副猪嗜血杆菌肽聚糖相关脂蛋白(PalA)的序列分析及三维结构建模

为深入研究副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)肽聚糖相关脂蛋白(Peptidoglycan-associated lipoprotein,palA)的生物学特性,设计了一对特异性引物,应用PCR方法来扩增Hps palA的全基因序列,进行克隆和测序.采用生物信息学方法,对Hps的palA基因核苷酸及其编码氨基酸序列进行比对,选取其中的血清学5型分离株,对其PalA蛋白的分子结构、理化性质及结构功能域、蛋白质二级结构等重要参数进行了预测和分析,并对PalA蛋白的三级结构进行了同源建模.结果显示,PCR扩增出462 bp的目的片段;测序结果显示出不同血清型Hps之间palA基因核苷酸序列相似性有一定的差异,而所对应的氨基酸序列却差异很小;密码子偏爱性分析表明palA基因主要偏好GCA和AAA; PalA蛋白的理论等电点为6.28,偏弱酸性;PalA蛋白的二级结构以α螺旋、不规则卷曲和延伸链为主要构件;Hps的PalA蛋白的氨基酸序列与流感嗜血杆菌Pal蛋白的相似性为71.97％,以Pal蛋白结构为模板成功构建了Hps的PalA蛋白三维结构分子模型,该PalA蛋白三维结构与Pal蛋白相似,也含有肽聚糖结合口袋区,主要由第80位的酪氨酸( Tyr)、第39位的苯丙氨酸(Phe)和第84位的亮氨酸(Leu)组成.Hps的PalA蛋白的成功建模为PalA蛋白功能的深入研究提供了参考依据.     

副猪嗜血杆菌丝氨酸蛋白酶基因的克隆及生物信息学分析

为研究副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps)丝氨酸蛋白酶(espP)作为疫苗候选抗原的可能性,根据GenBank中Hps espP基因(登录号:HAPS_1381)设计引物,以Hps血清11型(H456)菌株的DNA为模板,PCR扩增目的基因并测序。将该基因核苷酸序列翻译成氨基酸序列后,对Hps espP蛋白的信号肽、亲水性区域和B细胞抗原表位进行预测,并预测了该蛋白C端的3D结构。结果显示,Hps espP基因序列全长2 343 bp,共可编码781个氨基酸,其中氨基酸序列的1—23位预测为信号肽。Hps espP蛋白含有12个亲水性区域,并预测含有12个B淋巴细胞抗原表位。构建Hps espP蛋白3D结构显示,该蛋白C端是由12个β折叠层围成的桶状结构。本试验为进一步研制新型副猪嗜血杆菌Hps espP蛋白多肽疫苗奠定基础。     

副猪嗜血杆菌sapA基因克隆与生物信息学分析

试验旨在克隆副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,Hps）sapA基因,并对其进行生物信息学分析,以期为sapA基因缺失疫苗的开发与应用提供理论依据。以71株临床菌株为研究对象,经PCR扩增鉴定其中的阳性菌株;将扩增得到的sapA基因片段与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经PCR和双酶切鉴定为阳性克隆后进行测序;用生物信息学软件进行核苷酸与氨基酸序列比对、系统进化树分析、蛋白二级和三级结构预测、疏水性预测、柔性区域位预测、B细胞抗原表位预测和Jameson-Wolf抗原指数预测。试验结果显示,在71株临床菌株中,有29株成功扩增出sapA基因,29株Hps的sapA基因核苷酸序列与已公布的SH0165菌株相似性为96.5%~98.8%,除H88菌株外,氨基酸序列与SH0165菌株相似性为98.9%~100%。sapA蛋白二级结构主要有α-螺旋、β-转角和无规则卷曲,有13个亲水区、38个柔性区和23个B细胞潜在抗原表位。以上结果表明,Hps的sapA基因是一个保守基因,各菌株间核苷酸序列、氨基酸序列都有很高的相似性,sapA蛋白具有较强的抗原性。     

副猪嗜血杆菌的分离鉴定及其OmpP5基因序列分析

为研究辽宁省副猪嗜血杆菌(Hps)OmpP5基因的遗传变异规律,从辽宁省阜新市某猪场疑似患有副猪嗜血杆菌病的患猪肺部采取组织病料进行细菌分离,通过革兰染色、生化鉴定、卫星现象及Hps 16S rRNA PCR检测,鉴定为副猪嗜血杆菌。根据已发表的Hps OmpP5基因设计1对特异性引物,对分离株OmpP5基因进行扩增、克隆及测序,得到长度为1 116bp的OmpP5基因序列。将该序列与已发表Hps参考株的OmpP5基因进行同源性比对及系统发育树分析,发现核苷酸同源性为89.8%~99.5%,分离株与参考菌株№4在同一分支,表明OmpP5基因具有一定的保守性,分离株和№4亲缘关系较近。研究结果为阐明辽宁省Hps毒力基因及致病机理提供了参考依据。     

