牛分枝杆菌三价组合及融合DNA疫苗免疫效果的研究

分泌性蛋白Ag85B、MPB64和ESAT-6为Mycobacterium boris的主要保护性抗原,在诱导机体免疫反应和抵抗感染中发挥重要作用。本研究以peDNA3．1（＋）为载体,构建了由上述3种抗原基因构成的不同疫苗：3基因融合（peDNA-MPB64-Ag85B-ESAT-6,pCMAE）DNA疫苗和三价（pcDNA-Ag85B＋peDNA-MPB64＋pcDNA-ESAT-6）DNA疫苗,评价各种DNA疫苗诱导的体液免疫、细胞免疫及以BCG攻毒后的免疫保护水平。试验结果表明,多基因融合DNA疫苗免疫后的小鼠血清抗体水平、淋巴细胞增殖（SI值）、gamma interferon（IFN-γ）和interleukin-2（IL-2）水平明显高于其他各组（P〈0．05）,攻毒保护效果也优于多价DNA疫苗,达到了BCG疫苗的免疫保护水平,表明本研究制备的融合DNA疫苗具有良好的应用前景。     

铜绿假单胞菌oprL和oprF基因二价组合DNA疫苗初免-灭活疫苗加强免疫效果的研究

为探索铜绿假单胞菌oprL和oprF基因的二价组合DNA疫苗pOPRL+pOPRF初免-灭活疫苗加强免疫的效果,本实验以铜绿假单胞菌二价组合DNA疫苗pOPRL+pOPRF免疫BALB/c小鼠后再以灭活疫苗加强免疫,根据两种疫苗的免疫次数分为初免-加强免疫1组和初免-加强免疫2组,同时设置二价组合DNA疫苗单独免疫组、灭活疫苗单独免疫组以及生理盐水对照组。免疫后间接ELISA法测定小鼠血清抗体水平、MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平,双抗体夹心ELISA测定小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ、IL-2和IL-4的水平。三免两周后将铜绿假单胞菌以1.35×10~(10)cfu/只的剂量对各组小鼠进行攻毒试验,测定攻毒后各组小鼠的保护率。结果显示DNA疫苗初免-灭活疫苗加强免疫诱导的小鼠血清抗体水平、刺激指数(SI)值及小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN-γ和IL-2含量显著高于DNA疫苗单独免疫组(p0.05)。且初免-加强免疫1组小鼠的SI值及分泌的IFN-γ和IL-2含量显著高于灭活疫苗组(p0.05),但各组小鼠分泌的IL-4含量无显著差异(p0.05)。初免-加强免疫1组、初免-加强免疫2组、灭活疫苗组和DNA疫苗单独组的保护率分别为92%、80%、84%和72%。表明二价组合DNA疫苗初免-灭活疫苗加强免疫策略可以诱导小鼠产生较高水平的抗体和Th1型细胞免疫应答,并可为小鼠提供较好的保护率。     

铜绿假单胞菌flg E基因壳聚糖纳米DNA疫苗的免疫效果评估

为评价铜绿假单胞菌flgE基因壳聚糖纳米DNA疫苗的免疫效果，本研究经PCR扩增flgE基因，将其插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中，构建flgE基因的重组质粒pflgE，进一步以壳聚糖为佐剂制备了纳米DNA疫苗CpflgE，通过测定OD260nm值检测纳米DNA疫苗的包封率、加入DNA酶后经琼脂糖凝胶电泳检测其抗DNA酶降解的能力、37℃恒温静置1 d,3 d和5 d后经琼脂糖凝胶电泳检测稳定性。结果显示CpflgE的包封率为94.69%，可有效抵抗DNaseⅠ的降解，具有较强的稳定性。以pflgE和CpflgE免疫BALB/c小鼠，共免疫3次，同时设置灭活疫苗免疫组、铜绿假单胞菌鞭毛蛋白亚单位疫苗免疫组以及PBS对照组。免疫后不同时间经间接ELISA测定各组小鼠血清抗体水平，MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平，采用检测试剂盒测定各组小鼠血清中IFN-γ、IL-2和IL-4的水平。结果显示，Cpflg E诱导小鼠的血清抗体水平、脾淋巴细胞增殖水平及血清中IFN-γ、IL-2和IL-4的浓度总体上虽均低于灭活疫苗，但与鞭毛蛋白亚单位疫苗相当，且显著高于pflgE (P<0....     

