硅胶干燥胡杨叶片DNA提取与RAPD反应体系的建立

以塔里木河流域胡杨(Populus euphratica)硅胶干燥叶片为材料,采用改进CTAB法提取胡杨基因组DNA,得到满足RAPD(Random amplif ied polymorphic DNA),随机扩增多态性DNA分析的胡杨基因组DNA。通过单因素优化试验,得到胡杨RAPD分析的最佳反应体系为:40 ng模板DNA,0.8 U rTaqDNA聚合酶,2.5 mmol/L Mg2+,0.3 mmol/L dNTPs,0.5μmol/L随机引物,1×buffer缓冲液,ddH2O补足至10μL。扩增反应程序为:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,38℃复性30 s,72℃延伸120 s,35个循环,最后72℃延伸7 min。     

番木瓜DNA提取与SRAP反应体系优化

对番木瓜基因组DNA的提取及SRAP反应体系的模板、引物、dNTP、Taq聚合酶等条件进行了优化。结果表明,在20μL反应体系中,最优反应体系为模板DNA 40 ng,引物浓度0.4μmol/L,Taq聚合酶0.4 U/20μL,dNTPs 0.2 mmol/L。番木瓜的SRAP-PCR程序为94℃预变性4分钟;94℃变性1分钟,35℃复性1分钟,72℃延伸1.5分钟,5个循环;94℃变性1分钟,52℃复性1分钟,72℃延伸1.5分钟,35个循环;最后72℃延伸10分钟,4℃保存。     

羽衣甘蓝SRAP体系建立与优化

以羽衣甘蓝基因组DNA为模板,对相关序列扩增多态性聚合酶链式反应(SRAPPCR)体系的各影响因子进行了单因素梯度设置,并优化了反应程序,筛选和建立了可扩增多态性高、重复性好、带型清晰的最佳SRAP反应体系和程序。结果表明:羽衣甘蓝最佳SRAP-PCR反应体系总体积10μL,包含DNA模板50ng,1×buffer,dNTPs 0.20mmol/L,Taq酶1U,引物各0.60μmol/L。羽衣甘蓝最佳SRAP-PCR反应程序为94℃预变性5min,94℃变性30s,35℃退火30s,72℃延伸30s,5个循环;94℃变性30s,50℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;72℃终延伸7min,4℃保存。经22个羽衣甘蓝F2群体单株对上述优化的反应体系和程序进行验证,均获得了多态性丰富、条带清晰的扩增图谱,表明该程序和体系能很好地满足羽衣甘蓝基因组SRAP扩增要求。     

正交设计对‘红阳’猕猴桃ISSR反应体系的优化研究

以‘红阳’猕猴桃及其杂交F1代为试材,通过正交设计对ISSR-PCR扩增反应的影响因子进行优化,初步确立了适合‘红阳’猕猴桃ISSR-PCR反应体系:总体积20μL,10×PCR buffer2.0μL,Mg2+0.75 mmol/L,Taq酶1.5 U,模板DNA 60 ng,引物1.25μmol/L,dNTPs 0.15mmol/L。扩增程序:94℃预变性7 min,94℃变性30 s,50~58℃退火45 s,72℃延伸2 min,45个循环,72℃延伸7 min。引物UBC841的最佳退火温度为58.5℃。应用该优化反应体系,用UBC835对35份杂交F1代DNA进行ISSR-PCR扩增,结果显示优化后的反应体系具有较高的稳定性。     

芍药属SRAP反应体系优化与亲缘关系分析

以牡丹芍药杂交种‘东方金’和牡丹品种‘灰鹤’为试材,对SRAP-PCR反应体系和反应程序进行了优化,并利用优化的体系对芍药属65个品种进行了亲缘关系分析,以期建立稳定的芍药属植物SRAP分子标记技术体系。结果表明:芍药属植物的SRAP-PCR最佳程序为94℃预变性3 min;94℃变性30 s,37℃退火30 s,72℃延伸90 s,退火温度每个循环增加1℃,8个循环;94℃变性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸90 s,32个循环;最后72℃延伸7 min。20μL反应体系中各成分的最佳浓度依次为Mg~(2+) 2.5 mmol·L~(-1),dNTPs 0.2 mmol·L~(-1),Taq酶1 U、引物浓度0.3μmol·L~(-1)。16对引物对65份材料进行PCR扩增共扩增出了1 229个条带,均为多态性条带,多态性高达100%,芍药和杂种聚为一类,牡丹聚为一类,说明杂种与芍药亲缘关系更近。该研究建立的芍药属SRAP-PCR体系重复性好、稳定性强,适合芍药属植物SRAP的研究,为进一步研究芍药属植物种质资源遗传多样性、品种鉴定、分子标记辅助育种等方面奠定基础。     

