RT-PCR技术检测猪流感病毒

根据猪流感病毒（SIV）的M基因的序列,设计合成了1对引物,建立了检测猪流感的RT-PCR方法。应用该方法对H1、H3、H9亚型的猪流感病毒进行基因扩增,均获得了分子量为460bp的特异性目的片段,而对PRRSV、 PCV2、PRV、CSFV进行同条件检测,结果均为阴性;SIV扩增产物测序结果与SIV其他毒株序列同源性达99%～100% 。敏感性试验表明,该方法可检测到103 EID50的SIV;可直接从猪流感病毒感染小鼠的组织样品中检测到病毒。     

猪流感病毒M基因核酸探针的制备与应用

以地高辛(DIG)标记猪流感病毒(SIV)M基因的保守片段制成核酸探针,与H1及H3亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA、猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的cDNA、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的DNA、猪瘟病毒(CSFV)cDNA、猪伪狂犬病(PRV)的DNA进行斑点杂交,以检测探针的特异性,结果该探针仅与H1及H3亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA杂交呈阳性,与其余病毒杂交呈阴性;敏感性试验显示,探针最低能检出约5 pg的H3亚型的SIV RT-PCR产物.应用该探针对35份疑似SI临床病料进行检测,结果检出9份阳性,与RT-PCR检测结果一致.本研究结果表明,建立的DIG标记的核酸探针特异性强,敏感性高,适合于对SI的诊断和流行病学调查.     

猪伪狂犬病毒Taqman-MGB荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究根据猪伪狂犬病病毒gE基因序列,设计一对特异引物和探针,通过优化反应条件,建立了可区分猪伪狂犬野毒株及基因缺失疫苗株的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法。结果表明：TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法灵敏度可达2.23×101拷贝/μL,比常规PCR检测方法高100倍;同时检测猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒（PPV）、均为阴性,无交叉反应;对30份疑似病料的TaqMan荧光定量PCR和普通PCR检测阳性率分别为40%和33%,两者符合率90%。表明该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时检测大量样品,可适合于PRV的临床诊断和流行病学调查。     

变异猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测方法的建立

摘要：根据GenBank已发表及本研究室分离鉴定的变异PRRSV的NSP2基因序列,设计并合成了一对引物,建立了一种鉴别PRRSV的RT-PCR检测方法。结果表明：该方法扩增变异PRRSV基因组时可获得217bp的片段,扩增普通PRRSV时则获得307bp的片段,同条件扩增猪瘟病毒(CSFV)、圆环病毒Ⅱ型(PCV2)、伪狂犬病病毒(PRV)均为阴性;该体系可检测到2.6pg的PRRS病毒核酸,具有较高敏感性。对2007～2008年送检的40份临床样品进行检测,结果检出12份为变异PRRSV,其阳性率为30.0%。研究结果表明, 建立的RT-PCR鉴别变异PRRSV方法具有特异性强、敏感性高、重复性好等特点,适用于对猪繁殖与呼吸综合征病毒的鉴别诊断。     

猪主要RNA病毒病多重二温式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

通过对Genbank登录的CSFV、PRRSV和JEV的核苷酸序列进行比对分析,找出CSFV的E2基因,PRRSV的Nsp2基因和JEV的E基因为相对保守区域[1]。利用生物学软件在保守序列分别设计一对引物,通过对PCR反应条件的优化,确定了最佳引物浓度、最佳Mg2+浓度和最佳退火温度,建立了多重二温式PCR方法检测CSFV、PRRSV和JEV。其扩增的目的片断大小分别为CSFV(482 bp)、PRRSV(576 bp)和JEV(375 bp),将传统三温式PCR过程中的退火与延伸合并为一步,从而大大节省临床检测时间,同时又能通过一个反应体系对CSFV、PRRSV及JEV三种猪主要RNA病毒病进行检测。用50份临床病料对本研究多重PCR技术和单项PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为93%以上。表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

猪圆环病毒2型SYBRGreen Real-time qPCR检测方法的建立

为了建立一种基于SYBRGreen的猪圆环病毒2型(PCV2)荧光定量PCR诊断方法,以PCV2 ORF2基因序列为研究对象,构建p MD19T-ORF2重组质粒作为阳性标准品,设计特异性引物,对该方法的最适引物浓度、退火进行了优化,并对该方法的灵敏度、特异性、可重复性以及临床样品检出率进行了评价。结果表明,该方法引物的最佳终浓度为0. 2 mol/L,最适退火温度为55℃;检测限可达到3. 0×10~2个拷贝/mL,而普通PCR检测限在3. 0×10~4个拷贝/mL;溶解曲线分析显示,在77~79℃有单一的溶解峰出现,并与CSFV、PPV、PRRSV、PRV没有交叉反应;组内重复性变异系数为0. 29%~0. 32%,组间变异系数为0. 32%~0. 36%;此外,该方法对临床样品的检出率为81. 5%(31/38),而常规PCR为68. 4%(26/38)。因此,相比常规PCR,该方法更为快速、灵敏、特异、稳定,更适合PCV2临床样品的检测,可为该PCV2早期感染的快速检测提供新方法。     

