山羊MyoG启动子的克隆和活性检测

【目的】肌细胞生成素(myogenin,MyoG) 是生肌调节因子(MRFs)基因家族中唯一能在骨骼肌细胞发育与生长过程中均可表达的调控因子, 在肌肉细胞分化过程中起着中心调控的作用,它正调控着骨骼肌卫星细胞向成熟肌细胞分化的过程,是唯一不可代替的生肌调节因子。MyoG基因在复制、扩增、基因激活、转录、翻译等多级水平上对肌肉发育进行调控。基因转录的起始阶段是机体生长发育因子进行调控的开端,而此阶段调控的实质是通过启动子和上游调控序列的相互作用,调控目的基因的表达。因此克隆MyoG基因的启动子,探讨启动子区域的启动活性,有助于从理论上揭示MyoG基因表达的关键调控位点,同时也有利于揭示肌肉发育调控的相关机理,为治疗人类相关疾病以及改良家畜肉质研究提供实验依据。本研究克隆山羊Myogenin（MyoG）基因的启动子区域,检测其在哺乳动物骨骼肌细胞内的启动活性。【方法】克隆山羊MyoG基因的启动子序列,连入pDsRed2基本骨架构建了以红荧光蛋白基因为标记基因的真核表达载体pDsRed-GoatMyoG(5.3 kb)。表达载体pDsRed-GoatMyoG经酶切和测序鉴定后,分别转染体外培养的绵羊肌卫星细胞、肌管细胞和成纤维细胞,观察红色荧光蛋白表达情况,然后利用实时荧光定量PCR、Western blot和冰冻切片、免疫组化等技术检测细胞转染后标记基因mRNA 和蛋白在体外培养细胞中的的表达活性。pDsRed-GoatMyoG表达载体对小鼠进行肌肉注射,检测GoatMyoG启动子在体内组织中的启动特异性和效率。肌肉注射5 d后,分别取小鼠的注射腿肌肉组织、非注射腿肌肉组织、睾丸组织、肠组织和肝脏组织,通过实时荧光定量 PCR 检测标记基因DsRed在不同组织中的表达情况。【结果】克隆得到的MyoG启动子序列测序正确,载体pDsRed-GoatMyoG经酶切和测序鉴定,证实载体构建成功;转染质粒 pDsRed-GoatMyoG后,肌卫星细胞和肌管细胞在显微镜下均可观察到细胞发红色荧光,成纤维细胞没有红色荧光。通过实时荧光定量PCR检测得出,转基因肌管细胞内GoatMyoG 启动DsRed 基因表达mRNA 的相对量为14.07;通过Western blot技术检测出转基因肌管细胞含有GoatMyoG启动的DsRed蛋白质,在转基因成纤维细胞内没有检测到 DsRed 蛋白质,说明GoatMyoG启动子可在肌肉组织特异性启动外源基因表达。小鼠肌肉注射pDsRed-GoatMyoG质粒后,注射腿肌肉组织内GoatMyoG 启动DsRed 基因转录mRNA 的相对量为212.32,非注射腿肌肉组织内mRNA的相对量为39.76,注射腿肌肉组织和非注射腿肌肉组织内mRNA 的量均是其它组织的1.99倍以上。通过免疫组化技术在注射腿肌肉组织和非注射腿肌肉组织内均可检测到红色荧光蛋白,在睾丸、肠和肝脏内均未检测到DsRed 蛋白。【结论】山羊MyoG启动子可以特异性的在骨骼肌组织驱动外源基因的表达,是一种有效的肌肉特异性启动子。     

Regulation of the Amount of Starch in Plant Tissues by ADP Glucose Pyrophosphorylase

Starch, a major storage metabolite in plants, positively affects the agricultural yield of a number of crops. Its biosynthetic reactions use adenosine diphosphate glucose (ADPGlc) as a substrate; ADPGlc pyrophosphorylase, the enzyme involved in ADPGlc formation, is regulated by allosteric effectors. Evidence that this plastidial enzyme catalyzes a rate-limiting reaction in starch biosynthesis was derived by expression in plants of a gene that encodes a regulatory variant of this enzyme. Allosteric regulation was demonstrated to be the major physiological mechanism that controls starch biosynthesis. Thus, plant and bacterial systems for starch and glycogen biosynthesis are similar and distinct from yeast and mammalian systems, wherein glycogen synthase has been demonstrated to be the rate-limiting regulatory step.     

