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相似文献
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1.
【目的】为研究尼罗罗非鱼过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARδ)的表达情况,通过大肠杆菌表达系统表达PPARδ,纯化重组蛋白并获得多克隆抗体。【方法】对PPARδ进行生物信息学分析后设计特异性引物,扩增PPARδ,将其克隆至原核表达载体pET-B2m中,构建重组表达载体;重组质粒转入大肠杆菌B21并用IPTG进行诱导表达,用SDS-PAGE鉴定表达产物。用镍柱纯化重组蛋白后免疫日本大耳兔制备多克隆抗体,用间接ELISA技术检测抗体效价,Western Blot鉴定抗体的特异性。【结果】成功构建了原核表达载体pET-B2m-PPARδ,实现了重组蛋白的原核表达和纯化,重组蛋白以包涵体蛋白和可溶性蛋白2种形式存在,分子量约为90 kD;制备的多克隆抗体效价为1∶2 048 000,Western Blot检测结果表明该抗体能特异性识别尼罗罗非鱼PPARδ。【结论】成功实现了尼罗罗非鱼PPARδ重组蛋白的融合表达,在大肠杆菌中高效表达后纯化重组蛋白,免疫日本大耳兔获得了效价高、特异性强的多克隆抗体,为尼罗罗非鱼PPARδ的功能研究奠定了基础。  相似文献   

2.
【目的】研究旨在构建新冠病毒Omicron变异株(B.1.1.529)RBD重组质粒pET-28a-RBD-dimer,利用E.coli BL21(DE3)原核细胞表达S-RBD二聚体蛋白并制备其多克隆抗体,用于研究Omicron变异株RBD的免疫学功能。【方法】运用Golden Gate无缝克隆技术将密码子优化的RBD二聚体基因克隆到pET-28a载体中,构建pET-28a-RBD-dimer重组质粒。经表达条件优化后,以镍离子亲和层析法分离纯化RBD二聚体蛋白。将纯化的蛋白作为免疫原制备鼠源抗RBD二聚体蛋白的多克隆抗体,利用间接ELISA、IFA及Western blotting试验技术分别检测多克隆抗体的效价和特异性。【结果】ELISA试验结果显示该多克隆抗体的效价高达1:256 000,IFA及Western blotting试验结果表明该多克隆抗体可特异性识别原核、真核细胞表达的RBD二聚体蛋白以及商业化RBD蛋白,具有较好的特异性、反应原性和灵敏性。【结论】研究成功使用原核细胞表达Omicron RBD二聚体蛋白,其具有较好的免疫原性,可以有效制备具有较高抗体效价、特异性...  相似文献   

3.
【目的】制备兔抗鼠三结构域蛋白59(Tripartite motif-containing 59,TRIM59)多克隆抗体。【方法】利用PCR方法得到小鼠TRIM59基因片段,将其克隆至pGEX-2T原核表达载体中,转入大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达GST-TRIM59融合蛋白。GST-TRIM59融合蛋白经亲和层析纯化浓缩后免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,通过ELISA测定兔抗鼠TRIM59多克隆抗体效价,用Western blot测定其特异性。用免疫组织化学方法检测TRIM59在小鼠前列腺癌组织中的表达。【结果】成功构建了pGEX-2T-TRIM59原核表达重组质粒,并诱导表达出GST-TRIM59融合蛋白,免疫新西兰大耳白兔5周后获得多克隆抗体。ELISA测定结果表明,TRIM59多克隆抗体效价为1∶106以上;Western blot分析表明,TRIM59多克隆抗体具有良好的特异性。免疫组织化学检测发现,TRIM59在小鼠前列腺癌组织细胞中高表达。【结论】成功地制备了特异性良好的兔抗鼠TRIM59多克隆抗体,其具有良好的免疫学活性,能够用于相关研究。  相似文献   

4.
为制备尼罗罗非鱼TGF-β1多克隆抗体,采用同源重组技术构建尼罗罗非鱼pET-B2m-TGF-β1原核表达载体,转入大肠杆菌B21中诱导表达,将重组表达蛋白质纯化后免疫大耳兔制备多克隆抗体,采用Western Blot和ELISA检测抗体的特异性和效价。结果表明,构建的pET-B2m-TGF-β1原核表达载体经诱导表达获得了分子量为5.2×10~4的重组蛋白质,免疫大耳兔获得效价为1∶2 048 000的抗尼罗罗非鱼TGF-β1多克隆抗血清,该抗体能够特异性地识别原核表达的TGF-β1蛋白。  相似文献   

