百合总蛋白质提取及双向电泳技术体系优化

本研究以百合组培苗叶片为试验材料,研究不同蛋白提取方法的得率、电泳上样量及聚焦除盐时间对双向电泳图谱的影响。结果表明:采用三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法提取百合叶片蛋白质比Tris-HCl法效果好,蛋白得率为38.5 mg/g,且颜色较白,获得的2-DE图谱较好;上样量为600μg时得到的图谱分辨率高、蛋白斑点分布均匀、清晰;等电聚焦(Iso-electrofocusing,IEF)中的2个除盐步骤的时间分别为2 h和2.5 h时,可以较好地去除盐分,顺利完成聚焦并得到较好的双向电泳图谱。该体系的建立将为下一步百合蛋白质组学研究及利用分子育种技术培育抗病品种提供技术资料。     

刺参体腔液蛋白质双向电泳体系的建立及优化

为了探索并建立刺参的体腔液蛋白双向电泳体系,实验对刺参体腔液的蛋白质制备方法、上样量、IPG 胶条的pH选择及等电聚焦程序进行了优化,并利用银染法进行染色。结果表明：改进的TCA-丙酮沉淀法增加了提取的蛋白量和纯度;采用8.5 cm,pH 4~6.5的IPG胶条,45 μg蛋白上样量,等电聚焦先设250 v电压,7 mA电流,聚焦时间30 min后,再将电压升至1000 v,聚焦时间3 h,能有效提高双向电泳(2-DE)图谱中蛋白点的分离度和分辨率。本实验可用于筛选刺参差异表达蛋白以及后续的刺参蛋白质组学研究。     

圆果种黄麻功能叶总蛋白提取方法及双向电泳体系的优化

蛋白质提取方法和电泳条件是蛋白质组学研究中双向电泳的关键。本文初步建立起一套适合圆果种黄麻功能叶总蛋白双向电泳(2-DE)分析的高效提取方法及电泳条件,在双向电泳技术中,比较了TCA丙酮、Tris-base/丙酮、Tris-HCl的蛋白提取方法,并优化了上样量和样品制备方法。结果表明, TCA丙酮法提取蛋白质产量高,达79.0 mg g^–1,比Tris-base/丙酮法和Tris-HCl的产量分别高出44.2%和114.1%。该法得到的2-DE图谱背景清晰,蛋白点数最多,约602个,较其他两种方法更适合用于黄麻功能叶总蛋白双向电泳分析;350 mg为最佳上样量。这为黄麻蛋白质组学后续研究奠定了基础。     

苦瓜种子蛋白质组双向电泳技术条件的优化

通过对苦瓜种子蛋白质样品的提取方法、等电聚焦参数、SDS-PAGE分离胶浓度以及胶条pH范围的优化筛选,建立了适合苦瓜种子蛋白组分析的双向电泳体系.结果表明:使用TCA-丙酮提取方法提取苦瓜种子蛋白,更适用于双向电泳分析,结合使用pH=5~8 IPG胶条以及优化的聚焦程序,能获得分辨率较高、蛋白点清晰、重复性好的2-DE图谱.经银染显色,可检测约660个蛋白点,主要分布在p H=5~8;该体系适合用于分析苦瓜种子的蛋白质组.     

叶用莴苣叶片蛋白质双向电泳技术体系的建立

为建立适用于生菜的(Lactuca sative L.)蛋白质组研究的双向电泳技术(2-DE),以叶用莴苣S24为材料, 采用TCA/丙酮沉淀法提取叶片蛋白,比较了两种标准曲线对蛋白浓度测定的影响,同时探讨了蛋白裂解、等电聚焦(IEF)条件以及其他一些关键技术,结果显示：与传统标准曲线相比,采用改良后标准曲线测定的蛋白浓度更准确,得到了背景清晰、重复性好、蛋白点分辨率较高的双向电泳图谱。初步建立了叶用莴苣叶片蛋白质的双向电泳技术(2-DE)体系。     

适用于蛋白质双向电泳的棉花胚性培养物蛋白质提取技术

 以陆地棉品种Coker 201为材料，对与甲醇/醋酸铵丙酮沉淀结合的酚抽提法和裂解液配方进行了优化，建立了适用于蛋白质双向电泳体系的棉花胚性培养物蛋白质样品制备技术。对胚性培养物，通过添加PVPP研磨和丙酮、TCA/丙酮、甲醇/醋酸铵等有机溶剂的系列洗涤，然后再进行酚抽提，蛋白质质量得到显著改善，获得的2-DE图谱质量高、可分辨的蛋白质点数多。比较分析3种裂解液对蛋白质的溶解效果发现，在裂解液中混合采用7 mol·L^-1尿素、2 mol·L^-1硫脲以及4% CHAPS是最有效的配方。     

