花䱻抗缪勒氏管激素基因克隆、抗体制备及其对外源雌激素的响应

【目的】克隆花?抗缪勒氏管激素基因Amh，分析其序列特征及亚细胞定位，检测不同浓度雌二醇处理下的表达变化规律，为后续研究Amh基因的功能及其在卵巢发育中分子机制提供理论参考。【方法】基于花转录组文库测序结果，克隆Amh基因cDNA序列，并对其进行生物信息学分析。构建重组表达质粒pET32a-Amh，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，用纯化的重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。通过免疫荧光技术检测荧光信号确定蛋白的亚细胞定位情况。同时，利用实时荧光定量PCR检测Amh基因在雌二醇处理后的表达情况。【结果】克隆的花?Amh基因cDNA序列全长为1849 bp，开放阅读框（ORF）为1671 bp，编码556个氨基酸残基。系统进化分析结果显示，花?Amh基因与斑马鱼、鲤鱼等鲤科鱼类Amh基因聚为一支，表明其亲缘关系较近。将纯化的AMH重组蛋白免疫小鼠以制备AMH多克隆抗体，通过酶联免疫方法（ELISA）检测其抗体效价为2.4×106以上，Western blotting检测显示抗体具有特异性。AMH蛋白在花卵巢颗粒细胞表达。利用不同浓度的雌二醇处理花?60 d后发现，低浓度雌二醇（100 μg/g）促进花?卵母细胞生长，卵巢内皮质液泡数量增多。经雌二醇处理后，卵巢中Amh基因的表达量降低，说明雌激素在卵巢发育中对Amh基因表达具有抑制作用。【结论】Amh基因含有TGF-β家族典型的结构域，在卵巢颗粒细胞表达，且响应雌激素的调控，可能在花?卵巢发育中发挥调控作用。

Molecular cloning of anti-Müllerian hormone gene， polyclonal antibody preparation and response to exogenous estrogen in spotted steed （Hemibarbus maculatus Bleeker）