芍药属SRAP反应体系优化与亲缘关系分析

以牡丹芍药杂交种‘东方金’和牡丹品种‘灰鹤’为试材,对SRAP-PCR反应体系和反应程序进行了优化,并利用优化的体系对芍药属65个品种进行了亲缘关系分析,以期建立稳定的芍药属植物SRAP分子标记技术体系。结果表明:芍药属植物的SRAP-PCR最佳程序为94℃预变性3 min;94℃变性30 s,37℃退火30 s,72℃延伸90 s,退火温度每个循环增加1℃,8个循环;94℃变性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸90 s,32个循环;最后72℃延伸7 min。20μL反应体系中各成分的最佳浓度依次为Mg~(2+) 2.5 mmol·L~(-1),dNTPs 0.2 mmol·L~(-1),Taq酶1 U、引物浓度0.3μmol·L~(-1)。16对引物对65份材料进行PCR扩增共扩增出了1 229个条带,均为多态性条带,多态性高达100%,芍药和杂种聚为一类,牡丹聚为一类,说明杂种与芍药亲缘关系更近。该研究建立的芍药属SRAP-PCR体系重复性好、稳定性强,适合芍药属植物SRAP的研究,为进一步研究芍药属植物种质资源遗传多样性、品种鉴定、分子标记辅助育种等方面奠定基础。     

番木瓜DNA提取与SRAP反应体系优化

对番木瓜基因组DNA的提取及SRAP反应体系的模板、引物、dNTP、Taq聚合酶等条件进行了优化。结果表明,在20μL反应体系中,最优反应体系为模板DNA 40 ng,引物浓度0.4μmol/L,Taq聚合酶0.4 U/20μL,dNTPs 0.2 mmol/L。番木瓜的SRAP-PCR程序为94℃预变性4分钟;94℃变性1分钟,35℃复性1分钟,72℃延伸1.5分钟,5个循环;94℃变性1分钟,52℃复性1分钟,72℃延伸1.5分钟,35个循环;最后72℃延伸10分钟,4℃保存。     

硅胶干燥胡杨叶片DNA提取与RAPD反应体系的建立

以塔里木河流域胡杨(Populus euphratica)硅胶干燥叶片为材料,采用改进CTAB法提取胡杨基因组DNA,得到满足RAPD(Random amplif ied polymorphic DNA),随机扩增多态性DNA分析的胡杨基因组DNA。通过单因素优化试验,得到胡杨RAPD分析的最佳反应体系为:40 ng模板DNA,0.8 U rTaqDNA聚合酶,2.5 mmol/L Mg2+,0.3 mmol/L dNTPs,0.5μmol/L随机引物,1×buffer缓冲液,ddH2O补足至10μL。扩增反应程序为:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,38℃复性30 s,72℃延伸120 s,35个循环,最后72℃延伸7 min。     

菊花SSR-PCR反应体系的建立和优化

为快速确定菊花SSR反应体系,利用正交实验设计L16(45)对菊花基因组SSR-PCR反应体系的5个因素(模板DNA、Mg2+、dNTP、引物和Taq酶)在4个水平上进行正交设计,筛选出适合菊花的最佳SSR-PCR反应体系,进一步利用单因素完全随机试验筛选各反应因素的最佳水平。结果表明:建立菊花基因组DNA SSR-PCR反应体系为25μL:60ng模板DNA、2.0mmol/L Mg2+、0.1mmol/L dNTP、0.3μmol/L引物、1UTaq酶。并对菊花引物进行梯度退火试验,其最佳退火温度在53.1℃;扩增程序是:95℃预变性5min;32个循环的94℃变性50s、53.1℃退火50s、72℃延伸50s;72℃延伸8min,4℃保存。该体系的建立为今后菊花SSR分析奠定了基础。     