猪圆环病毒2型和猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的流行病学调查

研究2009-2010年我国部分地区猪圆环病毒2型(PCV2)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)混合感染的情况。采用PCR和RT-PCR方法对采集自我国安徽、江苏、山东、浙江等7省的227份组织和血清样品进行PCV2和PRRSV检测。PCV2a感染率为15.9%,PCV2b感染率为44.5%,PRRSV感染率为45.8%,其中17份样品表现为PCV2a和PRRSV的混合感染,50份样品表现为PCV2b和PRRSV的混合感染,10份样品表现为PCV2a,PCV2b和PRRSV的混合感染,分别占样品总数的7.5%,22.0%和4.4%。猪群中PCV2和PRRSV的感染比较普遍,混合感染率也较高,加重了疫病防控的难度。     

猪伪狂犬病病毒及猪细小病毒复合PCR检测方法的建立

根据Genbank上已发表的猪伪狂犬病毒(PRV)的gH基因和猪细小病毒(PPV)的VP2基因的保守序列,设计合成了2对特异引物,分别建立了PRV和PPV的单项PCR诊断方法,通过优化PCR条件最终成功地建立了PRV和PPV的复合PCR诊断方法.敏感性检测结果表明,对PRV的检测可以达到10-10.5/100 μL TCID50、对PPV的检测可以达到109.5/100 μL TCID50.对20头份病、死猪的血清、淋巴结、肺、肝等组织进行检测,结果5头份PRV阳性,3头份PPV阳性,其中3头份PRV和PPv同时为阳性,其余猪为阴性,健康猪对照样品全部阴性.结果表明,PRV和PPV复合PCR诊断方法具有高度特异性和敏感性,可用于兽医临床诊断.     

猪繁殖与呼吸综合征的套式PCR方法建立及应用

通过设计2对引物,建立了PRRSV的套式PCR方法,PRRSV细胞毒稀释10 000倍,依然能扩增出相应的片断,多次重复能得到一致的结果,非PRRSV病毒(猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒)均未扩增出相应片断.应用该方法对各地样品进行检测,表明建立的套式PCR方法适合进行流行病学调查.     

猪圆环病毒II型PCR检测方法的研究

【目的】建立快速、简便、特异的检测猪圆环病毒II型的PCR方法;【方法】根据已发表的猪圆环病毒II型基因序列设计合成了一对引物,用酚-氯仿法抽提可疑病料中的病毒DNA,应用PCR技术对猪圆环病毒进行基因扩增,PCR产物进行序列测定;以猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒为对照,进行特异性试验;取部分病料进行重复性试验;【结果】PCR方法扩增出了长度为702bp的片段,扩增产物经测序和序列分析表明扩增的序列为PCV2序列;猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的PCR扩增均为阴性,与预期结果一致;部分病料PCR重复检测5次,检测结果完全一致;【结论】PCR检测方法可以对猪圆环病毒病作出敏感、特异、准确地诊断,该方法检测的基因最低模板量为2×10-5 ng/ml     

河南猪群猪瘟的感染及防治研究

[目的] 为了找出河南省猪瘟的流行病学规律,研究猪瘟强毒株感染情况,查实规模化猪场猪瘟免疫情况。[方法] 使用ELISA方法和革兰氏染色方法对301份病猪的样本进行猪瘟强毒抗原及细菌感染情况的检测,分析了猪瘟在河南省猪群的感染、流行范围情况及同细菌病的混合感染情况;对猪瘟阳性猪场采取综合防治措施并对采取措施后没有效果的猪场进行了蓝耳病和圆环病毒病的检测,确定混合感染情况。[结果] 猪瘟在河南省流行广泛;猪瘟病毒的平均检出率为26.25%;细菌感染占猪瘟病毒总阳性样本的25.31%;蓝耳病和圆环病毒病与猪瘟有不同程度的混合感染;综合性防治措施实施后对大部分猪厂效果明显;但对混合感染的猪群效果不好;[结论] 猪瘟与细菌、蓝耳病、圆环病毒病等混合感染是造成猪瘟难以根治的主要原因;综合防治措施的实施是净化猪瘟的重要手段。     

