猪圆环病毒2型抗体免疫金标检测试纸的研制

应用酶联免疫原理和胶体金层析技术,采用特殊的生产工艺,在玻璃纤维膜包被胶体金标记PCV-2抗原,在硝酸纤维素膜上检测线和对照线处分别包被PCV-2抗原和兔抗PCV-2抗体,制成猪圆环病毒2型抗体免疫金标检测试纸.当待检样品阳性时,在检测线处形成抗原抗体的免疫复合物而凝聚显色;当待检样品阴性时,检测线处不形成抗原抗体免疫复合物不显色.整个试验过程只需15 min.试纸与ELISA试剂比较,两者都具有微量、特异、准确的优点,且金标试纸独具操作方便、快速和结果直观、容易判定的优点.     

圆环病毒2型抗体胶体金检测试纸条的初步研制及应用

为快速检测猪群中猪圆环病毒2型抗体,采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,并标记纯化的猪圆环病毒Cap蛋白和兔IgG,包被至玻璃纤维膜上制备金标垫,将纯化抗原和羊抗兔IgG分别包被至硝酸纤维素膜的检测线与质控线上,建立了检测猪圆环病毒2型抗体的胶体金免疫层析方法并组装检测卡。结果显示,组装的检测卡只与圆环病毒阳性血清发生特异性反应,阳性血清稀释10倍后仍然能够检出。用此检测卡与商品化ELISA试剂盒对100份临床血清进行平行检测,阳性率分别为89%和93%,两种方法符合率在95%以上。该方法操作简便、特异性强,可广泛应用于基层,也为圆环病毒疫苗效果评价提供了良好的试剂选择。     

检测猪圆环病毒2型抗体SPA胶体金免疫层析方法的建立

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,并将其标记SPA,将金标SPA包被至玻璃纤维膜上,将猪圆环病毒2型（PCV-2） Cap蛋白、抗SPA抗体分别包被至硝酸纤维素膜的检测线与质控线上,建立了一种检测PCV-2抗体的胶体金免疫层析方法。检测阳性样品时,在检测线和质控线处均出现红色条带;检测阴性样品时,仅在质控线处出现红色条带。该方法与ELISA相比,其灵敏度为89.19%,特异性为100%,并且与PCV-1、猪瘟病毒（HCV）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）阳性血清无交叉反应。     

猪圆环病毒抗原表位肽免疫层析试纸条的研制

猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2,PCV2)的感染与断奶仔猪多系统衰竭综合征(PostweaningMultisystemicWastingSyndrome,PMWS)的发生密切相关。为快速便捷地检测猪圆环病毒2型抗体,本次试验主要采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,运用金黄色葡萄球菌蛋白A蛋白(Staphylococal Protein A,SPA)作为标记蛋白制备金标垫,分别以猪圆环病毒抗原表位肽和SPA免疫兔血清纯化IgG作为检测带(T带)与质控带(C带),经多次重复试验,分别确定了胶体金的最佳标记浓度、最适pH、重悬液和样品垫处理液的最佳配方以及检测带(优势抗原表位肽)和质控带(多抗IgG)的最适包被浓度,最终装配成抗体检测试纸条,用以检测已知的PCV2阳性血清和阴性血清,验证其检测的敏感性、特异性与稳定性。结果表明,经纳米粒度仪检测可得知胶体金颗粒大小在10 nm～14 nm之间。用SPA标记胶体金的最适pH为6.0,最佳标记量为7μg/mL。检测带和质控带的蛋白包被浓度均为1mg/mL。经验证,该试纸条不同批次间以及同一批次内重复性较好,具有较好的灵敏度、特异性和稳定性,能够准确检测猪血清样品中的抗体水平,可以进一步评价猪圆环病毒病疫苗的免疫效果。     

猪圆环病毒2型胶体金抗体检测方法的建立

为建立检测猪圆环病毒2型(PCV2)胶体金检测方法,本研究对SPA蛋白进行胶体金标记,并喷涂于玻璃纤维上制备金标垫,分别以重组PCV2 ORF2蛋白和猪IgG作为检测线和质控线,制作PCV2抗体检测胶体金免疫层析试纸条。检测结果表明,试纸条操作简单,肉眼于10 min内可以判定结果,对PCV2免疫血清具有高度特异性,与猪其它病毒免疫血清无交叉反应,检测灵敏度与ELISA相近。试纸条在室温保存6个月,其特异性及灵敏度无明显变化。对临床采集的324份血清样品进行检测,结果与ELISA试剂盒总符合率为98.77%。表明本研究建立的PCV2抗体免疫层析检测方法具有特异、敏感、稳定、操作简单快捷等特点,适合于PCV2抗体的现场检测。     