正交设计对‘红阳’猕猴桃ISSR反应体系的优化研究

以‘红阳’猕猴桃及其杂交F1代为试材,通过正交设计对ISSR-PCR扩增反应的影响因子进行优化,初步确立了适合‘红阳’猕猴桃ISSR-PCR反应体系:总体积20μL,10×PCR buffer2.0μL,Mg2+0.75 mmol/L,Taq酶1.5 U,模板DNA 60 ng,引物1.25μmol/L,dNTPs 0.15mmol/L。扩增程序:94℃预变性7 min,94℃变性30 s,50~58℃退火45 s,72℃延伸2 min,45个循环,72℃延伸7 min。引物UBC841的最佳退火温度为58.5℃。应用该优化反应体系,用UBC835对35份杂交F1代DNA进行ISSR-PCR扩增,结果显示优化后的反应体系具有较高的稳定性。     

锥栗自然居群ISSR-PCR分析技术的建立

提取野生锥栗的基因组DNA作为ISSR-PCR模板,对反应体系中的模板用量、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和TaqDNA聚合酶用量5个主要影响因素进行梯度试验,并对扩增程序中的退火温度与循环次数进行了探讨,初步确立了适合野生锥栗的ISSR-PCR分析技术体系,即25μL反应体系中,模板DNA40或50ng、Mg2+2.25mmol.L-1、dNTPs0.2mmol.L-1、引物0.2μmol.L-1、TaqDNA聚合酶1.0U;PCR扩增程序为:94℃预变性3min;然后94℃变性45s,(Tm+2～4℃)退火45s,72℃延伸2min,共32个循环;最后72℃充分延伸5min;1.5%琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。     

安徽乌菜DNA提取与InDel引物筛选

利用改良的SDS法提取了153个品种的安徽乌菜DNA,并进行2次重复,均获得了较理想的DNA产物。通过试验确定了安徽乌菜InDel-PCR的10μL最佳反应体系:1×PCR Buffer 1μL,dNTP 0.2μL,引物1μL,Taq E 0.1μL,DNA 1μL,ddH2O 6.7μL;最佳PCR扩增反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,55℃退火40 s,72℃延伸40 s,共36个循环,最后72℃延伸10 min,10℃保存。从供试的66对InDel引物中筛选出31对适合安徽乌菜、条带清晰、重复性高、多态性好的引物,为安徽乌菜品种鉴定、遗传多样性分析等奠定了基础。     

新疆野生樱桃李SSR体系的建立及应用

为建立适宜新疆野生樱桃李的SSR分子标记技术体系,通过对PCR反应程序、反应体系(DNA模板量、引物浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq酶用量)以及退火温度进行了探索,建立了适宜野生樱桃李的SSR-PCR反应体系。结果表明:在25μL反应体系中,Mg2+1.0 mmol/L、引物0.5μmol/L、dNTPs 0.20 mmol/L、TaqDNA聚合酶1.0 U、模板DNA 30 ng、退火温度为60℃。SSR扩增程序:94℃预变性5 min,35个循环(94℃30 s,60℃1 min,72℃1 min),72℃延伸10 min,可筛选出稳定性好、多态性高的SSR引物。     

栓皮栎ISSR反应体系的建立

以栓皮栎叶片为试材,采用单因素试验设计对栓皮栎ISSR反应条件进行系统优化,建立了栓皮栎ISSR的最佳反应体系和扩增程序。结果表明:PCR反应体系总体积为25μL,其中10×Buffer 2.5μL,30ng模板DNA,1.5UTaq聚合酶,2.5mmol/L Mg2+,0.6μmol/L引物,0.3mmol/L dNTPs;扩增程序:94℃预变性1min;94℃变性30s,51.5~59.0℃退火60s,72℃延伸2min,35个循环;最后72℃延伸5min。在此条件下从100条ISSR引物中筛选出12条多态性好、稳定性高的引物对陕西省天然群体共22个栓皮栎个体的DNA进行扩增,共得到166个位点,其中142个为多态位点,多态位点百分率为85.54%,Nei指数为0.2928,Shannon信息指数为0.4381,表明栓皮栎的遗传多样性处于较高水平。     