生物矿化的口蹄疫病毒样颗粒疫苗的免疫原性评价

生物矿化技术可以增强口蹄疫(foot-and-mouth, FMD)病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs)的耐热性，但并无试验数据支撑矿化FMD VLPs用于临床的可行性。本研究旨在评价矿化FMD VLPs疫苗在牛和猪上的免疫原性。用VLPs和矿化VLPs免疫猪，采用液相阻断ELISA(LPBE)检测猪血清中的特异性抗体滴度，并经酶联免疫斑点试验(ELISpot)检测免疫猪外周血淋巴细胞(PBLs)经体外刺激后分泌的特异性IFN-γ。用矿化A型VLPs、矿化O型VLPs、矿化的A型和O型二价VLPs分别免疫牛，采用LPBE、中和试验、夹心ELISA检测血清中的特异性抗体、中和抗体以及IL-4和IFN-γ的含量。结果显示，VLPs与矿化VLPs免疫猪的血清抗体水平无显著差异，相对于VLPs,矿化VLPs免疫猪的PBLs分泌的IFN-γ水平高于VLPs免疫猪(P<0.05);3种疫苗免疫牛血清中IL-4和IFN-γ水平均高于PBS组，矿化二价疫苗与相应的矿化单价疫苗免疫牛的血清特异性抗体和中和抗体效价均无显著差异。综上所述，矿化VLPs对牛和猪均具有良好的...     

禽多杀性巴氏杆菌ompa DNA疫苗在小鼠体内免疫效果试验

应用PCR技术扩增获得禽多杀性巴氏杆菌的ompa基因片段,克隆到pUCm-T载体,再亚克隆到真核表达质粒载体pCDNA3.1(+)上,构建重组质粒pcA,体外转染Vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光试验检测其转录表达情况。动物免疫分为3组:pCDNA3.1(+)组、PBS对照组和pcA组,每组16只BALB/c小鼠,pCDNA3.1(+)组和pcA组以100μg/只的剂量肌注免疫,PBS组每只小鼠肌注100μL 1×PBS,各组均免疫3次,每次间隔2周。间接ELISA检测免疫后小鼠血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况,三免2周后检测脾淋巴细胞IFN-γ分泌情况。强毒攻击,计算小鼠存活数目及保护率。结果显示,间接免疫荧光试验和RT-PCR检测结果均表明pcA可在体外培养的Vero细胞中表达目的蛋白。动物免疫后,pcA组免疫小鼠血清抗体水平持续上升,与pCDNA3.1(+)组和PBS组相比差异极为显著(P<0.01)。经提取的禽多杀性巴氏杆菌总外膜蛋白(Omps)刺激后,pcA组的刺激值(SI值)与pCDNA3.1(+)组及PBS免疫组相比均差异显著(P<0.05)。脾细胞产生的IFN-...     

犬GM-CSF基因对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用

犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白.利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应.为进一步提高VP2 DNA疫苗的免疫活性,本实验利用犬粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因作为生物佐剂研究其对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用.首先通过RT-PCR方法从犬淋巴细胞中扩增GM-CSF基因,并将其插入到pcDNA3.1栽体上,分别构建该基因的两个分泌型真核表达载体,即非融合表达载体pcDNA-cGMCSF和与Myc His融合的表达栽体pcDNA-cGMCSF/MH.用pcDNA-cGMCSF/MH载体转染HEK293T细胞以确定GM-CSF基因能否在真核细胞中进行分泌表达.然后用本室构建的VP2基因表达栽体单免疫小鼠,用VP2表达载体与pcDNA-cGMCSF共免疫小鼠(pcDNA3.1空载体作为阴性对照).免疫后用ELISA方法检测不同时间小鼠血清的抗体水平.用MTT法检测小鼠免疫后35 d时淋巴细胞的增殖活性,同时用ELISA试剂盒检测小鼠淋巴细胞γ干扰素的表达水平.结果表明,本试验构建的表达载体能够介导重组GM-CSF在真核细胞中进行分泌表达.免疫实验表明,利用GM-CSF基因与VP2基因共免疫小鼠,抗体的水平明显高于VP2基因单免疫组(P＜0.01).共免疫组小鼠淋巴细胞的刺激指数和γ干扰素的表达水平均明显高于单免疫组(P＜0.05).由此可见,GM-CSF表达载体可明显提高CPV VP2 DNA疫苗的免疫应答水平.     