中国樱桃S-RNase基因PCR扩增技术体系的建立

通过对TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTP、通用引物、模板DNA浓度等反应参数的系统研究,建立了中国樱桃S-RNase基因特异PCR扩增体系。该体系反应的总体积25μL,其中Taq酶1.25U,MgCl22.5mmol/L,dNTP0.15mmol/L,通用引物0.25μmol/L,模板DNA 50 ng。反应程序为:94℃预变性3 min;33个循环的94℃变性1 min,56℃退火45 s,72℃延伸1.5 min;最后72℃延伸10 min。利用优化的扩增体系在中国樱桃的不同品种中获得有效扩增,进一步证明了该体系具有良好的稳定性和重复性。     

野蔷薇的DNA提取和RAPD反应体系的建立

以野蔷薇(Rosa multiflora)的冬末初春芽和夏初叶片为材料,研究了DNA的提取方法,并对影响随机扩增多态DNA(RAPD)的反应因素进行了优化.建立了适合野蔷薇RAPD的反应体系和反应程序,在20μL反应体系中,25ng模板DNA,2.0mmol/LMgCl2,0.2mmol/LdNTPs,1UTaqDNA聚合酶,0.1μmol/L引物.扩增程序为:94℃预变性4min,然后94℃变性45s,37℃退火1min,72℃延伸1min,37个循环,最后72℃延伸5min,4℃保存.     

辣椒SSR反应体系的优化

本试验研究了辣椒SSR-PCR反应体系的主要成分对扩增结果的影响,同时进行了退火温度梯度和循环次数试验。优化后的反应体系为:总体积20μL,1.5μL模板DNA(25ng/μL)、1U Taq酶、0.375μmol.L-1引物、1.875mmol.L-1Mg2 、0.2mmol.L-1dNTPs、1XPCR buffer。扩增程序为:94℃预变性4min,94℃变性45s,58℃(以SSR005为例)退火45s,72℃延伸90s,35个循环,最后一个循环延伸增加为8min,4℃保存至电泳。     

枇杷AS-PCR反应体系的建立和优化

【目的】建立和优化枇杷AS-PCR反应体系,为开展枇杷S基因快速鉴定奠定基础。【方法】以‘大五星’、‘早钟6号’和‘龙泉5号’为试材,通过正交实验设计对影响枇杷AS-PCR反应较大的Mg2+等5个因素的浓度进行筛选,并对扩增反应程序进行优化,运用正交设计直观分析法和DPS 7.05统计软件对扩增结果进行方差分析。【结果】优化后的枇杷AS-PCR反应分析体系为:25μL反应体系中,含10×buffer2.5μL,Mg2+浓度2.0 mmol·L-1,Taq酶1.5 U,引物0.5μmol·L-1,模板DNA80ng,dNTPs0.4 mmol·L-1。反应程序为94℃预变性1 min;94℃变性30 s,退火温度30 s,72℃延伸1 min,35次循环;72℃延伸5 min,4℃保存。【结论】建立了基于S基因保守序列设计引物的枇杷AS-PCR反应体系,利用该体系成功确定了‘大五星’的S基因型为S2-S41,其中S41为新分离鉴定的枇杷S-RNase基因,它们在GenBank上的登录号分别为JQ228451和JX217035。     

栓皮栎ISSR反应体系的建立

以栓皮栎叶片为试材,采用单因素试验设计对栓皮栎ISSR反应条件进行系统优化,建立了栓皮栎ISSR的最佳反应体系和扩增程序。结果表明:PCR反应体系总体积为25μL,其中10×Buffer 2.5μL,30ng模板DNA,1.5UTaq聚合酶,2.5mmol/L Mg2+,0.6μmol/L引物,0.3mmol/L dNTPs;扩增程序:94℃预变性1min;94℃变性30s,51.5~59.0℃退火60s,72℃延伸2min,35个循环;最后72℃延伸5min。在此条件下从100条ISSR引物中筛选出12条多态性好、稳定性高的引物对陕西省天然群体共22个栓皮栎个体的DNA进行扩增,共得到166个位点,其中142个为多态位点,多态位点百分率为85.54%,Nei指数为0.2928,Shannon信息指数为0.4381,表明栓皮栎的遗传多样性处于较高水平。     

西瓜ISSR-PCR体系的正交优化研究

采用正交试验设计的方法,建立了西瓜ISSR分析的优化反应体系,即20μL反应体系中含有1×buffer,dNTP200μmol/L、Primer1.0μmol/L、MgCl21.5mmol/L、Taq酶1U和模板DNA40ng。适宜的扩增程序为94℃5min,94℃30s,53℃45s,72℃90s,35个循环;72℃5min,4℃保存。     