低密度脂蛋白受体基因表达调控研究

低密度脂蛋白受体(LDLR)调节体内胆固醇的平衡是通过其启动区的固醇调节元件(SRE)感受体内胆固醇的变化,从而调控LDLR基因的表达来实现的。胆固醇调节元件结合蛋白(SREBP)、SREBP裂解蛋白(SCAP)参与这一调节。LDLR基因的表达还受到HMG-CoA还原酶抑制剂、激素、细胞生长因子等因素的影响。     

梅花鹿IGF-1的原核表达与纯化

【目的】克隆梅花鹿（Cervus nippon）胰岛素样生长因子1（Insulin-like growth factor 1,IGF-1）的成熟肽基因,并对其进行原核表达及纯化,以获得具有生物学活性的蛋白,为研究IGF-1在梅花鹿鹿茸生长发育中的调控作用及机理提供参考。【方法】以GenBank中的梅花鹿IGF-1基因序列（登录号：HQ890468）设计1对引物,以构建的梅花鹿pMD-18T-IGF-1重组质粒为模板,克隆IGF-1成熟肽的基因序列,构建重组质粒pMD-IGF-1,将其插入pET-32a表达载体后,构建pET-32a-IGF-1质粒,鉴定后,将pET-32a-IGF-1转入Rosetta大肠杆菌进行诱导表达（0.6 mmol/L IPTG,37 ℃,4 h）后,对其表达产物进行SDSPAGE和Western blotting检测。用Ni-Agarose柱亲和层析试剂盒分离、羟胺裂解纯化目标蛋白,并利用四唑盐比色法（MTT法）和流式细胞仪检测目标蛋白对NIH3T3细胞增殖及不同细胞周期下NIH3T3细胞比例的影响。【结果】获得了梅花鹿IGF1成熟肽基因序列（234 bp）;经鉴定,原核表达载体pET-32a-IGF-1构建成功;SDS-PAGE和Western blotting检测结果表明,在Rosetta中成功诱导表达了融合蛋白,且羟胺裂解纯化后的目的蛋白纯度较高;MTT法和细胞周期检测结果表明,复性后的IGF-1重组蛋白能促进细胞增殖。【结论】 成功克隆了梅花鹿IGF-1成熟肽基因序列,获得了具有生物学活性的IGF-1蛋白。     

花䱻抗缪勒氏管激素基因克隆、抗体制备及其对外源雌激素的响应

【目的】克隆花䱻抗缪勒氏管激素基因Amh,分析其序列特征及亚细胞定位,检测不同浓度雌二醇处理下的表达变化规律,为后续研究Amh基因的功能及其在卵巢发育中分子机制提供理论参考。【方法】基于花转录组文库测序结果,克隆Amh基因cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。构建重组表达质粒pET32a-Amh,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。通过免疫荧光技术检测荧光信号确定蛋白的亚细胞定位情况。同时,利用实时荧光定量PCR检测Amh基因在雌二醇处理后的表达情况。【结果】克隆的花䱻Amh基因cDNA序列全长为1849 bp,开放阅读框（ORF）为1671 bp,编码556个氨基酸残基。系统进化分析结果显示,花䱻Amh基因与斑马鱼、鲤鱼等鲤科鱼类Amh基因聚为一支,表明其亲缘关系较近。将纯化的AMH重组蛋白免疫小鼠以制备AMH多克隆抗体,通过酶联免疫方法（ELISA）检测其抗体效价为2.4×106以上,Western blotting检测显示抗体具有特异性。AMH蛋白在花卵巢颗粒细胞表达。利用不同浓度的雌二醇处理花䱻60 d后发现,低浓度雌二醇（100 μg/g）促进花䱻卵母细胞生长,卵巢内皮质液泡数量增多。经雌二醇处理后,卵巢中Amh基因的表达量降低,说明雌激素在卵巢发育中对Amh基因表达具有抑制作用。【结论】Amh基因含有TGF-β家族典型的结构域,在卵巢颗粒细胞表达,且响应雌激素的调控,可能在花䱻卵巢发育中发挥调控作用。     