5.
【目的】制备鼠抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)细胞受体CD163SRCR5-SRCR6多克隆抗体。【方法】提取PAM细胞总RNA,通过RT-PCR方法获得CD163SRCR5-SRCR6(第1 417~2 136bp,共720个bp)基因,将其克隆到pET-28a(+)载体上,构建重组表达载体pET-28a(+)-CD163,经酶切、PCR鉴定和测序验证后转化大肠杆菌,在BL21(DE3)中诱导重组目的蛋白表达,然后用Ni-NTA方法纯化目的蛋白,免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,通过间接ELISA和IFA方法检测多克隆抗体效价,并初步鉴定多克隆抗体血清结合细胞及阻断PRRSV感染细胞的活性。【结果】克隆了720bp的CD163SRCR5-SRCR6基因,成功构建了pET-28a(+)-CD163重组表达载体;SDS-PAGE结果表明,CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白被成功诱导并以包涵体形式表达;Western blot结果表明,重组蛋白具有良好的免疫原性,间接ELISA方法测得免疫Balb/c小鼠制备的抗CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白的多克隆抗体效价可达105;IFA试验结果显示,制备的抗CD163SRCR5-SRCR6重组蛋白的多克隆抗体可与Marc-145细胞结合,且在1∶20、1∶40倍稀释时,能部分阻断高致病性PRRSV SD16毒株感染Marc145细胞。【结论】用大肠杆菌原核表达系统成功诱导表达了CD163SRCR5-SRCR 6重组蛋白,用重组蛋白免疫小鼠获得了高效价多克隆抗体,其可以结合细胞并阻断PRRSV感染细胞。  相似文献   

6.
【目的】制备高特异性、高效价的乙酰/丙二酸单酰转移酶(MAT)多克隆抗体,为研究山羊MAT在脂肪酸代谢中的功能奠定基础。【方法】采用PCR方法扩增奶山羊的MAT基因,将其亚克隆到pET32a(+)载体得到pET32a(+)-MAT原核表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。使用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的MAT蛋白经复性后进行活性检测。采用皮下免疫法将纯化的MAT蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,用ELISA和Western blot检测血清多克隆抗体的效价和特异性。【结果】PCR扩增得到981bp的MAT基因编码区;成功构建了pET32a(+)-MAT原核表达载体,诱导表达获得了56ku的重组蛋白。活性检测表明,复性后的MAT具有转移酶活性,ELISA检测显示抗体效价达1∶128 000,经Western blot鉴定,制备的多克隆抗体能特异性检测原核表达的MAT蛋白以及在HEK-293细胞中表达的MAT蛋白。【结论】获得了具有酶活性的MAT蛋白以及高特异性、高效价的兔抗MAT多克隆抗体,为研究MAT在脂肪酸代谢中的功能提供了重要的试验工具。  相似文献   

7.
【目的】辣椒脉斑驳病毒(Chilli veinal mottle virus, ChiVMV)是茄科植物生产上危害最严重的病毒之一,也是口岸检疫的对象。本研究旨在制备特异性强的ChiVMV外壳蛋白的多克隆抗体并用于田间病株的检测。【方法】通过RT-PCR方法扩增ChiVMV贵州烟草分离物外壳蛋白基因的全长(861 bp)和部分片段(396 bp),分别重组至原核表达载体pET28a中,转化Escherichia coli BL21后进行诱导表达,表达产物层析分离和透析纯化后免疫大耳兔制备多克隆抗体,最后使用酶联免疫吸附法(ELISA)、Western blot等方法检测抗体效价和特异性。【结果】成功制备了ChiVMV外壳蛋白的两种多克隆抗体antiCP1-287aa、antiCP1-132aa,抗体效价分别为1∶6 400、1∶12 800;两种抗体antiCP1-287aa、 antiCP1-132aa均能通过Western blot方法检测到抗原;田间病株的间接ELISA检测显示,antiCP<...  相似文献   

8.
试验旨在制备原核表达鹅源新城疫病毒(NDV)JS/5/05/Go株M蛋白的多克隆抗体并进行鉴定。以鹅源NDV总RNA为模板,RT-PCR扩增M基因,亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)获得重组质粒pET32a-M,转化E.coli BL21(DE3)菌株进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测表达产物;用KCl染色切胶纯化法纯化重组蛋白;采用切胶免疫小鼠的方法制备M蛋白多克隆抗体,抗体效价用间接ELISA检测,特异性用Western blot和间接免疫荧光法鉴定。结果表明,在大肠杆菌中成功表达了分子量约为55 000的重组蛋白,用切胶纯化法获得了纯度较高的重组蛋白;ELISA法检测抗体效价可达1∶102 400,Western blot和间接免疫荧光试验结果表明制备的多克隆抗体能够特异性识别纯化的M蛋白及NDV自身表达的M蛋白。  相似文献   