检测猪瘟病毒野毒株胶体金免疫层析方法的建立

为建立快速、简便检测猪瘟病毒(CSFV)野毒的胶体金免疫层析方法(GICA),本研究采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记纯化的抗CSFVE2蛋白的单克隆抗体(MAb)6E10作为捕捉抗体,将纯化的抗CSFVE2蛋白的MAbHQ06和兔抗鼠IgG抗体包被在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线,优化反应条件,组装成胶体金免疫层析试纸条。结果表明,所制备的试纸条用于检测CSFV野毒感染的PK-15细胞培养物,在检测线和质控线处均呈现红色条带,健康PK-15细胞培养物对照仅在质控线呈现红色条带;试纸条检出病毒培养物的最低限为103.5 TCID50;用不同批次的试纸条重复检测,结果无差异;该试纸条不与猪瘟兔化弱毒(HCLV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PRV)、伪狂犬病病毒(PrV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)反应。所制备的试纸条具有良好的特异性、敏感性和重复性,初步达到了区分检测CSFV野毒株和弱毒株的目的。     

猪伪狂犬病病毒gE抗体胶体金免疫层析检测方法的建立及应用

以纯化的抗人红细胞单链抗体(ScFv)-猪伪狂犬病病毒(PRV)gE蛋白双功能融合蛋白为诊断抗原和胶体金标记物,以羊抗猪IgG包被硝酸纤维膜作为质控带,制作检测猪伪狂犬病毒gE抗体的双抗原胶体金试纸条。利用方阵滴定试验筛选出金标抗原最佳工作浓度为17.6μg,检测线诊断抗原最佳标记量为1.76μg,血清最佳稀释度为1∶10,作用时间15 min,与猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪布鲁菌(Brucella)阳性血清和PRVgE缺失疫苗接种的猪免疫血清检测线均不出现红色条带,与PRV标准阳性血清反应检测线出现红色条带。试纸条操作简单,肉眼于15 min内可判定结果;试纸条在室温保存6个月,其特异性和敏感性没有明显变化;与美国IDEXX和法国LSI gE-ELISA抗体检测诊断试剂盒检测结果比较,1 164份猪血清的符合率均为90.55%。制备的胶体金试纸条具有操作简便、敏感性和特异性较高的特点,可用于PRV野毒感染的快速筛查。     

猪伪狂犬病毒gB抗原侧向层析快速检测试纸条的研制

为建立一种简便、快速、特异的猪伪狂犬病毒(PRV)gB抗原检测方法,利用单克隆抗体技术和侧向层析(LFA)技术,采用柠檬酸三钠还原法,制备颗粒大小为31.5 nm胶体金,再用胶体金标记纯化的抗PRV gB单克隆抗体10D4,在硝酸纤维素膜的质控带和检测带处,分别包被羊抗鼠IgG二抗和单克隆抗体6E9,组装成LFA方法通用胶体金层析试纸条。经测试,该试纸条最低能检测出1:640倍稀释的,TCID_(50)为1×10~(8.6)/0.1 mL的灭活PRV抗原,并与古典猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)均无交叉反应,特异性良好;室温干燥密闭的条件下,该试纸条至少可保存10个月。结果表明,本研究建立的试纸条方法操作简单、快速、敏感、特异,易于判定,适合基层PRV的大面积普查和现场检测。     

犬病毒病免疫诊断技术研究进展

一、免疫胶体金技术(一)基本原理免疫胶体金技术的检测原理是以硝酸纤维膜为载体,包被已知抗原或抗体,加入待检样品后,样品中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合,再通过胶体金标记物与之反应形成红色的可见结果,从而达到检测目的。目前,该项技术已在医学上得到广泛的应用,大多数人的传染病都已经研制成免疫胶体金检测方法。在兽医诊断领域也已开始使用,如犬细小病毒、犬瘟热病毒临床快速诊断均已开始使用免疫胶体金快速诊断试纸条。(二)临床应用1、在我国兽医领域的应用胶体金试纸条作为诊断试剂应用于兽医临床,由于它快速、准确,具有…     