玉米蛋白质组研究中双向电泳技术条件的优化

为了优化玉米叶片双向凝胶电泳技术条件,通过比较3种总蛋白提取方法对玉米双向电泳结果的影响,并对蛋白质上样量、IEF等电聚焦条件及SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓度等参数进行探索、优化;结果发现,与酚提取法和磷酸缓冲液法相比,采用改进的TCA/丙酮法提取总蛋白操作简单、方便,所得的2-DE图谱中蛋白质点数量多、背景清晰,是一种适用于提取玉米苗期叶片总蛋白的有效方法;同时筛选出:第一向IEF等电聚焦样品上样量为800μg,聚焦条件为20 000 V/h,在浓度为12.5%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,能够在17 cm的IPG胶条上获得背景低、分辨率较高、重复性好的双向电泳图谱,该优化体系适用于玉米叶片蛋白质组双向电泳分离,对玉米蛋白质组学研究具有重要参考价值。     

蓖麻种子蛋白质双向电泳优化体系的建立

为建立蓖麻种子蛋白质双向电泳优化体系,本研究以‘2129’品系蓖麻种子为试验材料,采用2-DE技术的方法,对其进行研究。结果表明:酚提取法比TCA/丙酮沉淀法更适宜提取蓖麻种子的总蛋白质;24 cm pH 3-10NL的干胶条比pH 4~7的干胶条更适宜应用在蓖麻种子的2-DE电泳中;对蛋白质样品进行除杂比不除杂得到的蛋白质图谱更加清晰,且横条纹和纵条纹都有所减少;蛋白质上样量为800μg时获得的蛋白质图谱最佳。本研究将为蓖麻种子蛋白质组学的研究提供基础数据和技术支持。     

黄瓜雌花花冠蛋白质双向电泳技术体系的建立

[目的]为建立适合黄瓜(Cucumis sativus L.)雌花花冠蛋白质双向电泳技术体系,[方法]以开花当天的黄瓜雌花花冠为试验材料,从蛋白质提取方法、IPG胶条梯度、等电聚焦程序、蛋白质上样量、染色方法等方面进行了探索。[结果]结果表明：酚抽提法得到的黄瓜雌花花冠蛋白质纯度高、产量高。17cm pH4~7 IPG胶条得到的双向电泳图谱蛋白质点分布均匀、清晰。优化后的等电聚焦程序适当增加了低压除盐步骤和时间,得到的双向电泳图谱蛋白质点圆且多。300μg上样量的双向电泳图谱蛋白质点可达400多个,低丰度蛋白质点清晰。硝酸银染色的双向电泳图谱蛋白质点较多。[结论]该实验获得了蛋白质点分布均匀、背景清晰、分辨率高、质量高的双向电泳图谱,为研究黄瓜雌花花冠蛋白质组学奠定了基础。     

水稻籽粒蛋白双向电泳条件的优化及其蛋白组学方法的比较

探讨适用于籽粒蛋白组学研究的策略,对深入研究籽粒的发育过程具有重要的意义。本文对比了3种不同的蛋白提取方法,优化了双向电泳中自制管胶一向的等电聚焦条件和IPG干胶条一向的等电聚焦时间,以MALDI-TOF/MS、Western-blot和磷酸化蛋白组学3个重要的蛋白质组学研究方法对胶内蛋白质鉴定分析。结果表明,可溶性蛋白提取法最适用于籽粒蛋白组学的研究; 电泳条件优化后,得到了较优的2-DE图谱; 胶内蛋白点适用于质谱分析、蛋白表达量验证(Western-blot)及籽粒蛋白的磷酸化组学的研究。本研究为下一步在蛋白组水平上分析籽粒发育提供了技术支持。     

东北梅花鹿血液SOD纯化及部分性质的研究

为了研究生茸期梅花鹿血液中SOD纯化技术及其部分性质,为开发鹿血抗衰老资源奠定理论基础。用氯仿乙醇除血红蛋白、热变性、丙酮沉淀、DEAE层析等技术对生茸期鹿血SOD进行纯化;用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其亚基分子量。结果表明：SOD的初始比活力为12.84 U/mg,经纯化后得到SOD 0.16 mg/mL,最终比活力4122.74 U/mg,纯化倍数为321.2倍,回收率66.38%;鹿血SOD含有2个亚基,其相对分子量为17.32 KD和16.28 KD。结果提示：鹿血SOD在60℃,0.002 mmol/L的Cu2+浓度下SOD活力最高,此时所得SOD纯化效果较好。     

