甜菜双向电泳体系条件的优化

为了获得甜菜叶片双向电泳中蛋白质最佳提取方法,建立甜菜叶片蛋白质双向电泳最佳的双向电泳体系。以甜菜叶片为材料,通过比较分析,研究甜菜叶片总蛋白提取方法、IPG胶条pH值及其对应上样量等因素对甜菜叶片蛋白质双向电泳结果的影响。结果表明:酚提取法、TCA/丙酮提取法和可溶性蛋白提取法3种蛋白提取方法中TCA/丙酮法提取效果较好,pH值4~7与pH值5~8的双向蛋白电泳比较发现:pH值4~7胶条蛋白点清晰且在图谱上的蛋白点分布均匀,无蛋白点集中现象,更适合甜菜叶片的蛋白质组分析。采用7 cm线性固相IPG胶条进行双向电泳,150μg上样量蛋白点明显增多,双向电泳效果更好,pH值4~7的17 cm胶条300μg上样量胶点更多更清晰,试验结果为甜菜蛋白质组学的研究提供了最佳的试验方法。     

甘蓝型油菜蛋白质双向电泳体系的建立

选用油菜品种08127,采用TCA-丙酮提取方法,pH 4~7胶条和改进的IEF聚焦程序,得到较好的蛋白质双向电泳结果,建立了一种适合甘蓝型油菜的双向电泳体系;利用其他甘蓝型油菜品种的幼苗、叶片和茎中的蛋白检验了建立的实验体系,都能得到较好的蛋白质双向电泳结果;利用该实验体系比较甘蓝型油菜幼苗不同发育时期蛋白质双向电泳图,找到二者之间的差异点,选取部分点成功进行了质谱分析。     

毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)总蛋白质双向电泳体系的建立

为开展毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)的蛋白质组学研究,本研究对毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)总蛋白质提取方法和双向电泳参数进行了筛选和优化,以期建立适合毛尖紫萼藓蛋白质双向电泳的实验体系。分别采用Tris-酚抽提法和TCA-丙酮法对毛尖紫萼藓总蛋白质进行提取,比较分析了两种蛋白质提取方法的效果,并研究了IPG胶条的pH范围及蛋白质电泳上样量等因素对毛尖紫萼藓蛋白质双向电泳结果的影响。结果发现,在SDS-PAGE电泳结果中,与TCA-丙酮法相比,Tris-酚抽提法提取的蛋白质条带清晰,数目较多,完整性较好;在双向电泳结果中发现,与pH值为3~10的IPG胶条相比,使用pH值为4~7的IPG胶条的双向电泳图谱蛋白质点清晰且分布均匀,更适合毛尖紫萼藓的蛋白质组学分析;使用24 cm的pH值为4~7胶条,上样1200μg蛋白质时,电泳结果中可分辨的蛋白质点最多,且形状规则,水平和垂直拖尾情况较轻,图像清晰。本研究基于Tris-酚抽提法建立的毛尖紫萼藓蛋白质双向电泳体系获得的蛋白质样品质量好,电泳分辨率高,为毛尖紫萼藓进一步的蛋白质组学研究提供理论参考。     

刺参体腔液蛋白质双向电泳体系的建立及优化

为了探索并建立刺参的体腔液蛋白双向电泳体系,实验对刺参体腔液的蛋白质制备方法、上样量、IPG 胶条的pH选择及等电聚焦程序进行了优化,并利用银染法进行染色。结果表明：改进的TCA-丙酮沉淀法增加了提取的蛋白量和纯度;采用8.5 cm,pH 4~6.5的IPG胶条,45 μg蛋白上样量,等电聚焦先设250 v电压,7 mA电流,聚焦时间30 min后,再将电压升至1000 v,聚焦时间3 h,能有效提高双向电泳(2-DE)图谱中蛋白点的分离度和分辨率。本实验可用于筛选刺参差异表达蛋白以及后续的刺参蛋白质组学研究。     