猪流行性腹泻病毒Real-time PCR检测方法的建立

为定量检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）载量,建立PEDV的Real—timePCR方法。用RT-PCR方法扩增PEDV的M基因片段,构建含有M基因片段的重组质粒,用该重组质粒进行SYBRGreen I Real—timePCR,来建立检测PEDV的荧光定量PCR方法。结果显示：在（5．56×10^2-5．56×10^7）拷贝／皿范围内,所建立方法具有优良的线性关系,其决定系数为0．9996,扩增效率为99．5％,扩增产物的熔解曲线只有一个特异性峰,无引物二聚体峰,熔解温度为（81．18±0．21）℃。该方法对猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒II型等猪源病毒均检测不到扩增产物,重复性试验的变异系数小于3％,对临床样品的检出率高于常规PCR方法。研究结果表明：建立的Real-timePCR检测方法特异性强、重复性好、灵敏性高,可用于PEDV的定量检测及其早期感染的快速诊断。     

猪圆环病毒2型和伪狂犬病弱毒疫苗体外共接种对猪外周血单个核细胞调节性细胞因子mRNA表达的影响

为分析猪圆环病毒2型（PCV2）对伪狂犬病弱毒苗（PRV）免疫反应的影响,用real-time PCR技术检测了仔猪外周血单个核细胞（PBMC）体外单接种和共接种PCV2与PRV后调节性细胞因子IL-4、IL-10、IL-12p40及IFN-γ的mRNA表达水平。结果表明,PRV能引起IL-4、IL-12p40与IFN-γ的mRNA表达上调,PCV2能引起IL-4、IL-10与IL-12p40的mRNA表达上调;而且,PCV2能抑制PRV诱导IL-4、IL-12p40及IFN-γ的mRNA表达上调,其中对IFN-γ mRNA表达的抑制效果最为显著（P<0.05）,提示PCV2可能会对PRV的细胞免疫反应产生不利影响。     

猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2的克隆表达

为了研究不同时间段细胞MHC分子表达的变化情况,从分子水平上说明E2基因与NHC之间的关系,本研究克隆了中国猪瘟病毒强毒石门毒株E2基因,构建了pcDNA3.0真核表达质粒P-E2基因。限制性内切酶进行双酶切和序列分析鉴定E2基因插入位置、方向和读码框架的正确性。构建成功的真核表达质粒P-E2,用脂质体转染方法瞬时转染进行体外细胞表达,转染后24,48 h后用Western-blot和间接免疫荧光技术检测P-E2基因质粒在PK-15细胞内的表达情况。结果表明：用His抗体进行间接免疫荧光检测发现E2基因得到表达,并定位于细胞浆,同时Western-blot检测后发现重组质粒P-E2转染后也在PK-15细胞中得到了表达。为进一步研究猪瘟病毒与宿主细胞之间的关系,病毒的致病机理提供了基础材料。     

猪蓝耳病及继发感染试验诊断与综合防治研究

通过PCR、细菌培养鉴定和血涂片镜检对20例以高热为特征的疑似蓝耳病病例进行病原检测诊断,并根据病因提出综合防治措施。发现蓝耳病(PRRS)阳性率100%,圆环病毒病(PCV-2)阳性率40%,伪狂犬(PRV)阳性率40%,非典型性猪瘟(CSFV)阳性率10%,猪流感(SI)及猪传染性胸膜肺炎(APP)均为阴性,附红细胞体阳性率90%,并有少量细菌感染。结果表明我市猪高热病为高致病性蓝耳病,发病猪并分别不同程度地混合或继发感染了其他病原体,病原一般3～5种,病原多样化导致病情复杂化,增加了诊断和治疗难度,所以本病宜采取综合防治。     

猪蓝耳病及继发感染试验诊断与综合防制研究

通过PCR、细菌培养鉴定和血涂片镜检对20例以高热为特征的疑似蓝耳病病例进行病原检测诊断,并根据病因提出综合防治措施.发现蓝耳病（PRRS）阳性率100%,圆环病毒病（PCV-2）阳性率40%,伪狂犬（PRV）阳性率40%,非典型性猪瘟（CSFV）阳性率10%,猪流感（SI）及猪传染性胸膜肺炎（APP）均为阴性,附红细胞体阳性率90%,并有少量细菌感染.结果表明我市猪高热病为高致病性蓝耳病,发病猪并分别不同程度地混合或继发感染了其他病原体,病原一般3～5种,病原多样化导致病情复杂化,增加了诊断和治疗难度,所以本病宜采取综合防治.     

基于基因组学的作物抗旱改良

随着基因组学的发展，利用大量的序列信息鉴定和克隆抗旱相关基因以改良作物的生产性能具有重要意义。作物抗旱性属数量遗传，其数量性状位点的鉴定是分子标记辅助选择改良作物抗旱性的基础。笔者就作物抗旱基因鉴定及相关功能基因组学的最新进展作系统的介绍，并探讨了今后作物抗旱性研究发展方向