9.
【目的】原核表达斑马鱼(Danio rerio)蛋白酪氨酸磷酸酶受体B(PTPRB)并制备多克隆抗体,为研究斑马鱼PTPRB基因功能及血管发育相关信号传导通路打下基础。【方法】采用无缝克隆技术将斑马鱼PTPRB基因插入原核表达载体pET-B2m构建重组表达质粒,转化大肠杆菌B21感受态细胞后采用IPTG进行诱导表达,然后以诱导表达的融合蛋白免疫大耳兔制备多克隆抗体,并采用Western blotting和ELISA检测多克隆抗体的特异性及免疫效价。【结果】斑马鱼PTPRB蛋白亲水性均值为-0.490,属于亲水性蛋白,且具有较丰富的潜在抗原表位位点,分布均匀,无典型的跨膜区。将斑马鱼PTPRB基因插入原核表达载体pET-B2m成功构建获得重组表达质粒pET-B2-PTPRB,转化B21感受态细胞后经IPTG诱导表达,即获得35.0 kD的融合蛋白。融合蛋白PTPRB主要以包涵体形式存在;以纯化融合蛋白PTPRB免疫大耳兔,其血清抗体效价为1∶2048000,说明采用融合蛋白PTPRB可有效刺激大耳兔产生较强的免疫反应,获得较高效价的PTPRB多克隆抗体。Western blotting检测结果显示,PTPRB多克隆抗体具良好抗原特异性。采用Protein A/G亲和层析柱对制备获得的PTPRB多克隆抗体进行亲和层析纯化,可获得高纯度的多克隆抗体,纯化后的PTPRB多克隆抗体浓度在10 mg/mL以上。【结论】构建的斑马鱼PTPRB基因原核表达载体能高效表达具备良好免疫原性的融合蛋白PTPRB,以融合蛋白PTPRB免疫大耳兔可获得高效价、高特异性的PTPRB多克隆抗体,为研究斑马鱼PTPRB蛋白功能提供有利工具,也为揭示PTPRB在鱼类血管发育中的作用机制提供技术支持。  相似文献   

10.
【目的】制备溶葡萄球菌素(lys)的多克隆抗体,为检测其在转基因细胞、胚胎及转基因动物中的表达奠定基础。【方法】以含有lys基因成熟肽序列的PEPB质粒为模板,经PCR扩增,构建pET28a-Ly原核表达载体,并以其转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达并纯化蛋白后,常规免疫家兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体效价,Western blot检测抗体的特异性。【结果】构建的原核表达载体pET28a-Ly经IPTG诱导6h后即可高效表达lys蛋白,蛋白经纯化后,其质量浓度可达到3.05mg/mL;抗体经ELISA检测,效价为1∶27 000,West-ern blot检测结果表明,抗体的特异性较好。【结论】成功构建了lys原核表达载体,所制备的lys多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性。  相似文献   

11.
4种蝴蝶雄性生殖系统形态学研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
【目的】明确4种蝴蝶雄性生殖系统的形态学结构。【方法】将新鲜标本剪下腹部,在Motic SMZ168-BL型显微镜下观察解剖,用Q Imaging Retiga 2000R(CCD)显微成像系统照相,采用Montage图像叠加软件进行图像处理。【结果】描述了4种蝴蝶的雄性生殖系统,其中外生殖器的差异主要表现在囊形突、钩突、背兜、阳基轭片等上,而内生殖器的主要差异表现在精巢、复射精管、单射精管及附腺上。【结论】4种蝴蝶雄性生殖系统的各部分结构特征存在较大差异。  相似文献   

12.
对L9和L3两个白粉寄生孢菌株的生物学特性研究表明,它们的生长适温为10~30℃,其中最适生长温度分别为25℃和20℃;适宜生长的pH为4~10,其中最适pH均为8.有利于L9菌株菌落生长的碳、氮源分别为可溶性淀粉、乳糖和牛肉膏;有利于L3菌株菌落生长的碳、氮源分别为葡萄糖、乳糖和蛋白胨;改良查氏培养基有利于两者菌落的生长.  相似文献   