薄皮甜瓜果实总蛋白质双向电泳优化体系的建立

为建立适宜的薄皮甜瓜果实总蛋白质双向电泳的试验体系,以‘京蜜11号’薄皮甜瓜为试材,从果实总蛋白质的提取方法、等电聚焦条件、IPG胶条梯度等方面进行了探索优化。结果表明,酚-甲醇/醋酸铵沉淀法能够高效的提取薄皮甜瓜果实总蛋白质,选用24 cm pH 4~7的IPG胶条,800 μg上样量,120000 Vhs聚焦,SDS-PAGE电泳后采用胶体考马斯亮蓝染色。该优化的体系可以获得背景清晰、分辨率高、重复性好的双向电泳图谱。     

甜瓜叶片蛋白的提取和双向电泳体系的优化

为建立适合甜瓜(Cucumis melo L.)叶片蛋白质组分析的双向电泳体系(2-D),以甜瓜植物叶片为试验材料,比较了2种不同植物叶片蛋白的提取方法,并对双向电泳的2个重要的环节技术即聚焦参数和上样量进行了优化。结果表明：与Tirs-酚提取法相比,使用改良后的Mg/NP-40/PEG3350/TCA丙酮提取法提取叶片蛋白,经过SDS-PAGEF分析之后,所得的蛋白含量较高,Rubisco酶去除的较好,条带清晰。采用 pH 3~10,18 cm的IPG胶条进行双向电泳时,适当增加低电压聚焦时间,得到了较为清晰的2-D图谱。蛋白上样量为800 μg时,得到的蛋白点数最多,低峰度蛋白较为清晰。研究建立了适用于甜瓜叶片蛋白分析的双向电泳体系,得到了蛋白点数目多且分辨率高的双向电泳图谱。为下一步在蛋白组学水平上分析与甜瓜抗病、产量、性状等相关蛋白提供了技术支持。     

大葱花蕾总蛋白双向电泳体系的建立

为建立适合于大葱花蕾总蛋白的双向电泳体系,本研究以大葱花蕾为材料,对大葱花蕾总蛋白提取方法、IPG胶条梯度范围、上样量、等电聚焦等双向电泳的关键步骤进行优化。结果表明最适宜大葱花蕾总蛋白的双向电泳条件为:TCA-丙酮沉淀法提取大葱花蕾总蛋白,选择24 cm p H 4~7的IPG胶条,上样量800μg,按聚焦程序Ⅰ聚焦后进行双向电泳并采用考马斯亮蓝染色。采用该体系可以获得分辨率高、重复性好的双向电泳图谱。     

黄瓜雌花花冠蛋白质双向电泳技术体系的建立

[目的]为建立适合黄瓜(Cucumis sativus L.)雌花花冠蛋白质双向电泳技术体系,[方法]以开花当天的黄瓜雌花花冠为试验材料,从蛋白质提取方法、IPG胶条梯度、等电聚焦程序、蛋白质上样量、染色方法等方面进行了探索。[结果]结果表明：酚抽提法得到的黄瓜雌花花冠蛋白质纯度高、产量高。17cm pH4~7 IPG胶条得到的双向电泳图谱蛋白质点分布均匀、清晰。优化后的等电聚焦程序适当增加了低压除盐步骤和时间,得到的双向电泳图谱蛋白质点圆且多。300μg上样量的双向电泳图谱蛋白质点可达400多个,低丰度蛋白质点清晰。硝酸银染色的双向电泳图谱蛋白质点较多。[结论]该实验获得了蛋白质点分布均匀、背景清晰、分辨率高、质量高的双向电泳图谱,为研究黄瓜雌花花冠蛋白质组学奠定了基础。     

水稻种子蛋白双向电泳方法的建立和质谱初步分析

为了建立适用于水稻(Oryza sativa L.)种子蛋白质组分析的双向电泳方法,本研究比较了三氯乙酸/丙酮法和改良的酚提取法对水稻种子蛋白的提取效果,不同蛋白提取液上样量、不同p H梯度(p H 3~10和p H 4~7)IPG胶条对水稻种子蛋白的分离效果。结果表明:在目前的双向电泳体系下,采用改良的酚提取法,24 cm p H 4~7线性IPG胶条,上样量1 200~1 500μg的条件可以获得分辨率高、重复性好、胶内蛋白点适用于后续质谱分析的双向电泳图谱。最后本实验通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)对10个随机挑选的胶内蛋白质点进行了初步蛋白质鉴定分析,进一步确定了改良的酚提取法可以适用于水稻种子蛋白质双向电泳分析。     

