动物体细胞克隆技术的研究进展

体细胞克隆绵羊“多莉”（Dolly）的诞生，表明成年哺乳动物体细胞具有基因组的全能性。本文从“多莉”诞生的背景、体细胞克隆技术的研究现状、体细胞核移植过程中的核质互作、该技术目前存在的问题及其在制作转基因动物上的应用等方面，概述了体细胞克隆技术的研究进展。     

动物克隆技术

动物克隆技术,即动物核移植技术,是通过显微操作,电融合等实验手段,将发育到一定阶段的核供体(胚胎细胞或体细胞)的细胞核取出,注入相应发育阶段的去核的原核胚或成熟卵母细胞中,再将重构胚的胚胎移植,到相应生理状态的动物体内,达到大量生产遗传同质动物的一种生物工程技术。1动物克隆技术的应用克隆技术对畜牧业的发展将产生重大影响。利用动物克隆技术,可缩短育种年限。据报道,自1987年牛胚胎细胞移植成功,牛克隆胚胎的重复克隆已达6个世代,并获得第三代克隆牛,由一枚胚胎反复克隆已得到近200枚克隆胚胎,母牛繁殖后代数可以呈几何基数增…     

哺乳动物体细胞克隆研究进展

哺乳动物体细胞克隆技术是近年来才发展起来的技术，但体细胞克隆绵羊－多利的诞生却引起了世界轰动，充分显示了其重在的科学研究价值和潜在的应用价值。本文对哺乳动物体细胞克隆技术研究现状，理论基础研究，应用等方面作一综述。     

基因打靶克隆山羊制备中影响受体妊娠的若干因素

在基因打靶克隆山羊制备过程中，重构胚的制备须经去核、移核、融合、激活、体内培养，发育成桑椹或囊胚回收等过程，重构胚移人受体后是决定最终能否产生克隆后代和提高生产效率的关键步骤。而在非牧区开展山羊基因打靶克隆羊的研制工作中受到场所、环境、羊群体等因素的限制，不可能在质量和数量上得到任意选用的保证。基因打靶体细胞作供核产生的重构胚是十分珍贵的，在移植时如何保证每天     

供体细胞的不同处理方法对牛核移植重构胚发育能力的影响

为了研究供体细胞不同的处理方法对核移植重构胚的作用，比较了用于保种的冻存和新鲜的成纤维细胞做供体细胞、供体细胞不同的离心转数、供体细胞不同的血清饥饿时间及用本实验室冻存的成纤维细胞，解冻复苏后，不同传代次数对重构胚的影响。结果表明分别用冷冻保存的和新鲜的成纤维细胞作为核供体，所得重构胚卵裂率、囊胚率无显著差（P>0.05）；供体细胞离心800 r/min时所得重构胚效果较好，离心1500 r/min所得重构胚的卵裂率、囊胚率与其他3组相比较低；血清饥饿3～5 d组所得重构胚比其他3组好；用解冻复苏后再传2、5代的细胞进行核移植，所得重构胚的卵裂率、囊胚率无明显差异(P>0.05)，显著高于传8代的细胞所得重构胚。说明供体细胞的不同处理方法对核移植重构胚发育有很重要的影响。     

鲁西黄牛体细胞克隆保种技术的研究

以体外培养的鲁西黄牛耳皮肤成纤维细胞作核供体，研究利用体细胞克隆技术保存我国地方黄牛优良品种的技术方法。通过组织块培养法建立的鲁西黄牛（1♂，4♀）成纤维细胞系，作为核移植供体细胞，利用屠宰场母牛卵巢卵母细胞经体外培养成熟后作为核受体进行核移植，试验结果表明：重构胚的融合率为62．5％（242／387），分裂率为63．6％（154／242），体外培养第7天囊胚发育率为42．9％（66／154）。体外培养第7天的囊胚的内细胞团细胞（ICM）与滋养层细胞数平均为37和47，ICM占44．2％。体外发育到7d的囊胚新鲜胚胎的移植妊娠率（新鲜胚胎）移植受体10头，60d妊娠率为20％（2／10）。     

哺乳动物克隆技术及其研究进展

综述了哺乳动物克隆技术的现状和发展趋势。介绍了哺乳动物胚胎细胞克隆、体细胞克隆技术和转基因动物克隆技术的研究进展以及我国哺乳动物克隆技术发展情况。     

哺乳动物体细胞克隆的研究进展

随着克隆技术的发展,哺乳动物体细胞克隆在生物学、医学等领域有着越来越重要的价值,近年来,克隆技术不断完善,克隆方法不断优化,取得了很多重要的成果,但在成功率等方面仍存在许多难以攻破的问题。作者重点阐述了胞质内全细胞直接注射法这一技术在哺乳动物体细胞克隆上的应用情况,旨在阐明国内外哺乳动物体细胞克隆的研究现状,为进一步提高克隆成功率提供参考。     

