新疆野生油菜BAC文库的构建

本实验以新疆野生油菜18号的基因组DNA为材料构建了其BAC(bacterial artificial chromosome)文库。该文库共有14592个克隆,插入片段在50-300kb之间,平均插入片段105kb,空载率低于5%,覆盖了新疆野生油菜基因组约4.0倍。新疆野生油菜基因组BAC文库的构建,为进一步研究其基因组结构及功能基因的利用等奠定了基础。     

茶皂素对油菜幼苗生长发育及抗氧化酶系统的影响

采用溶液培养的方法研究茶皂素对白菜型油菜东京绿(Brassica rapa L.)幼苗生长发育及抗氧化酶系统的影响。结果表明：在5～200mg&;#8226;L-1的茶皂素浓度范围内,随浓度增加,油菜幼苗的根长表现出先升高后降低的趋势;在5～100mg&;#8226;L-1的茶皂素浓度范围内,油菜幼苗的株高表现出与根长相同的趋势,但在茶皂素200mg&;#8226;L-1时株高显著降低;油菜叶片超氧化物歧化酶（SOD）活性逐渐降低;过氧化物酶（POD）活性在低于20mg&;#8226;L-1时低于对照,随后升高;过氧化氢酶（CAT）活性则仅在浓度为50mg&;#8226;L-1和100mg&;#8226;L-1时高于对照;油菜叶片中MDA含量先升高后降低。统计分析发现,浓度范围在5～200mg&;#8226;L-1的茶皂素对油菜幼苗叶片的生长、抗氧化酶系统和MDA含量没有显著影响,而200mg&;#8226;L-1显著抑制株高。结果说明了培养液中低于200mg&;#8226;L-1的茶皂素除降低幼苗株高外,对油菜的苗期是安全的。     

大豆多粒荚特异材料的BAC文库的构建

利用大豆重组自交系中的一个多粒荚家系Q1001,构建了一个大豆BAC文库（bacterial artificial chromosome library）。该文库包含54 912个克隆,平均插入片段达125kb,相当于大豆单倍体基因组大小的6.12倍。随机挑选4个大于100kb的克隆进行稳定性继代实验,经100代后插入的DNA片段仍然稳定存在。该BAC文库的建成,为下一步开展大豆产量相关基因的克隆打下基础。     

芥菜型油菜A9染色体BAC物理图谱构建及比较基因组分析

为获得高精确度的芥菜型油菜A9染色体物理图,本研究利用定位在A9染色体上的标记对芥菜型油菜BAC文库进行三维混合PCR筛选,共得到阳性BAC 3200个;构建了由16个重叠群、5个单拷贝组成的芥菜型油菜A9染色体物理图谱。根据最小路径原则挑选代表整个物理图的种子BAC 435个,并进行双末端测序,得到质量良好的序列862条;按照BAC平均插入片段为126 kb,可知所有重叠群累积达52.08 M,覆盖A9染色体的1.37倍。利用BLAST软件(按参数值E1e-10)将种子BAC末端序列比对到白菜和甘蓝型油菜A9染色体假分子上,结果显示该物理图谱分别覆盖了36.4、31.0 Mb的物理距离,相当于全基因组组装长度的93.9%、91.8%;在862条BESs中,分别有702条(81.40%)定位在白菜A9染色体上,646条(74.9%)定位在甘蓝型油菜A9染色体上,表明芥菜型油菜A9染色体同白菜A9染色体同源性高于甘蓝型油菜A9染色体;芥菜型油菜A9染色体同甘蓝型油菜A9染色体,相对白菜A9染色体6413031~7827177、14856710~18458808的位置发生了两处相同的分别长为1.4、3.6 Mb的倒位,白菜和芥菜型油菜A9染色体相对于甘蓝型油菜15676847~16064302的区域存在长为0.98 Mb的插入片段,该区域位于前述的倒位区域,而且与预测但未组装出的甘蓝型油菜着丝粒位置一致。     

大豆多粒荚特异材料BAC文库的构建

利用大豆重组自交系中的一个多粒荚家系Q1001,构建了一个大豆BAC文库(bacterial artificial chromosome library)。该文库包含54912个克隆,平均插入片段达125kb,相当于大豆单倍体基因组大小的6.12倍。随机挑选4个大于100kb的克隆进行稳定性继代实验,经100代后插入的DNA片段仍然稳定存在。该BAC文库的建成,为下一步开展大豆产量相关基因的克隆打下基础。     