满天星基因组DNA提取及RAPD扩增条件优化

以满天星试管苗叶片为材料,进行满天星基因组DNA提取及RAPD扩增条件优化。结果表明,采用CTAB法提取的DNA质量较高,适宜于RAPD分析;RAPD扩增最佳反应体系为25μL：14．17μL ddH2O,150μmol／LdNTP,1．5μmol／L MgCL2,2．5μL Buffer,0．3μmol／L引物,10ngDNA模板,1U TaqDNA聚合酶。扩增反应程序为：94℃预变性5min,94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸1．5min;45个循环;最后72℃延伸7min。     

SRAP分析体系的优化及在枇杷种质资源研究上的应用

以me7(5’-TGAGTCCAAACCGGTCC-3’)和em7(5’-GACTGCGTACGAATTCAA-3’)正反向引物组合对西班牙枇杷品种Javierin进行了SRAP分析体系的优化,结果表明,在25μL反应体系中,5种主要成分的适宜浓度或用量分别是:dNTPs0.3mmol/L,Mg2+2.5mmol/L,TaqDNA聚合酶1.0U,引物0.3μmol/L,模板DNA20ng,优化的扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性1min,35℃复性1min,72℃延伸1min30s,5个循环;之后94℃变性1min,50℃复性1min,72℃延伸1min30s,35个循环;最后72℃下延伸10min。并将该优化的体系在来自中国、西班牙、日本、意大利和美国的46份枇杷种质资源上进行了SRAP扩增的初步应用,经琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳均获得了清晰、重复性好的SRAP指纹图谱。     

温郁金RAPD-PCR反应体系建立及条件优化

在提取纯化温郁金DNA的基础上,利用PCR扩增技术,对Mg2 、dNTP、模板DTA、引物、Taq聚合酶等反应条件进行优化,建立温郁金基因组DNA的RAPD-PCR最佳反应体系.结果表明:最佳条件是总体积为25μL,其中Mg2 (25mM)2μL,Taq 聚合酶(5 U/μL)0.3μL,引物浓度(20μM)1.0μL,模板DNA(5 ng/μL)1.0μL,dNTP(2.5 mM)2.0μL,10×PCRbuffer 2.5μL;PCR扩增程序为94℃预变性5min;94℃变性35 s,36℃退火1min,72℃复性1.5 min,共42个循环;最后72℃延伸10 min,该研究得出的体系是温郁金RAPD-PCR的最适宜反应体系,具有省时、经济、简便以及扩增条带较清晰、稳定等特点,为今后温郁金的遗传多样性研究奠定了基础.     

野蔷薇的DNA提取和RAPD反应体系的建立

以野蔷薇(Rosa multiflora)的冬末初春芽和夏初叶片为材料,研究了DNA的提取方法,并对影响随机扩增多态DNA(RAPD)的反应因素进行了优化.建立了适合野蔷薇RAPD的反应体系和反应程序,在20μL反应体系中,25ng模板DNA,2.0mmol/LMgCl2,0.2mmol/LdNTPs,1UTaqDNA聚合酶,0.1μmol/L引物.扩增程序为:94℃预变性4min,然后94℃变性45s,37℃退火1min,72℃延伸1min,37个循环,最后72℃延伸5min,4℃保存.     

快速微量提取番茄DNA及SSR-PCR反应体系的优化

以番茄叶片为试材,采用改进的CTAB法,电钻研磨,提取过程中加入醋酸铜,设计4因素3水平的正交试验对PCR反应体系进行优化,同时利用梯度PCR对退火温度进行选择选择。结果表明:优化的10μL反应体系含:1×buffer,1.2 mmol/L Mg2+,1.5 mmol/L dNTPs,1.2μmol/L引物,0.75 UTaqDNA聚合酶,10 ng模板DNA。扩增程序为:94℃预变性2 min;94℃变性30 s,49.2℃退火30 s,68℃延伸30 s,共35个循环;最后72℃延伸8 min。优化的反应体系可以用于SSR分子标记机的研究,在所有SSR引物中基本都能有效扩增;改进的CTAB法提取的DNA纯度更高。     

锦带花ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以锦带花幼叶为试材,提取锦带花基因组的DNA,并对其纯度、浓度进行检测,建立适合锦带花的ISSR-RCR反应体系.结果表明:DNA扩增效果良好,完全能满足进一步试验的需要.同时对锦带花ISSR-PCR反应体系中各个影响因素进行优化,建立了适合锦带花ISSR分子标记的最佳反应体系,即在20μL的反应体系中,含稀释浓度为3倍的DNA模板,0.20 mmol/LdNTP,稀释10倍体积高保真PCR缓冲液含(Mg2+)3.0 μL;1.00 μmol/L引物,1.25 U Taq酶.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,52.0℃退火45 s,72℃延伸1.50 min,45个循环;最后72℃延伸5 min,4℃保存.应用该ISSR体系对3份锦带花种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性.     