马体细胞克隆技术研究进展

哺乳动物体细胞克隆技术是近年来发展起来的高新技术，体细胞克隆绵羊——多利的诞生已引起了世界的轰动，笔者就关于马的体细胞克隆技术、重组卵母细胞的体外构建、激活、培养和应用前景等作一综述。     

动物体细胞克隆技术的研究进展

体细胞克隆绵羊“多莉”(Dolly)的诞生,表明成年哺乳动物体细胞具有基因组的全能性。本文从“多莉”诞生的背景、体细胞克隆技术的研究现状、体细胞核移植过程中的核质互作、该技术目前存在的问题及其在制作转基因动物上的应用等方面,概述了体细胞克隆技术的研究进展。     

体细胞克隆猪的研究进展

哺乳动物克隆不仅可以保护濒危动物，而且与干细胞工程技术相结合能应用于克隆性治疗，是目前生物技术领域研究的热点之一，具有重大的科学意义和应用价值。由于体细胞克隆猪在人类器官移植方面具有巨大的应用潜力，已成为当今体细胞克隆研究的热点。从2000年开始，在不同国家相继诞生了体细胞克隆猪及转基因猪，但是其成功效率很低（1％～2％）。主要综述了影响体细胞克隆猪的几个因素，涉及胞质受体、供核细胞、显微操作、激活以及重组胚移植。     

不同电融合条件对莎能奶山羊转基因(GFP)核移植胚胎发育的影响

以莎能奶山羊（Saanen dairy goat）转基因（GFP）成纤维细胞为核供体细胞，以普通山羊卵母细胞为受体细胞进行了核移植，试验中对转基因核移植胚胎的电融合条件进行了优化，发现对于莎能奶山羊转基因（GFP）重构胚胎的处理，电融合时方案B（1．5kV／cm、3μs／次、间隔1s）电融合参数最适合用于莎能奶羊的转基因（GFP）核移植胚胎，其重构卵电融合率为89．4％，重构胚分裂率为68．0%。     

影响动物克隆效率因素的研究进展

哺乳动物克隆效率低下成为目前制约动物克隆技术发展和应用的瓶颈。文章概述了动物克隆中供体细胞的选择、卵母细胞的去核方法、重构胚的激活和重构胚的培养等因素对克隆效率的影响以及提高克隆效率的策略，并对近年来影响动物克隆效率的因素作了详尽的论述，以期为该领域的科研工作者提供参考。     

转GFP基因核移植牛胚胎的研究

试验采用脂质体转染法与电穿孔法,以携带绿色荧光蛋白（GFP）-新霉抗性（neo-）双标记基因的pMSCV质粒转染胎牛耳成纤维细胞为供体与体外成熟的牛卵母细胞为受体构建克隆胚。研究了体外成熟培养液中添加EGF（表皮生长因子）对转基因胚的影响,不同转染方法构建供体细胞对重构胚发育的影响和在不同体外培养系统中的发育效果。结果显示,体外成熟培养液中添加EGF 30 ng/mL组的卵母细胞成熟率最高,但对后期转基因重构胚的囊胚发育率的影响,以添加EGF 20 ng/mL组的最高;以胎牛耳成纤维细胞为供体细胞,不同转染方法转染供体细胞构建重构胚,其囊胚发育率差异不显著（P>〖JP2〗0.05）;mSOFaa+颗粒细胞单层细胞共培养体系中的转基因囊胚发育率最好,该体系更适合体细胞核移植法生产转基因牛胚胎。     