橡胶树花序总蛋白双向电泳研究体系的建立与优化

以橡胶树热研7-33-97花序为试验材料,分别采取3种蛋白质提取方法(TCA/丙酮法,酚抽提法和Tris-丙酮-酚法)提取橡胶树花序总蛋白。对3种蛋白质提取方法的蛋白提取率、单向SDS-PAGE电泳和双向电泳结果进行分析比较,结果表明3种方法中TCA/丙酮法的提取率最高(6.09±0.22)mg/g,单向SDS-PAGE电泳条带清晰且较完整,双向电泳后获得的蛋白点最多(994±25),是建立橡胶树花序蛋白质组学研究体系的较好方法。进一步对基于TCA/丙酮法提取的橡胶树花序总蛋白质双向电泳体系进行优化,结果显示利用p H范围为4~7的IPG胶条,在聚焦时间为7.0×10~4 Vh、蛋白上样量为1.0×10~3μg,以及12.5%凝胶浓度条件下,考马斯亮蓝染色法获得的橡胶树花序蛋白质双向电泳图谱质量最好,可为橡胶树生殖发育相关蛋白质组学研究奠定良好基础。     

超薄层等电聚焦电泳技术在杂交苦瓜种子纯度鉴定上的应用

为了发掘苦瓜(Momordica charantia L.)种子纯度室内快速鉴定方法,采用种子的水溶性蛋白超薄等电聚焦电泳与田间种植的方法对4个苦瓜杂交组合的F1种子纯度进行检验,并将结果进行一一比对,发现参试的4个组合的父母本均可找到特征蛋白质电泳谱带,而F1均含有父母本的特征蛋白质电泳谱带;超薄等电聚焦电泳技术鉴定的结果与田间种植鉴定的结果完全吻合,说明蛋白质超薄等电聚焦电泳技术可作为杂交苦瓜种子纯度检验的室内快速鉴定方法。     

苦瓜种子蛋白质的研究

用SDS－PAGE分析表明：苦瓜种子主要含有57KD和49KD蛋白组分，它们由诸多低分子量（LMW＜47KD）蛋白亚基通过双硫桥结合，是药用价值高，营养丰富的蛋白资源。     

苦瓜多糖的测定方法研究

为开发和利用苦瓜多糖,选用苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法测定苦瓜多糖的含量;比较不同成熟度苦瓜中多糖的含量差别;比较冻融法制备的苦瓜汁粉及苦瓜渣粉中多糖含量。结果显示,对同一种样品利用苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法测定,测定结果分别为28.00%和29.25%,苯酚硫酸法测定结果更为准确合理,可作为苦瓜中多糖含量测定的首选方法;测定不同成熟度苦瓜的多糖含量,发现苦瓜成熟度越高,多糖含量越低,说明苦瓜生理成熟阶段,苦瓜多糖是重要的呼吸基质之一;利用冻融法制备的苦瓜汁粉多糖含量为31.25%,苦瓜渣粉多糖含量为28.64%,说明冻融法获得的苦瓜汁没有起到完全分离苦瓜多糖的作用。     

苦瓜破壁超微粉碎工艺优化研究

为得到破壁超微苦瓜粉,使存于苦瓜细胞中的有效成分充分游离释放利用,为苦瓜袋泡茶和片剂加工提供原料,采用可调参数式球磨机对苦瓜进行了破壁超微化粉碎工艺试验研究。运用四因素二次回归正交旋转组合试验设计方案,建立了试验因素与苦瓜细胞破壁率间影响关系的数学模型,并通过优化计算得到了苦瓜破壁超微粉碎的最佳工艺参数为：转速423~436 r/min,粉碎时间1.9~2.1 h,球料比6.7~7.2,物料含水率5.6%~6.7%,此时苦瓜破壁率达95%以上。同时,研究表明苦瓜破壁超微粉碎可极大地提高总皂苷溶出速率与溶出量,为苦瓜的实际有效利用奠定了基础。     