鸽Ⅰ型副粘病毒免疫胶体金诊断试剂条的灵敏性和特异性试验

为建立一种快速、简便的检测鸽Ⅰ型副粘病毒(PPMV-1)的胶体金免疫层析方法,采用柠檬酸钠还原法制备胶体颗粒,胶体金用抗PPMV-1 F蛋白单克隆抗体标记并纯化,包被在玻璃纤维膜上,另外将纯化抗PPMV-1 F蛋白单克隆抗体和羊抗鼠的二抗包被在NC膜上作为检测线和质控线,组装成PPMV-1快速检测条。通过对鸡新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡减蛋综合征、鸡马立克、猪瘟、猪传染性胃肠炎、羊痘、大肠杆菌、沙门氏菌等几种样品用试纸条进行灵敏性和特异性检测,结果表明,试剂条只能与新城疫发生交叉反应,而与上述其他样品不发生交叉反应,该试纸条的特异性强,灵敏性高。     

半定量检测新城疫抗体胶体金试纸条的研制

为建立半定量快速检测新城疫抗体方法，本研究利用柠檬酸钠还原氯金酸，形成胶体金颗粒，应用直径20nm的胶体金颗粒标记新城疫抗原，制作了半定量快速测定新城疫抗体的免疫胶体金试纸条。用试纸条检测60份样品，检测结果与血凝抑制试验（HI）法测得结果的符合率为93．8％，最小检测HI滴度为410g2，与其他病毒的阳性血清没有交叉反应，且室温下有效保存期为3个月。试纸条应用方便、快速，适合临床推广以及流行病学调查。     

快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金免疫层析方法的建立

为建立一种快速、简便、灵敏的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的胶体金免疫层析方法(GICA),本研究采用柠檬酸三钠还原法制备了胶体金颗粒,标记抗PRRSVN蛋白的单克隆抗体(MAb) 2D7制备免疫检测探针,将抗PRRSVN蛋白的MAb 1G7和羊抗鼠IgG抗体印迹在硝酸纤维素膜上,分别作为检测线和质控线,经条件优化,组装成胶体金免疫层析试纸条.本研究制备的PRRSV胶体金试纸条的最低检测限度为103.0 TCID50/mL;在特异性试验中,试纸条检测PRRSV呈阳性,其它主要猪病病原均为阴性;不同批次试纸条重复检测,结果无差异;对现地猪场送检的150份病料进行PRRSV病原检测,与RT-PCR相比较,试纸条的特异性和敏感性分别为98.13％和88.37％.两种方法的一致性Kappa值为0.882.建立的PRRSV抗原胶体金免疫层析检测方法具有良好的的敏感性、特异性、重复性及现地应用性.该试纸条的研制为PRRS的快速诊断及免疫预防提供了技术手段.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒胶体金检测试纸卡的研制

为快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒,应用抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体PRRSV-3D10株和4H11株分别作为胶体金标记物和诊断抗体,羊抗鼠IgG作为质控线,制备胶体金免疫层析抗原检测试纸。该试纸卡具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,与PCR方法对比总符合率为93．3％。研究显示,本试纸卡能够快速、准确检测猪繁殖与呼吸综合征病毒,可为临床诊断提供参考。     

犬细小病毒胶体金检测试纸条的制备与初步评价

为快速检测及诊断犬细小病毒及其引起的传染性疾病,应用胶体金免疫层析技术．采用柠檬酸三钠还原法制备25nm的胶体金颗粒,标记抗犬细小病毒单克隆抗体CPV—F1株后包被于玻璃纤维膜作为金标垫,在硝酸纤维素膜上分别包被羊抗小鼠IgG二抗和抗犬细小病毒单克隆抗体CPV—B6株作为质控线和检测线,将吸水垫、硝酸纤维素膜、金标垫和样品垫分别粘贴于背衬板上制成犬细小病毒抗原胶体金检测试纸条。特异性试验及与血凝试验的对比结果表明,该试纸条具有良好的特异性和敏感性,与进口产品的总符合率为98％。本研究为进一步研发犬细小病毒检测试纸奠定了基础。     

犬狂犬病毒抗体胶体金检测试纸卡的研制

为快速检测犬狂犬病毒IgG抗体,应用狂犬病毒G蛋白作为捕获抗原,鼠抗狂犬病毒G蛋白单克隆抗体和羊抗犬IgG分别作为胶体金标记物和诊断抗体,羊抗鼠IgG作为质控线,制备胶体金免疫层析抗体检测试纸。该试纸卡具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性,与快速荧光灶抑制实验检测值对比总符合率为82.1%。研究显示,本试纸卡能够快速、准确检测犬狂犬病毒IgG抗体,可为临床诊断和宠物犬狂犬疫苗免疫效果的评价提供参考。     

