培养3h，采用分光光度法测定各组织GUS的活性。结果表明，Actin1启动子在所转化的3种组织中均可启动报告基因的表达，表达活性与35 S启动子接近，具有组成型表达的特点。内含子部分序列（584bp）也具有启动活性，但启动活性较低。