湖南地方辣椒品种RAPD体系的正交优化研究

以辣椒DNA为模板,对影响辣椒RAPD扩增的重要参数进行了优化试验,以期建立辣椒RAPD反应的最佳体系.通过采用正交试验设计的方法,对辣椒RAPD条件进行了优化,结果表明:最佳的辣椒RAPD的反应体系(15μL)中含有1×buffer,MgCl2 2.67 mM,dNTPs 0.13mM,Primer 0.5μmol/L,Taq 0.75 U/μL,DNA 40～50 ng.适宜扩增条件为94℃预变性4 min,再进入40个PCR循环94℃变性1 min,37℃退火45 s,72℃延伸1 min,72℃延伸10 min,4℃保存.     

枇杷属植物ISSR反应体系的建立和优化

首次通过正交实验,对影响枇杷属植物ISSR反应较大的Mg2+、Taq酶、dNTPs、引物、模板DNA浓度进行筛选,并对扩增反应程序进行优化。优化后的反应体系为:25μL反应体系中,含10×buffer2.5μL,Mg2+浓度2.0mmol·L-1,Taq酶1.5U,引物0.3μmol·L-1,模板DNA60ng,dNTPs0.15mmol·L-1。反应程序为94℃预变性5mim;94℃变性1mim,退火温度70s,72℃延伸1.5mim,40次循环;72℃延伸7mim,4℃保存。     

辣椒SSR反应体系的优化

本试验研究了辣椒SSR-PCR反应体系的主要成分对扩增结果的影响,同时进行了退火温度梯度和循环次数试验。优化后的反应体系为:总体积20μL,1.5μL模板DNA(25ng/μL)、1U Taq酶、0.375μmol.L-1引物、1.875mmol.L-1Mg2 、0.2mmol.L-1dNTPs、1XPCR buffer。扩增程序为:94℃预变性4min,94℃变性45s,58℃(以SSR005为例)退火45s,72℃延伸90s,35个循环,最后一个循环延伸增加为8min,4℃保存至电泳。     

中国樱桃S-RNase基因PCR扩增技术体系的建立

通过对TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTP、通用引物、模板DNA浓度等反应参数的系统研究,建立了中国樱桃S-RNase基因特异PCR扩增体系。该体系反应的总体积25μL,其中Taq酶1.25U,MgCl22.5mmol/L,dNTP0.15mmol/L,通用引物0.25μmol/L,模板DNA 50 ng。反应程序为:94℃预变性3 min;33个循环的94℃变性1 min,56℃退火45 s,72℃延伸1.5 min;最后72℃延伸10 min。利用优化的扩增体系在中国樱桃的不同品种中获得有效扩增,进一步证明了该体系具有良好的稳定性和重复性。     

刺梨ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以刺梨为试材，对影响ISSR．PCR扩增结果的主要影响因素包括Mg^2＋、TaqDNA聚合酶、dNTPs、引物、模版DNA的浓度及引物退火温度进行了优化筛选。确立了适合刺梨ISSR．PCR分析的最佳反应体系，即20μL反应体系中各组分浓度分别为：10×buffer 2．0μL，Mgz＋1．875mInoI／L。TaqDNA聚合酶1．0U，dNTPs0．1mmol／L，引物2．0μmol／L，模板DNA20ng。PCR扩增程序：94。c预变性5min，94℃变性1min，48℃退火温度45S，72℃延伸1min，34个循环，72℃后延伸6min。利用优化体系对3个刺梨品种进行体系稳定性检测，结果表明该优化体系的重复性和稳定性良好。