苹果叶片蛋白质双向电泳样品制备方法的比较

为探索适用于苹果叶片蛋白质组学研究的样品制备方法,比较了三氯乙酸/丙酮沉淀法（TCA）、酚-甲醇/醋酸铵沉淀法和Tris-HCl提取法等3种总蛋白质的提取方法。制备的样品经双向电泳分离采用银染显色。结果3种方法分别得到450、374和1032个蛋白质点。认为Tris-HCl提取法为最适方法,所得图谱背景清晰,蛋白质信息量最大。     

陆地棉花药蛋白质组分析中双向电泳技术体系的建立与优化

建立了适用于陆地棉花药蛋白质组研究的双向电泳技术.以陆地棉花药为材料,采用液氮研磨的方法破碎组织,然后用三氯乙酸(TCA)/丙酮沉淀法和苯酚抽提结合甲醇/醋酸铵沉淀法提取蛋白质.采取载体两性电解质pH梯度等电聚焦/SDS-PAGE和固相pH梯度等电聚焦/SDS-PAGE双向凝胶电泳,对陆地棉花药总蛋白质进行了分离.通过...     

小麦籽粒淀粉分支酶同种型SBE IIb 的亚细胞定位及遗传多样性

以70个有代表性的小麦品种,采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法检测淀粉粒结合SBE IIb的品种间差异;并对SDS-PAGE凝胶中SBE IIb进行回收、复性和酶活性测定。结果表明,淀粉粒结合蛋白(SGP)中分子量为85 kD的SGP-2是与淀粉粒结合的SBE IIb,具有淀粉分支酶活性;SBE IIb从淀粉粒释放并去除SDS后活性立即恢复,其活性高峰出现在花后21 d左右;SBE IIb在小麦籽粒发育早期开始表达,不同发育时期表达量有差异,但其表达图谱在品种间没有差异,即编码SBE IIb的基因位点不具有品种的遗传多态性。     

适合双向电泳的植物全蛋白提取方法比较

样品处理是双向电泳实验最基础也是最关键的环节之一,样品制备成功与否直接关系到双向电泳图谱的质量和蛋白质组信息的完整性。应用于双向电泳中提取植物全蛋白的常用方法有：TCA-丙酮沉淀法、Tris-HC1法、酚法、Trizol沉淀法、Tris-丙酮-酚法、尿素/硫脲提取法。不同的方法适合不同特征的植物样品,比较了用于双向电泳的六种植物全蛋白提取方法的优缺点,并对每种方法适用的植物组织作了简要概述。     

快速溶剂萃取-GC-MS/MS测定土壤中邻苯二甲酸酯类化合物

采用气相色谱和质谱联用法(GC-MS/MS),创建土壤中邻苯二甲酸酯类化合物的便捷有效测试方法,从而为沉积物和土壤中邻苯二甲酸酯类化合物在土壤中的残留测定提供一定参考。选择试样中的6种碳酸酯类化合物,经过正己烷和丙酮(1:1,V:V)的萃取,过PSA/Silica净化小柱,除水干燥浓缩后,经GC-MS/MS上机分析,定量结果采用外标方法。相关试验结果显示,这6种碳酸酯类化合物的测定回收效果较好,在84.6%~98.3%之间,实验室内精密度较高,相对标准偏差在2.7%~12%之间,检出限在0.2~0.8 μg/kg之间,相关性R为0.9968~0.9995。该方法准确可靠、高效便捷、精密度高,具有显著节约人力和财力的特点,适宜于土壤中邻苯二甲酸酯类化合物的测定分析。     

The use of endosperm balance number for predicting gamete selection in complex polyploid interspecific Trifolium repens × T. nigrescens crosses

Endosperm balance number (EBN) was used to predict the outcome of crosses among a series of complex polyploid interspecific hybrids between Trifolium repens and T. nigrescens. Normal endosperm development, and hence seed‐set, requires a 2 : 1 maternal : paternal EBN ratio in endosperm. Based on their crossability, T. repens (2n = 4x = 32) and T. nigrescens (2n = 2x = 16) were assigned the same EBN of 4. This number was used to predict the relative success of different backcrosses and intercrosses. The method was further developed to successfully predict which gametes would effect fertilization when complex polyploid hybrids with uneven genomic constitutions (5x, 7x) produced mixtures of euploid and aneuploid gametes. This was achieved by allocating EBNs to all potential gametes of complex polyploids. Allocation of gamete EBNs enabled not only prediction of the success or failure of a cross, but also which gametes would be filtered to effect fertilization in complex crosses. This enhanced ability to understand the potential outcomes of complex crosses will increase the efficiency of plant breeding programmes that integrate secondary gene‐pools into economic species by interspecific hybridization.