13.
为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式,以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材,利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位,克隆到HvnANT1基因,对其进行生物信息学分析。结果表明:1)在7H染色体的84.30—86.00 cM获得1个MYB类转录因子,命名为HvnANT1。2)该基因长1 033 bp,其完整开放阅读框为762 bp,编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14 kU,是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构,无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,具有2个SANT结构域(分别位于第13—第63个;第66—第114个氨基酸)。3)同源比对与系统进化分析表明:青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%;这些序列都具有2个高度保守的2个SANT结构域;与大麦的亲缘关系最近,其次是与乌拉尔图小麦,与水稻最远。4)亚细胞定位结果表明,该基因定位在细胞核内。5)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示:与籽粒颜色形成的乳熟早期和乳熟晚期相比,软面团期的HvnANT1基因在‘涅如姆扎’中表达量极显著上调,而在‘昆仑10号’中各时期的表达量较低且差异不显著;且软面团期的‘涅如姆扎’籽粒HvnANT1基因的表达量极显著高于‘昆仑10号’(P<0.01)。花青素合成相关的结构基因HvnCHI、HvnANSHvnDFR与该基因表达量模式相似。综上,青稞HvnANT1蛋白结构中的SANT结构域在物种进化过程中比较保守;该基因定位在细胞核内,符合转录因子特性;HvnANT1基因表达模式与结构基因HvnCHI、HvnANSHvnDFR相似,在籽粒颜色形成的软面团期表达量极显著升高。  相似文献   

14.
采用生长速率法测定3种生物农药和3种化学药剂对马铃薯晚疫病菌、早疫病菌和黑痣病菌的室内毒力。结果表明:100万孢子/g寡雄腐霉WP对晚疫病菌、早疫病菌和黑痣病菌毒力较好,其EC50分别为  0.041 2  μg/mL、0.000 1  μg/mL和0.052 0  μg/mL;0.3%四霉素AS对3种马铃薯病害病原菌的EC50分别为0.009 3  μg/mL、0.208 4  μg/mL和0.265 9  μg/mL;3%中生菌素WG对3种病原菌的毒力较弱,EC50分别为 7.494 1  μg/mL、2.035 6  μg/mL和20.266 6  μg/mL;20%烯肟·戊唑醇SC对3种病原菌的EC50分别为  0.435 9  μg/mL、0.003 9  μg/mL和1.114 0  μg/mL;50%锰锌·氟吗啉WP对3种病原菌的EC50分别为  1.216 2  μg/mL、0.192 5  μg/mL和5.153 5  μg/mL;30%苯甲·嘧菌酯SC对3种病原菌的EC50分别为  11.270 1  μg/mL、0.227 8  μg/mL和6.071 8  μg/mL。综上所述,100万孢子/g寡雄腐霉WP、0.3%四霉素AS和20%烯肟·戊唑醇SC对马铃薯晚疫病、早疫病和黑痣病室内毒力较好。  相似文献   

15.
旨在初步了解丝氨酸蛋白酶抑制剂基因在扩展莫尼茨绦虫生长发育中的作用。采用分子克隆获得扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因部分片段,应用MEGA软件对其进行进化分析。同时以beta-Tubulin基因作为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR技术检测该基因在扩展莫尼茨绦虫4个不同发育阶段即头节、幼节、成节、孕节中的表达差异,最终克隆获得749bp的serpin基因片段。进化分析表明,扩展莫尼茨绦虫serpin基因与多方棘球蚴serpin基因有较近的亲缘关系。标准曲线分析显示,serpin和beta-Tubulin基因的Ct值与阳性质粒的浓度均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.99,熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,具有较高的特异性。同时试验结果显示,serpin基因在虫体各发育阶段中的表达丰度存在差异,从高到低依次为孕节、头节、成节、幼节。由此初步推测,此基因可能在扩展莫尼茨绦虫虫卵发育为六钩蚴的过程中发挥一定作用。  相似文献   

16.
旨在对新疆南疆部分地区璃眼蜱属的蜱进行分子生物学鉴定,了解其分布情况。采集新疆南疆部分地区蜱,通过形态学鉴定将璃眼蜱属蜱作为样本,通过12SrDNA和16SrDNA基因扩增、测序及序列分析进行蜱种类鉴定。13个采样点共559只璃眼蜱属蜱,鉴定为3种,分别为小亚璃眼蜱、亚洲璃眼蜱和残缘璃眼蜱。  相似文献   