硫化氢在植物中抵御非生物胁迫机制的研究进展

植物在生长发育过程中不可避免地受到各种生物或非生物胁迫。硫化氢(H2S)作为一种细胞信号分子，在植物体抵御冷热、重金属、盐、干旱等各种非生物逆境胁迫及与其他信号物质的互作等方面发挥重要作用。综述了H2S在植物体中通过基因调控、改变酶活性和蛋白质的表达、硫巯基化修饰、减轻氧化应激、与信号物质的互作等抵御非生物胁迫的作用机制，并展望了H2S在植物体中抵御非生物胁迫的作用机制。     

植物苯丙氨酸解氨酶表达调控机理的研究进展

植物苯丙氨酸解氨酶(PAL,EC 4.3.1.5)是苯丙烷类化合物代谢的关键限速酶,在次生代谢物合成及抗逆过程中有重要作用。从植物苯丙氨酸解氨酶的基本特性、蛋白定位、基因特点以及组织表达模式等方面,对近几年PAL在次生代谢物的生物合成和信号调控中的研究进展进行综述,旨在为苯丙烷合成途径中重要关键酶基因的多样性、表达调控机制复杂性和次生代谢物积累的分子机理以及苯丙氨酸解氨酶的利用研究提供理论依据和应用参考。     

木薯块根淀粉积累分子机制综述

该文综述了相关的淀粉合成机理以及调控木薯淀粉合成关键酶的生化特性基因调控研究进展,认为人们对木薯淀粉的生物合成机理、关键酶的生化特性与表达调控等方面有了很大的突破。     

Regulation of the apolipoprotein AI gene by ARP-1, a novel member of the steroid receptor superfamily

Apolipoprotein AI (apoAI) is a lipid-binding protein that participates in the transport of cholesterol and other lipids in the plasma. A complementary DNA clone for a protein that bound to regulatory elements of the apoAI gene was isolated. This protein, designated apoAI regulatory protein-1 (ARP-1), is a novel member of the steroid hormone receptor superfamily. ARP-1 bound to DNA as a dimer, and its dimerization domain was localized to the COOH-terminal region. ARP-1 also bound to a thyroid hormone-responsive element and to regulatory regions of the apoB, apoCIII, insulin, and ovalbumin genes. In cotransfection experiments, ARP-1 downregulated the apoAI gene. The involvement of ARP-1 in the regulation of apoAI gene expression suggests that it may participate in lipid metabolism and cholesterol homeostasis.     

真核生物转录调控的研究进展

 真核生物基因表达的调控是目前分子生物学研究中重要的前沿领域，形成了多个热点。真核基因表达调控是一个十分复杂而协调有序的调控过程，这一过程不仅与基因本身的功能，也与细胞及机体的功能表现密切相关。而转录水平的调控是基因表达过程中最重要的第一步，由于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA之间的相互作用，以及一些复杂大分子复合物的形成导致真核生物的转录水平的调控是一个多级的复杂过程。近年来，随着新技术和新方法的出现，发现了许多与基因转录调控有关的DNA顺式作用元件、核蛋白因子及各种因子在核内形成的多种复合物，它们的相互作用使转录调节的效率得到了提高，也使人们更进一步认识了某些生命现象以及细胞行为和疾病的发生机理。本文从顺式作用元件、反式作用因子、转录复合物、激素的调节、协调作用及最新研究siRNA调控6个方面进行了阐述，同时也对目前转录调控存在的问题和前景做了分析。     

大麦CIPK基因家族鉴定及表达分析

钙调神经磷酸酶B样相互作用蛋白激酶(CIPK)蛋白家族是由Ca2+介导的植物信号通路中的关键蛋白家族,在植物抗逆和生长发育中起关键作用。本研究将生物信息学方法和转录组数据分析相结合,挖掘出大麦31个HvCIPK基因家族成员并将其分为5个亚家族。HvCIPKs基因家族成员具有CIPKs典型的N端激酶结构域和C端NAF调节结构域；蛋白质分子量在40302.27~89926.43KDa之间,为亲水性蛋白；启动子总共包含11种与非生物胁迫、激素调控以及生长发育相关的顺式作用元件；蛋白互作网络预测结果显示,HvCIPKs与Na+、K+转运体、ABA信号通路关键蛋白(SOS1、AKT1和ABL2)存在相互作用关系；转录组数据分析发现HvCIPK1、HvCIPK2、HvCIPK6、HvCIPK9、HvCIPK11受盐碱胁迫的诱导表达。该研究为进一步探索大麦HvCIPKs基因家族功能及调控机制提供理论依据。     

软骨发育过程中负调控Sox9基因表达机制研究进展

Sox9基因是软骨发育过程中的主要调控因子,可以启动软骨生长发育所需的多种酶和蛋白基因的转录表达.在这个过程中,Sox9基因的表达和功能也受到多种因子和信号通路的调控.更多的研究关注其中的正调控,目前部分研究揭示负调控Sox9基因表达具有独特的作用机制.本文从microRNA、NF-κB、Wnt、Notch等因子和信号通路对Sox9基因的负调控机制进行论述和总结,以期为软骨发育中Sox9的表达和功能深入研究提供基础框架.     