菊粉对铜绿假单胞菌flgE基因DNA疫苗的免疫增强作用

为研究菊粉对铜绿假单胞菌flgE基因DNA疫苗的免疫增强作用,本研究将铜绿假单胞菌的flgE基因克隆于真核表达载体pcDNA3.1(+)中制备DNA疫苗,分别以该DNA疫苗(100μg/只)和菊粉佐剂+DNA疫苗免疫BALB/c小鼠(质粒100μg/只,终浓度20%菊粉),同时设置菊粉灌胃对照组(600 mg/kg)以及灭活疫苗(100μL/只)、鞭毛蛋白(100μL/只)、pcDNA3.1(+)空载体(100μg/只)和PBS对照组(100μL/只)。每两周免疫一次,共免疫3次。利用间接ELISA检测免疫后血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖水平,双抗夹心ELISA检测IFN-γ分泌情况,计算强毒攻击后各组小鼠的存活数及保护率。结果显示,菊粉佐剂组和菊粉灌胃组小鼠产生的抗体水平与DNA疫苗组相比无明显差异(p0.05),且显著低于灭活疫苗组和鞭毛蛋白组(p0.05);菊粉佐剂组对小鼠脾淋巴细胞的刺激值(SI值)和IFN-γ水平与鞭毛蛋白组相当,明显高于菊粉灌胃组和DNA疫苗组(p0.05);菊粉佐剂组和菊粉灌胃组对小鼠的保护率均高于DNA疫苗组,但低于灭活疫苗组,表明以菊粉预先灌胃和以菊粉为佐剂均可在一定程度上提高flgE基因DNA疫苗对小鼠的保护效率,但仍不及传统的灭活疫苗。本实验为铜绿假单胞菌DNA疫苗的研究及菊粉在DNA疫苗中的应用奠定基础。     

猪IFN-γ和IL-4重组质粒对口蹄疫疫苗的免疫佐剂效应研究

为了研究猪IFN-γ和IL-4对疫苗的免疫佐剂效应,用pcDNA3.1/IFN-γ和pcDNA3.1/IL-4的重组质粒与口蹄疫双价疫苗配伍免疫小鼠,检测小鼠抗口蹄疫抗体水平和CD4＋/CD8＋T细胞比值的动态变化,观察其免疫佐剂效应。结果表明pcDNA3.1/IFN-γ和pcDNA3.1/IL-4重组质粒都能显著提高小鼠抗口蹄疫抗体水平（P〈0.01）,其中pcDNA3.1/IFN-γ提高亚洲Ⅰ型FMD抗体水平的佐剂效应较pcDNA3.1/IL-4的显著（P〈0.01）,而pcDNA3.1/IL-4提高O型FMD抗体水平的佐剂效应显著高于pcDNA3.1/IFN-γ（P〈0.01）,pcDNA3.1也显示出了一定的佐剂效应;免疫后不同时间pcDNA3.1/IFN-γ和pcDNA3.1/IL-4组CD4＋/CD8＋T细胞比值显著高于其他组（P〈0.01）,且第21天与第7、45天的差异极显著（P〈0.01）。     

皮蝇素A基因DNA疫苗的构建及其免疫特性研究

本研究以实验室保存的原核表达载体pET-HA为模板,PCR扩增皮蝇素A(HA)基因,将克隆基因插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中构建DNA疫苗pcDNA-HA。构建的DNA疫苗pcDNA-HA和空载体pcDNA3.1(+)体外转染小鼠胎儿成纤维细胞,间接免疫荧光试验检测细胞内目的基因的表达。将pcDNA-HA、空载体pcDNA3.1(+)和PBS免疫BALB/c小鼠后,对免疫小鼠的体液免疫水平进行了检测。结果表明,构建的DNA疫苗能在小鼠胎儿成纤维细胞中表达,能被抗HA抗体识别,可诱导小鼠产生特异性体液免疫反应,说明HA可作为牛皮蝇蛆病的候选疫苗抗原。本研究为牛皮蝇蛆病的DNA疫苗研究奠定了基础。     

兔出血症病毒TP株VP60基因DNA免疫小鼠的实验研究

为评价兔出血症病毒(RHDV)VP60基因在小鼠体内诱导产生体液免疫和细胞免疫情况,本研究构建了RHDV VP60基因的真核表达质粒pcDNA-VP60,并将其免疫小鼠。利用ELISA方法检测特异性抗体和小鼠外周血细胞因子水平,MTT法和流式细胞术(FACS)检测小鼠外周血T淋巴细胞增殖情况和T淋巴细胞亚群的动态变化。抗体检测结果显示,重组质粒免疫组抗体水平在免疫后5周～6周达到峰值,而且与对照组比较差异显著(p<0.05);细胞因子检测结果显示,重组质粒免疫组血清中IFN-γ、IL-2、IL-4因子水平随免疫时间延长而升高,并且能够维持较高水平,与对照组比较差异显著(p<0.05);T淋巴细胞检测结果显示,重组质粒免疫组T淋巴细胞明显增殖,CD4+T淋巴细胞数量免疫后明显增高,与对照组比较差异显著(p<0.05);所有检测指标显示重组质粒免疫组和灭活苗免疫组比较均无显著差异(p>0.05)。以上结果表明pcDNA-VP60重组质粒可以诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫,为研制预防兔病毒性出血症的候选DNA疫苗提供了实验依据。