副猪嗜血杆菌部分16S rRNA基因的克隆及序列分析

副猪嗜血杆菌(Haenophilus parasuis,Hps)为副猪嗜血杆菌病的病原体。目前,副猪嗜血杆菌地方分离株基因背景研究国内报道不多,试验针对临床分离的2株Hps进行16S rRNA基因片段的扩增、克隆、测序及同源性比较,以期在分子水平对副猪嗜血杆菌进行鉴定。1材料与方法1.1菌种和质粒副     

副猪嗜血杆菌thyA基因的序列分析

为探究副猪嗜血杆菌thyA基因的遗传特性,针对于分离的副猪嗜血杆菌辽宁分离株的thyA基因进行测序,并运用软件对基因序列及氨基酸序列的同源性等进行分析研究。结果显示,thyA基因在副猪嗜血杆菌辽宁株亲缘性较高,其中基因序列与已公布的参考菌株同源性为95.7%~100%,氨基酸序列同源性为97.2%~100%,预测thyA基因编码蛋白的三级结构,发现thyA毒力基因在副猪嗜血杆菌中保守存在,为揭示thyA基因在副猪嗜血杆菌中功能奠定了一定基础。     

不同猪源副猪嗜血杆菌河南分离株16S rRNA基因的遗传进化分析

为研究来自河南省不同猪源的副猪嗜血杆菌(Hps)的遗传演化关系,应用PCR方法扩增所分离的良种猪源、家养野猪源和地方土猪源等3株Hps(KF0901、JZ0801和XY0501)的16S r RNA基因,并进行序列比较分析。结果 3株Hps的16S r RNA基因全长均为822 bp,彼此间核苷酸序列同源性为99.3%~99.6%,与参考菌株的核苷酸序列同源性为97.1%~99.4%;基于16S r RNA基因序列绘制的系统进化树显示,本研究中家养野猪源Hps和地方土猪源Hps均属于血清5型,而良种猪源血清5型Hps却与血清12型和血清14型的亲缘关系更近。表明Hps在良种猪、家养野猪和地方土猪之间彼此交叉感染或具有共同来源;并非所有血清5型Hps分离株都属同一分支。     

副猪嗜血杆菌aroA基因的克隆与序列分析及2种三重PCR检测方法的建立

本试验对分离的5株副猪嗜血杆菌进行了"卫星" 生长试验、生化鉴定和PCR检测。通过对aroA基因序列进行分析,发现这5株菌同标准菌株相比,其核苷酸序列相似性为96.3%~99.8%,氨基酸序列相似性为98.2%~99.5%。此外,还建立了分别针对副猪嗜血杆菌(Hps)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)及猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒的三重PCR检测方法;敏感性试验表明,三重PCR最低能检出Hps、PPV、PRV、PCV2的DNA分别为12、16、7.6和6.3 pg。     

家养野猪副猪嗜血杆菌的分离鉴定及16S rRNA序列分析

对江西省某家养野猪场临诊疑似副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis,Hps）感染的病例进行细菌分离鉴定,PCR扩增分离菌株的16SrRNA并进行测序分析,并对分离菌进行细菌形态、生化鉴定和PCR鉴定及序列比对分析。结果显示,获得1株家养野猪源Hps分离株（命名为HPJXYZ01）,该分离株与国内外参考菌株序列之闻的同源性为93．1％～99．2％,与本实验室江西省家猪源分离株的同源性为84％～92．1％。结果表明,江西省家养野猪中存在Hps感染,分离株与国内外家猪源Hps间的16SrRNA序列差异不大,Hps16SrRNA核苷酸序列比较稳定,其进化不存在明显的地域相关性。     

副猪嗜血杆菌Shandong2007株的分离与鉴定

对1例临床症状、病理剖检变化疑似副猪嗜血杆菌病的仔猪病料进行实验室诊断,进行了细菌形态观察、培养特性和生化特性等鉴定,根据副猪嗜血杆菌的16 S rRNA基因设计特异性引物进行PCR扩增,将822 bp片段连入T-载体后测序,再通过GenBank进行比对分析.生化试验结果为接触酶阳性,氧化酶和H2S阴性;生长需要NAD,发酵果糖、半乳糖和蔗糖等,不分解D-甘露醇和D-山梨醇.药敏试验显示,对氨苄青霉素、丁胺卡那霉素等药物敏感.PCR鉴定结果与国外副猪嗜血杆菌菌株16 S rRNA序列的同源性为99%以上,初步鉴定该分离菌株为副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,Hps).     

Cloning and Bioinformatics Analysis of espP Gene of Haemophilus parasuis

In order to evaluate whether Haemophilus parasuis espP gene could use as a vaccine candidate antigen or not,the espP gene was amplified by PCR using the specific primers that designed according to corresponding sequence getting form GenBank (accession No.:HAPS_1381) and then sent to sequence.After translating the DNA sequence into amino acid sequence,the signal peptide,hydrophilic region,linear B cell epitopes and 3D structure of Hps espP protein were predicted using multiple bioinformatics analysis.The results showed that the full length of Hps espP gene was 2 343 bp,encoding 781 aa.The first 23 aa were predicted as signal peptide.There were 12 hydrophilic regions and 12 B cell epitopes in the Hps espP protein.The 3D structure of C-terminal of the protein was consisted of a monomeric β-barrel containing 12 β-strands and a central pore.The study laid the foundation for further development of molecular vaccines based on espP protein against Hps infection.     