3种含硫肥料对油菜干物质累积、氮硫吸收及产量的影响※

在油菜/小麦轮作体系中,通过田间小区试验研究了不同含硫肥料对油菜生长、氮硫吸收及产量构成因素的影响。结果表明,在常规施肥的基础上增施含硫肥料可明显促进油菜生长,增加植株对氮和硫的吸收。增施含硫肥料的处理与常规施肥处理相比油菜植株单株结荚数、角果长和每角果粒数等均有不同程度的提高。增施含硫肥料的处理比常规施肥处理的油菜籽产量增加658.3 kg&;#8226;hm-2-1335.3 kg&;#8226;hm-2,增幅25.5%-51.6%。施硫处理产投比为3.3-16.1。     

利用菘蓝创建抗病毒油菜及新的雄性不育／恢复系统

十字花科菘蓝为我国传统的染料与药用植物，其基因组结构及遗传方面的研究较少。我们在十多年间系统开展了甘蓝型油菜与菘蓝的体细胞杂种合成及后代的选育，鉴定出全套甘蓝型油菜-菘蓝附加系，分解了菘蓝的基因组、确定了每条染色体上所携带的基因、基因所决定的代谢产物；特别是发现三个附加系具有较强的抗流感病毒活性，它们作为蔬菜、饲料、饲料添加剂及制药原料有重要的应用前景；培育出雄蕊心皮化发育的新型甘蓝型油菜细胞质雄性不育系（命名为“菘油”CMS），其线粒体DNA为双亲重组体，大部分来自菘蓝；将特定菘蓝染色体上与雄蕊发育相关的染色体片段导入甘蓝型油菜而获得“菘油”CMS的恢复系，从而实现了三系配套。     

芸薹属远缘杂交试管苗快繁培养基的优化

为了优化芸薹属远缘杂交试管苗的快繁培养基,探讨基因型、培养时间等因素对试管苗分化率的影响,实验对甘蓝型油菜与甘蓝以及白菜型油菜与甘蓝两种远缘杂交方式的试管苗,在10种添加了不同浓度的6-BA和NAA的培养基上进行快繁培养。采用SAS软件对培养后第20d和第30d的分化率进行分析处理,结果如下：（1）白菜型油菜与甘蓝5个杂交组合间,以及白菜型油菜与甘蓝、甘蓝型油菜与甘蓝两种杂交类型间的试管苗分化率无显著差异;除甘蓝型油菜与甘蓝杂交的试管苗在培养第30d时的分化率无显著差异外,其它情况下培养基间的诱导分化率差异均达到显著或极显著水平;（2）添加3.0 mg&;#8226;L-1 6-BA（6-苄基嘌呤）和0.2 mg&;#8226;L-1 NAA（萘乙酸）的MS培养基对试管苗的诱导分化效率显著或极显著高于其它快繁培养基;（3）不同培养基培养的试管苗在培养20d和30d时的分化率呈高度正相关,但前20d的日平均分化率显著高于20~30d的日平均分化率。     

甘蓝型油菜与新疆野生油菜属间杂种的获得与分子鉴定

通过剥蕾重复授粉克服了甘蓝型油菜与新疆野生油菜属间杂交障碍,中双4号×野890812组合的199朵重复授粉花共产生32粒种子,其中8粒种子能发育成植株,5株植株形态与母本甘蓝型油菜相近,2株植株形态与白菜型油菜相近,1株植株形态介于母本甘蓝型油菜和父本野芥之间,叶面上具有新疆野生油菜特有的刺毛。RAPD分析显示8株F1代植株都同时具有母本中双4号和父本野890812的特征随机扩增DNA片段,还具有母父本均缺乏的新扩增DNA片段,表明8株F1代植株均为属间杂种。试验结果表明,决定甘蓝型油菜与新疆野生油菜或野芥远缘杂交中生殖隔离的主要因素是受精前障碍。属间杂种在形态和分子水平上的丰富变异预示通过甘蓝型油菜与新疆野生油菜间的属间杂交可望有效地拓展甘蓝型油菜遗传背景。     