17.
岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性研究   总被引:2,自引:0,他引:2  
【目的】研究岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性。【方法】采用组织分离法分离纯化魔芋软腐病球茎及叶柄中的致病菌,通过魔芋球茎、胡萝卜及马铃薯块的侵染试验初步确定其致病性,再利用魔芋球茎侵染致病及盆栽致病性试验确认其致病性;经菌落与细胞形态、生理生化特性及16SrRNA序列测定确定病原菌的类型。【结果】从魔芋软腐病球茎及叶柄中共分离获得16株细菌,侵染试验表明,其中CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1、CDS2-B2、CZS-B4和CZS-B6共6株细菌可使魔芋球茎表现软腐症状,并导致盆栽魔芋发病;6株细菌的菌落与细胞形态均存在差异;在魔芋、胡萝卜及马铃薯块上的侵染能力不同;16SrRNA序列分析表明,菌株CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1及CDS2-B2均与菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)亲缘关系最近,菌株CZS-B4与菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)亲缘关系最近,相似度为98.8%,菌株CZS-B6与菊果胶杆菌(Pectobacterium chrysanthemi)的相似度达99.9%。【结论】导致岚皋县魔芋软腐病的致病细菌存在生物多样性,其致病性也存在差异,其中新发现的魔芋软腐病原菌菊果胶杆菌(Pecto-bacterium chrysanthemi)致病性最强,菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)和菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)致病性较弱。  相似文献   

18.
孟加拉鲥、美洲鲥和中国鲥形态学比较分析   总被引:1,自引:0,他引:1  
观察、解剖107尾孟加拉鲥Tenualosa ilisha、美洲鲥Alosa sapidissima和中国鲥Tenualosa reevesii,详细记叙了孟加拉鲥外部形态和内部结构,运用传统形态学方法比较分析了3种鲥鱼的形态差异.三者形态7项可量性状比值的聚类分析结果显示,孟加拉鲥和中国鲥先聚为一类,再和美洲鲥聚为一类,这与它们的分类地位相一致.外观上,孟加拉鲥臀鳍鳍条短,被1层薄鳞覆盖;美洲鲥的纵列鳞数及体长/体高、体长/头长都大于其他2种鲥鱼.可数性状上,第一外鳃弓鳃耙和脊椎骨数目能明显区分3种鲥鱼.孟加拉鲥、中国鲥和美洲鲥的第一外鳃弓鳃耙数分别为181~219+153~224、95~131+170~175和24~31+47~55;脊椎骨数分别为46~48、37~39和55~57.在内部结构上,根据胃的形状、盲囊部的大小、幽门垂的长短和数量、肠道的弯曲数目及相对长度可以准确鉴定这3种鲥鱼.孟加拉鲥肠道最长,中国鲥次之,美洲鲥肠道最短.3种鲥鱼在消化道结构的差异,预示食性已产生分化.  相似文献   

19.
【目的】克隆大肠杆菌半胱氨酸合成酶(包括丝氨酸乙酰转移酶(cysE)和O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶(cysM))的基因,对其进行原核表达,并制备相应蛋白的抗体。【方法】用PCR方法从大肠杆菌BL21(DE3)中扩增cysE和cysM基因,构建其原核表达载体pET32a(+)-cysE和pET32a(+)-cysM,对其进行BamHⅠ和SacⅠ双酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot(以His抗体作为一抗)检测。用纯化的cysE和cysM蛋白作为抗原免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,并通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价。【结果】PCR获得了822bp的cysE基因和912bp的cysM基因。原核表达质粒pET32a(+)-cysE和pET32a(+)-cysM构建成功,并可在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,表达的cysE和cysM重组蛋白分子质量分别为56和58ku。制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性,抗体滴度均达到1∶102 400。【结论】成功克隆了大肠杆菌cysE和cysM基因,并实现了原核表达,同时制备出了相应的多克隆抗体。  相似文献   

20.
采用组织分离法,以PDA培养基为分离培养基,从绣线菊的根、茎和叶中分离获得39株内生真菌。平板对峙结果表明, 21株活性菌株对6种植物病原菌(辣椒疫霉病原菌、番茄枯萎病原菌、苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、葡萄灰霉病原菌、小麦赤霉病原菌)有不同程度的抑制作用,其中菌株XXT10对苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、番茄枯萎病原菌、小麦赤霉病原菌的抑制率分别达到73.2%、72.5%、39.5%和42.7%。通过测得的ITS rDNA 序列与GenBank数据库中已知序列比对后该菌为链格孢属菌。生物学特性试验表明,该菌株在28~32℃时,选择PDA培养基,分别以乳糖和蛋白胨作为碳、氮源,酸碱度中性的条件下,菌落的生长状况最佳。  相似文献   

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