雀形目野生鸟类REV感染状况的调查及分离株gp90基因序列分析

为了解雀形目野生鸟类感染禽内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）的情况,采集了352份样品,应用PCR方法进行了初筛。然后将阳性样品适当处理后接种CEF细胞,利用IFA等方法进一步鉴定。结果分离到2株病毒WB11042和WB11043,分别来自黄喉鹀和燕雀。对2株REV分离株的gp90基因进行扩增、测序和序列分析。结果显示,其gp90序列与REV亚型Ⅲ的代表毒株（CSV、APC-566）亲缘关系最近,高达99%以上;与亚型Ⅱ代表株（SNV）和亚型Ⅰ代表株（HA9901）的亲缘关系相对较远,在95.5%~97.1%之间。遗传进化树分析也表明这2株野生鸟类分离株属于REV亚型Ⅲ。结果表明,雀形目野生鸟类也可以感染REV。     

绵羊透明质酸酶-2的真核表达及鉴定

为了构建绵羊透明质酸酶-2(hyaluronidase 2,Hyal-2)的真核表达载体并实现其在牛乳腺上皮细胞内瞬时表达,根据GenBank中绵羊Hyal-2基因序列(登录号:NM_001009754)设计2对引物,并分别在前段上游和后段下游引物5'端引入HindⅢ酶切位点和BamHⅠ酶切位点,同时在上游引物酶切位点后加入KOZAK序列,进行分段PCR扩增。以扩增的两段产物为共同模板运用重叠(overlapping)PCR技术扩增Hyal-2基因全长。通过连接反应将双酶切并纯化后的目的片段克隆于真核表达载体pEGFP-C1上,并通过脂质体转染法将构建好的真核表达载体转染牛乳腺上皮细胞,运用RT-PCR及Western blotting方法分别从核酸及蛋白质水平验证其表达。经测序分析,目的片段与模板核苷酸同源性为99%,氨基酸同源性为99%,且片段插入方向正确。RT-PCR及Western blotting方法检测均出现目的条带,证明成功构建了绵羊透明质酸酶-2的真核表达载体,并在牛乳腺上皮细胞中获得表达。     

狂犬病毒Flury株糖蛋白cDNA克隆与序列分析

根据狂犬病毒糖蛋白核苷酸序列,利用Oliga软件设计两对特异性引物,通过反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增了狂犬病毒Flury-lep糖蛋白的全长cDNA,将其插入克隆载体pMD-18T并测序。测序结果及同源性分析表明,糖蛋白cDNA长1574bp,编码524个氨基酸。狂犬病毒株Flury-lep的RGP基因序列与GenBank公布的狂犬病毒株RGP基因片段核苷酸序列的同源性为82．3％～96．3％,其编码产物的氨基酸序列同源性为88．4％～94．3％。     

金川牦牛BCL2A1基因克隆及生物信息学分析

为探讨金川牦牛抗凋亡因子--B淋巴细胞瘤2相关蛋白A1（B cell lymphoma 2 related A1，BCL2A1）基因特点，本试验采用PCR方法以金川牦牛血液DNA为模板扩增BCL2A1基因，用DNAStar、ExPASy、ABCpred等生物信息学软件分析基因序列和蛋白质结构。结果显示，克隆获得的片段长622 bp，GenBank登录号：MG459158，开放阅读框为516 bp，共编码171个氨基酸，其中缬氨酸（V）、赖氨酸（K）的含量较多，分别为9.4%和8.8%。BCL2A1分子质量为19.46 ku，理论等电点为4.99，不稳定系数为17.44，具有跨膜螺旋结构域（Scores>500）。二级结构主要为α-螺旋，占60.82%，有一个BCL2结构域，三级结构模型与人BCL2A1同源性最高（72.79%），BCL2A1存在潜在的B细胞抗原表位。与野牦牛氨基酸序列进行比对显示，金川耗牛BCL2A1存在5个氨基酸差异位点。NJ法系统进化分析显示，金川牦牛与野牦牛同源性为98.5%，亲缘关系最近。本试验成功克隆了金川牦牛BCL2A1基因，其在哺乳动物中具有较高的保守性，为深入研究牦牛BCL2A1基因功能提供理论依据。     

一株野鸭源H6N1亚型禽流感病毒HA基因的克隆及分子进化分析

根据禽流感病毒的HA基因,设计特异性的引物,而后从尿囊液提取病毒的RNA,应用RT-PCR技术扩增该流感病毒的HA全基因序列,将该基因克隆到pMD-18T载体,并进行鉴定和测序,应用生物学分析软件进行同源性比对和绘制HA基因的进化树,并推导其氨基酸序列。结果表明：HA基因全长1701 bp,共编码567个氨基酸,与Genbank中选择的27株禽流感病毒基因的HA基因序列相比较,核苷酸序列和氨基酸序列同源性均在92%以上。通过对HA基因的同源性比对,可以明确毒株间的进化关系,从而为禽流感的遗传进化研究提供参考。