甘蓝型油菜矮化突变体抑制消减cDNA文库 的构建及初步分析

采用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)技术，以甘蓝型油菜矮化突变体“NDF-1”为实验方（tester），野生型“3529”为驱动方（driver）构建植株差异表达的抑制消减cDNA文库。所建cDNA文库的插入片段大小主要集中在100 bp~1000 bp之间。斑点杂交筛选得到了32个阳性克隆，序列测定和同源性对比分析表明，其中的12个克隆功能未知，其余涉及到激素信号转导、第二信使、光合作用、脂肪酸代谢及衰老等多个方面。还对部分差异表达基因的功能进行了分析。为进一步认识油菜植株矮化的机理奠定了基础。     

新疆野生油菜、野芥和黑芥的遗传分化及系统演化研究

利用HPLC法对284份种子硫代葡萄糖甙组成分析表明，新疆野生油菜依据中特征硫代葡萄糖甙组成可划分为9类，91．2％的新疆野生油菜种子主要含羟基苄硫甙，8．8％的新疆野生油菜种子主要含丙烯基硫甙，与黑芥和芥菜型油菜特征硫代葡萄糖甙组成一致。RAPD分析将新疆野生油菜、野芥和黑芥划分为3簇，表明新疆野生油菜、野芥和黑芥之间存在明显的遗传距离，相对而言，新疆野生油菜与野芥间的遗传距离较近，与黑芥的遗传距离较远。新疆野生油菜可依据RAPD聚类分析结果划分为4簇，其中第1、2和4簇主要由来源于新疆塔城地区的新疆野生油菜组成，种子主要含丙烯基硫甙，第3簇为新疆巩留及其周边地区的新疆野生油菜,种子主要含羟基苄硫甙。研究为阐明我国芥菜型油菜起源进化途径提供了新的证据。     

新疆野生油菜与甘蓝型油菜属间杂种分子鉴定

采用蕾期剥蕾授粉的方法,成功获得了新疆野生油菜和甘蓝型油菜属间杂种.杂种F1植株之间形态表现一致,介于双亲之间,并且具有明显的杂种优势.从F1群体中随机选取9株进行RAPD分析,扩增出的带型完全一致,并且是父母本随机扩增DNA片段的综合,说明这9株全为真杂种.试验结果表明,蕾期授粉可以克服新疆野生油菜和甘蓝型油菜属间杂交的不亲和性,利用RAPD分子标记技术可以快速有效地鉴定远缘杂种.     

油菜野芥细胞质雄性不育恢复基因候选片段的克隆

根据植物细胞质雄性不育恢复基因编码的PPR（pentatricopeptide repeat）蛋白的特点,结合拟南芥PPR基因簇相似序列,扩增油菜野芥细胞质雄性不育(Nsa CMS) 基因组DNA,筛选出一对简并引物,在Nsa不育系育性恢复后的可育材料和野芥亲本中可以同时扩增出符合预期的片段。片段长度为309bp,与萝卜CMS恢复基因核苷酸序列的一致性为69%,与拟南芥1号染色体臂上PPR基因簇核苷酸序列的一致性大于70%,与含波里马（Pol）CMS恢复基因的白菜型油菜相关序列一致性达85%。该片段编码的氨基酸序列含有两个相邻排列的PPR基序,可作为Nsa CMS育性恢复基因的候选片段。     

甘蓝型油菜属间体细胞杂种雄性不育材料的研究

甘蓝型油菜与诸葛菜，新疆野生油菜体细胞杂交产生甘蓝型油菜雄性不育材料NO CMS和NSa CMS。用隐性核不育材料的保持系，波里马CMS和陕2A CMS的保持系，波里马CMS和陕2A CMS的恢复系对NO CMS和NSa,CMS测交，结果表明，NO CMS和NSa CMS是恢保关系明显不同于陕2A CMS和波里马CMS的细胞质雄性不育材料，NO和NSa可育自交后代育性表现3（可育）：1（不育）分离，初步认为不育性由单隐性核基因控制。     