山楂ISSR分析体系的建立和优化

为在DNA分子水平上对山楂种质资源进行分析奠定基础,对退火温度、循环次数、DNA模板质量、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶的种类和浓度等影响ISSR反应的因素进行研究,建立并优化了山楂的ISSR分析体系。优化的山楂ISSR分析体系为:采用改进的CTAB法或QIAGEN试剂盒法提取总DNA;PCR反应体积为20μL,内含1×PCR反应缓冲液(Promega公司),3.0mmol/L MgCl2,0.2mmol/L dNTP,0.3μmol/L引物,0.5U Taq DNA聚合酶(天根公司),50ng总DNA;扩增程序为94℃ 3min;94℃ 30s,退火温度1min,72℃ 2min,38个循环,72℃ 7min。筛选出了10个适宜山楂遗传分析的ISSR引物。     

景天基于WRKY转录因子分子标记体系的初步建立

用CTAB法提取三七景天基因组DNA,根据已报道的辣椒WRKY的转录因子保守区域设计引物,对影响PCR扩增反应的主要因素进行初步研究,建立景天基于转录因子的分子标记技术体系。在20μl的反应体系中,dNTPs0.4mmol/L,DNA模板30ng。扩增程序为:94℃预变4min,反应前7个循环在94℃30s、60℃30s、72℃1min条件下进行,随后5个循环在94℃30s、60℃30s、72℃45s条件下进行,随后13个循环在94℃30s、48℃30s、72℃1min、94℃30s、40℃30s、72℃1min条件下进行,最后72℃延伸10min。     

桦褐孔菌ISSR-PCR反应体系优化与建立

采用改良CTAB法提取了桦褐孔菌总DNA,确定ISSR最适25 μL反应体系为模板DNA浓度15 ng·μL-1,dNTPs 浓度150 μmol· L-1,引物浓度25 μmol·L-1,Taq DNA聚合酶浓度2.0 U,Mg2+浓度1.4 mmol· L-1,10×buffer 2.5 μL,其余用ddH2O补足;确定ISSR扩增程序为:94℃预变性5 min,35个循环:94℃变性1 min、45℃～51℃退火1 min(退火温度因不同引物而定)、72℃延伸1 min,最后72℃延伸5 min,4℃保存.筛选出16条ISSR引物,并成功应用引物UBC842完成了21株桦褐孔菌的ISSR-PCR反应.     

枣树RAPD分析条件的优化研究

试验通过系统的比较研究,建立了枣树RAPD分析的优化反应条件,即25μL反应体系中含有100mmol/LKCl、8mmol/L(NH4)2SO4、10mmol/LTris—HCl(pH9.0)、Np—40、2.0mmol/LMgCl2、160μmol/LdNTP、15ng引物、30ng模板DNA和1.5UTaqDNA聚合酶。适宜的扩增程序为94℃4min,1个循环;94℃30s、36℃40s、72℃1min,50个循环;72℃8min,1个循环。与不同试验室间获得的RAPD分析最佳反应条件进行比较表明,枣树RAPD分析的最佳反应条件在不同实验室间有很强的一致性,只需对dNTP、引物和TaqDNA聚合酶的用量进行小幅度调整。     

枇杷属植物ISSR反应体系的建立和优化

首次通过正交实验,对影响枇杷属植物ISSR反应较大的Mg2+、Taq酶、dNTPs、引物、模板DNA浓度进行筛选,并对扩增反应程序进行优化。优化后的反应体系为:25μL反应体系中,含10×buffer2.5μL,Mg2+浓度2.0mmol·L-1,Taq酶1.5U,引物0.3μmol·L-1,模板DNA60ng,dNTPs0.15mmol·L-1。反应程序为94℃预变性5mim;94℃变性1mim,退火温度70s,72℃延伸1.5mim,40次循环;72℃延伸7mim,4℃保存。     

葡萄目标起始密码子多态性反应体系的优化

SCoT标记是一种新型目的基因分子标记方法,采用L16(45)正交试验和单因素试验2种方法优化了葡萄SCoT-PCR反应体系,结果表明正交试验中关键影响因子为dNTPs浓度,单因素试验中为dNTPs和Mg2+浓度.综合2种方法,优化的葡萄SCoT-PCR反应体系为:Mg2+2.0 mmol·L-1、dNTPs 0.3 ...     

锦带花ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以锦带花幼叶为试材,提取锦带花基因组的DNA,并对其纯度、浓度进行检测,建立适合锦带花的ISSR-RCR反应体系.结果表明:DNA扩增效果良好,完全能满足进一步试验的需要.同时对锦带花ISSR-PCR反应体系中各个影响因素进行优化,建立了适合锦带花ISSR分子标记的最佳反应体系,即在20μL的反应体系中,含稀释浓度为3倍的DNA模板,0.20 mmol/LdNTP,稀释10倍体积高保真PCR缓冲液含(Mg2+)3.0 μL;1.00 μmol/L引物,1.25 U Taq酶.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,52.0℃退火45 s,72℃延伸1.50 min,45个循环;最后72℃延伸5 min,4℃保存.应用该ISSR体系对3份锦带花种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性.