牛副结核胶体金免疫层析试纸条的研制

将提纯的牛副结核分支杆菌重组蛋白MAP0862-2154c作为硝酸纤维素膜检测线的包被抗原,兔抗羊IgG作为硝酸纤维素膜质控线的包被抗体,金标羊抗牛IgG点喷到玻璃纤维素膜上,制成用于检测牛副结核抗体胶体金免疫层析试纸条。用牛的副结核标准阳性血清与检测试纸条反应,在检测线处出现红色反应带,而滴加阴性血清的试纸条检测线处未出现反应条带,上述2种血清在质控线处均出现红色反应条带;试纸条可检出牛副结核抗体的最低抗原包被浓度为400μg/mL;试纸条不与牛结核病、牛布鲁氏菌病的阳性血清发生反应;试纸条37℃保存9d后的检验结果与4℃保存的检验结果相同。所制备的试纸条具有灵敏、特异的优点,稳定性良好;10min左右即出结果,操作简便,可用于临床诊断。     

犬瘟热病毒单克隆抗体的研制及胶体金试纸条检测方法的建立

本研究利用原核表达、纯化的犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)N 蛋白免疫BALB/C小鼠,成功筛选到两株分泌CDV N 蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为D3、D6。2株杂交瘤细胞分泌单克隆抗体敏感性、特异性良好,能识别不同来源的犬瘟热病毒株,单抗亚类均为IgG1。以D3作为金标抗体,D6作为检测抗体,兔抗鼠IgG作为质控线抗体,制备犬瘟热病毒胶体金检测试纸条,检测犬瘟热病毒敏感性为1000TCID50,能有效检测区分犬瘟热病毒、犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)、犬腺病毒2型(Canine adenovirus type 2,CAV2)、狂犬病病毒(Rabies virus,RV)。综上,本研究建立的胶体金试纸条检测方法,灵敏度高、特异性强,适用于犬瘟热病毒临床快速诊断。     

牛结核病抗体胶体金快速检测技术的建立和应用

为了建立一种快速检测牛分支杆菌抗体的新方法用于诊断牛结核病,利用胶体金免疫层析技术原理,用原核诱导表达的牛分支杆菌抗原蛋白MPB83和MPB70分别作为胶体金标记抗原和检测线上的捕获抗原,制备牛结核抗体检测试纸条.结果表明,粒径为40 nm的胶体金制备的试纸条敏感性最高,胶体金最佳标记pH为6.0,MPB83抗原最适标记量为每毫升胶体金6.5 μg,MPB70抗原的最适包被浓度为3.0 mg/mL,抗MPB83蛋白IgG的最佳包被浓度为2.5 mg/mL,交叉试验证明试纸条不与牛的其他非相关疾病的阳性血清反应,具有较高的特异性.比较试验证明其敏感性显著高于韩国进口试纸条.在上述试验条件下生产了一批胶体金试纸条进行临床样品检测,并与细菌分离培养、结核菌素皮内变态反应(TST)和韩国试纸条比较.本试纸条与牛分支杆菌分离培养的符合率为85%,与TST的符合率为79.73%,与韩国试纸条的符合率为98.75%.快速检测牛结核抗体的免疫层析试纸条具有敏感、特异、简便、快速的特点,适用于对牛结核病进行普查和检疫,也可作为TST的辅助诊断方法,在牛结核病根除计划中具有良好的应用前景.     

猪δ冠状病毒胶体金试纸条检测方法的建立

为建立一种方便、快捷、实用的检测猪δ 冠状病毒(PDCoV)方法,本研究利用原核表达猪δ 冠状病毒N 蛋白,以纯化的N 蛋白免疫BALB/C小鼠,利用杂交瘤细胞技术研制2株分泌PDCoV N 蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为E8、A10。2株杂交瘤细胞分泌单克隆抗体敏感性及特异性良好,E8亚类为IgG2a,A10亚类为IgG1。以E8作为金标抗体,A10作为检测抗体,兔抗鼠作为质控线抗体,制备猪δ 冠状病毒胶体金检测试纸条,检测猪δ 冠状病毒敏感性为100TCID50,检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪δ 冠状病毒阴性对照均为阴性。本研究建立的胶体金试纸条检测方法敏感性及特异性良好。该检测方法的建立,为猪δ 冠状病毒(PDCoV)流行病学调查提供一种方法,同时为规模化养殖集团及基层兽医组织提供一种检测猪δ 冠状病毒产品。