新型黄籽甘蓝型油菜的获得及其遗传规律分析

本文分析从白芥（白芥属）和甘蓝型油菜属间体细胞融合获得的黄籽材料,根据农艺性状、产量和品质性状,获得2个具有较高育种应用价值的黄籽新种质D244-18和D244-6。D244-18的黄籽性状遗传研究表明,它由2对独立遗传基因控制,当2对基因均为隐性纯合时,籽粒为黄色,在来源上是新型黄籽甘蓝型油菜。     

转mEPSPS 基因甘蓝型油菜对根际土壤细菌群落结构和多样性的影响

转基因作物外源基因的表达是否会对土壤微生物生态系统产生不利影响是转基因作物环境安全评价中 的重要一环，也关系到作物新品种的应用与推广。为此，本文采用第三代16S扩增子高通量测序技术，对转mEP⁃ SPS 基因的甘蓝型油菜甲HX6及其亲本甲9707不同发育阶段的根际土壤细菌群落进行了比较分析。结果显示，样 品中油菜根际的优势细菌主要有变形菌门、拟杆菌门、酸杆菌门、放线菌门等。在同一发育时期，转基因材料和对 照根际细菌的Alpha多样性分析（如Shannon、Simpson指数），主坐标（PCoA）分析和MRPP分析均显示无显著差异。 此外，还发现转mEPSPS 基因油菜在花期根际中浮霉菌门的相对丰度显著低于对照，三个时期中均有少数细菌属的 相对丰度也存在显著性差异。不同发育时期，油菜根际细菌的多样性和群落结构差异较大，尤其是苗期与另两个 时期相比差异显著。总的来看，转mEPSPS 基因甘蓝型油菜的基因转化事件并未对根际土壤的细菌群落产生显著 的不利影响。但是，为了更加全面科学地评价其是否存在潜在的土壤微生物生态安全风险，还需要在较长时期内 监测其动态变化过程。     

甘蓝型油菜热激蛋白Bnp23相互作用蛋白的筛选和鉴定

以甘蓝型油菜热激蛋白p23（Brassica napus hsp23, Bnp23）为诱饵蛋白,用酵母双杂交LexA系统筛选拟南芥幼苗的AD-cDNA（activator domain-cDNA）文库,分离了39个酵母双杂交阳性克隆,其中两个阳性克隆的cDNA片段均编码拟南芥黑芥子酶结合蛋白（Arabidopsis thaliana PYK10 结合蛋白1,AtPBP1）。Blastp搜索到油菜黑芥子酶结合蛋白BnMBP6与拟南芥PBP1同源。经体外实验进一步证实AtPBP1和Bnp23之间存在相互作用。酵母双杂交实验也证实Bnp23能够与BnMBP6相互作用。     

属间杂交获得的甘蓝型油菜雄性不育材料的研究

采用蕾期剥蕾授粉的方法,成功获得了新疆野生油菜野油2000-1和甘蓝型油菜Parol属间杂种。杂种F1育性极低,自由授粉条件下获得少量F2种子。在F2群体中成功选择到一株雄性不育株,用Parol做轮回亲本与不育株回交,BC1、BC2和BC3群体中可育株与不育株均呈1﹕1分离。用波里马细胞质雄性不育的保持系和恢复系、681A的保持系和恢复系、隐性核不育86A的保持系及其它33个甘蓝型油菜品系与BC2群体中的不育株测交,测交后代可育株与不育株呈5﹕3分离的组合有20个,呈1﹕1分离的组合有14个,呈3﹕1分离的组合有3个,有一个组合的后代完全可育,表明该雄性不育材料可能为显性核不育。     

油菜叶片衰老相关基因的分离：ATP硫化酶cDNA的克隆和序列分析

通过筛选缩减ｃＤＮＡ文库中在油菜叶片衰老阶段表达而在绿叶中不表达的ｃＤＮＡ克隆，分离了与油菜叶片衰老有关的基因ＬＳＣ６６。ＤＮＡ序列测定和分析结果表明，ＬＳＣ６６的全长可读框架由１３８０个碱基组成，编码４６０个氨基酸，它的核昔酸序列与拟南芥菜ＡＴＰ硫化酶基因有８６．６７％的同源性，其推导的氨基酸序列与拟南芥菜ＡＴＰ硫化酶的氨基酸序列有９１．７４％的同源性。对ＬＳＣ６６基因产物在植物叶片衰老过程中的作用进行了讨论。