5-Aza-CdR对德保黑猪手工克隆重构胚胎体外发育效果的影响

为了探讨5-氮杂-2'-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对德保黑猪手工克隆（HMC）重构胚胎体外发育效果的影响，本研究分别从供体细胞和重构胚入手，比较了5个不同处理浓度（0、5、10、20和40 nmol/L）5-Aza-CdR处理HMC重构胚的体外发育效果，筛选最佳处理浓度；在最佳浓度下比较5个不同处理时间（0、24、48、72和96 h）对HMC重构胚的体外发育效果，筛选最佳处理时间；用4个不同浓度（0、0.25、0.5和1 μmol/L）5-Aza-CdR结合最佳浓度和最佳时间处理供体和重构胚，比较其体外发育潜能。结果显示，与空白对照组相比，5、10、20和40 nmol/L 5-Aza-CdR处理72 h对重构胚卵裂率均无显著差异（P>0.05），20 nmol/L 5-Aza-CdR处理能显著提高重构胚的囊胚率（P<0.05），10和20 nmol/L 5-Aza-CdR处理均能显著提高囊胚细胞数（P<0.05），其中以20 nmol/L 5-Aza-CdR效果最佳；与空白对照组相比，利用20 nmol/L 5-Aza-CdR处理HMC重构胚72 h能显著提高重构胚的囊胚率和囊胚细胞数（P<0.05），其余处理时间对重构胚卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数均无显著影响（P>0.05）；在囊胚的最佳处理浓度（20 nmol/L）和最佳处理时间（72 h）下，结合供体的4个处理浓度（0、0.25、0.5和1 μmol/L），同时处理重构胚和供体，各处理组HMC重构胚的发育潜能均有提高，但效果均不显著（P>0.05），其中0.25~0.5 μmol/L 5-Aza-CdR处理效果较佳。综上表明，适宜浓度（0.25~0.5 μmol/L）的DNA甲基化酶抑制剂5-Aza-CdR处理供体细胞72 h并结合20 nmol/L 5-Aza-CdR处理重构胚72 h均能有效提高德保黑猪HMC重构胚胎的体外发育潜能，该结果可为今后研究德保黑猪HMC胚胎DNA甲基化调控机制提供参考。     

猪卵母细胞去核方法的改进

对猪体细胞克隆技术中关键步骤之一的去核方法作了较深入的研究。结果表明，由本实验室改进的Willadsen去核法——二步挤压去核法，无论在去核操作成功率（73．9％）上还是在去核效率（81．2％）上都明显好于McGrath-Solter去核法（42．5％、67．4％，P〈0．05）；同时，本试验还发现，卵母细胞成熟培养36h后去核组去核效率（89．1％）显著地高于成熟培养44h后去核组（55．8％，P〈0．05），而核移植重构胚的发育率2个组间无显著差异。     

细胞周期对核移胚发育的影响

本文综述了近年细胞周期与核移胚发育能力关系的有关研究，供体细胞周期对核移胚的发育有着重要的影响。以新鲜卵母细胞为受体，采用不排出第二极体（ｐｂ２）的激活方法（如电激）时，核移胚的发育以Ｇ１供体最好，Ｓ，Ｇ２核发育能力降低；采用排出ｐｂ２的激活方法（如酒粗）时，Ｇ２核发育能力最强。激活后的卵母细胞做受体也可重排供体核，核周期对核移胚的发育可能影响不大。但尚需实践证明。     

免疫外科法制备牛供体细胞核胞体及其核移植研究

本研究利用自制的兔抗牛脾细胞免疫血清裂解供体细胞膜而获得核胞体,结果表明,自制的免疫血清可以成功的裂解供体细胞膜而获得核胞体。将该法制备的核胞体应用于牛体细胞核移植的胞质内注射中,从而为核移植中供体细胞核胞体的获得提供一种新的思路。在比较不同供体细胞对重构胚发育的影响时。结果表明。颗粒细胞与耳成纤维细胞构建的重构胚卵裂率没有显著差异（62．62％versus67．89％,P〉0．05）,囊胚率也没有明显的差异（23．88％ versus 18．92％,P〉0．05）：在4℃低温冷藏一定时间的供体细胞与未经冷藏的供体细胞,其卵裂率和囊胚率都没有显著性差异（63．34％versus62．03％;26．67％versus24．45％,P〉0．05）;同样,耳成纤维细胞也得到相同的结果（70．76％verSus66．67％：21．74％versus19．56％,P〉0．05）。颗粒细胞构建的重构胚在注核后3～5h进行激活较1～3h有更高的卵裂率．表现出显著性差异（73．91％versus56．52％,P〈0．05）,裳胚率无显著性差异（23．53％,versus15．38％,P〉0．05）。     

基因打靶用于哺乳动物体细胞核移植技术研究进展

哺乳动物体细胞核移植技术以其供核效率高而在动物克隆技术中占有明显的优势；基因打靶技术通过外源DNA与染色体DNA间的重组可达到定点修饰，改造基因组的目的，它与体细胞核移植技术相结合具有巨大的技术优势和广阔的应用前景。将为畜牧生产和医学生物学的研究带来前所未有的价值。     

不同来源的山羊供核细胞对核移植重构胚发育的影响

以山羊的胚胎细胞、卵丘细胞、体细胞克隆胚胎细胞为核供体,比较了以这3种细胞为核供体得到的重构胚的体外发育能力.结果显示,以体内受精所得桑椹胚为核供体的重构胚发育能力最高,卵裂率和囊胚率分别为81.25%和25.64%以卵丘细胞为核供体的重构胚发育能力次之(79.68%,21.57%),再克隆胚胎发育能力最低(64%,12.5%),但是各组间差异不显著(P>0.05).