基于苦瓜转录组序列的SSR分子标记开发

为了全面了解苦瓜转录组SSR位点特征和满足苦瓜分子育种对分子标记的需求,利用MISA软件对来自苦瓜材料‘大沥-11’6个组织的59740条转录组Unigene序列进行SSR位点搜索,共检测出31066个SSR位点,出现频率(发现的SSR个数与总Unigene数之比)为52.00%,平均每2.62 kb出现1个SSR位点。在苦瓜转录组SSR位点中,基元类型主要为三核苷酸,占总SSR位点的42.17%;其次是二核苷酸,占总SSR位点的31.66%。利用Primer 3软件对搜索到的苦瓜转录组SSR位点进行引物设计,然后把获得的引物序列比对回苦瓜的参考基因组,选择上下游引物序列都是唯一比对的序列并去除重复后共获得9135对特异SSR引物。选择MC00上的232对特异SSR引物对‘谭边大顶’和‘华艺320’两个苦瓜品种基因组DNA进行PCR扩增,其中有219对特异引物可扩增出清晰的条带,有效扩增率为94.40%;有31对特异引物扩增产物表现出多态性,多态率为13.36%。本研究开发的苦瓜转录组特异SSR引物为苦瓜的种质资源分析、基因定位、分子标记辅助选择等理论与应用研究提供了引物数据参考。     

水稻种子萌发过程中胚蛋白质差异表达分析

采用IEF-SDS-PAGE双向电泳技术,对金稻1号水稻种子未萌发和萌发1-4d胚进行蛋白质分离。发现金稻1号水稻种子未萌发和萌发1-4d胚在PDQuest图像分析软件可识别的蛋白质点约215、201、187、162、132个,其中表达量变化2.5倍以上的蛋白质点有22个。选取表达量变化2.5倍以上的12个差异蛋白质点进行胶内酶解,并进行肽质量指纹图谱及其生物信息分析,初步鉴定出6个蛋白质,分别为硫氧还蛋白; 热休克蛋白;ATP合酶;LEA蛋白12;核苷二磷酸激酶;乙二醛酶。对这些蛋白质在水稻种子萌发过程中的作用进行了讨论。     

苦瓜营养成分分析及采收期对苦瓜营养品质的影响

为筛选适合鲜食或药用加工专用苦瓜品种及明确其采收期,以22个不同苦瓜品种（系）为试验材料,研究了不同苦瓜品种（系）的干物质量、维生素C含量、可滴定酸含量、纤维素含量、多糖含量、黄酮含量和皂苷含量等营养品质及采收期对营养品质的影响。结果表明,不同品种（系）苦瓜营养成分存在较大的差异,其干物质量、维生素C含量、可滴定酸含量、纤维素含量、多糖含量、黄酮含量和皂苷含量平均分别为5.48%、8.34 mg/(100 g·FW)、10.24 mmol/(100 g·FW)、2.33%、8.8 mg/(g·FW)、105.99 mg/(100 g·FW)和53.46 mg/(100 g·FW)。同时,研究表明：采收期对苦瓜维生素C含量、可滴定酸含量、纤维素含量、多糖含量、黄酮含量和皂苷含量具有显著的影响,苦瓜采收期以授粉后16~17天为宜,此时苦瓜品质佳。     

燕窝蛋白质样品制备方法的比较及其双向电泳分析

燕窝水提及丙酮沉淀蛋白质经液相等电聚焦电泳纯化后,再经双向电泳分离获得了质量较佳的2-DE图谱,由此可见液相等电聚焦电泳是对燕窝蛋白质进行纯化的有效手段。对纯化后的2个白燕窝和1个血燕窝水提及丙酮沉淀蛋白质进行了双向电泳分析,结果显示两种方法制备蛋白质获得的2-DE图谱非常相似。燕窝水提蛋白质经丙酮沉淀制备样品时间较透析、冻干所需的时间短,这对于成分更为复杂且蛋白质提取率较低的血燕窝则更为适用。