水稻种子蛋白质含量遗传研究进展

水稻(Oryza sativa L.)种子中的蛋白质含量是决定稻米营养品质的一个关键因素,增加稻米中的蛋白质含量对其品质改良具有十分重要的意义.文章综述了水稻种子蛋白质的组成、蛋白质含量的数量性状位点(Quantitative trait locus,QTL)定位、相关基因分离克隆及其基因表达调控等方面的研究进展,针对目前对水稻种子蛋白质含量相关基因功能和遗传调控规律尚不清楚的问题,提出采用基因聚合或利用分子标记辅助选择育种提高水稻种子蛋白质含量的策略,为水稻和其他重要作物品质的遗传改良提供参考和借鉴.     

植物耐盐基因研究及其在棉花上的应用

盐害会对植物生长造成严重的危害、对农作物的产品品质和产量造成很大的损失。通过调控耐盐相关基因的表达,能提高转基因植物的耐盐能力。近年来,人们克隆了许多与耐盐相关的基因,主要包括渗透调节物合成基因、耐盐相关蛋白类基因、保护酶相关基因、转录因子的调控基因。主要综述了近年来植物耐盐相关基因的克隆及其在棉花基因工程中的研究应用等方面的一些进展,并对棉花耐盐基因工程的研究应用提出了对策和展望。     

绵羊MSTN基因慢病毒表达载体的构建及其对成肌细胞的分化作用

【目的】构建新疆细毛羊MSTN基因慢病毒表达载体,研究其在细毛羊成肌细胞分化中的作用,并探讨其作用机制。【方法】采用RT-PCR技术,扩增MSTN编码区序列,克隆入plex-mcs慢病毒表达载体,构建plex-MSTN慢病毒表达载体,并进行酶切及测序鉴定。将plex-MSTN包装成plex-MSTN慢病毒。用酶消化法分离培养新疆细毛羊成肌细胞,慢病毒感染制备MSTN过表达成肌细胞系,通过马血清诱导分化,Western blotting检测分化细胞MSTN基因的表达,免疫荧光分析分化肌管的融合率及肌管直径,Realtime RT-PCR检测分化相关基因的表达。【结果】 克隆的新疆细毛羊MSTN基因编码区全长序列（1 128 bp）与NCBI上公布的序列99.9%同源,仅在外显子2上存在单碱基突变;Western blotting检测结果显示,MSTN过表达成肌细胞过表达MSTN蛋白;免疫荧光检测表明,MSTN过表达成肌细胞的肌管融合率与肌管直径分别为5.69%和12.35 μm,显著低于非转化成肌细胞（10.21%和18.5 μm）（P<0.05）;Realtime RT-PCR结果显示,MSTN过表达成肌细胞中的Myogenin、p21、MyoD-基因表达显著下调,Smad3基因表达极显著上调（P<0.01）。【结论】 成功构建了细毛羊MSTN基因慢病毒表达载体,MSTN基因对细毛羊成肌细胞的分化具有显著的抑制作用,确定了MSTN基因与Myogenin、p21、MyoD及Smad3基因在成肌细胞分化过程中的调控关系。     

Tryptophan operon of Escherichia coli: regulatory behavior in Salmonella typhimurium cytoplasm

Hybrids hemizygous for the tryptophan genes were prepared by episomal transfer of an Escherichia coli element into Salmonella typhimurium. Regulation of enzyme production by hybrids carrying wild-type E. coli genes in response to changes in the growth medium occurs in precisely the same manner as in haploid E. coli wild type. Mutant alleles of the anthranilate synhetase gene of E. coli which prevent derepression in E. coli function identically in S. typhimurium. At least one Salmonella tryptophan regulatory gene unlinked to the structural genes is known. Any dijferences which may exist between the tryptophan regulatory genes of E. coli and Salmonella have little effect on the regulation of enzyme formation in hybrids.