多重RT-PCR体系检测4种虾病毒的方法

根据多重RT-PCR的技术原理,利用对虾传染性表皮与造血组织坏死症病毒、白斑综合征病毒、黄头病毒和桃拉综合征病毒的基因序列分别设计了4对特异引物,建立多重RT-PCR体系用于虾4种病毒的检测。多重RT-PCR体系能特异地扩增出IHHNV、WSSV、YHV和TSV的目的片段:TSV特异性扩增片段508 bp,WSSV 特异性扩增片段435 bp,IHHNV 特异性扩增片段301 bp 和YHV。特异性扩增片段614 bp。结果表明,多重PCR虾病毒检测系统具有较高的特异性和敏感性,并对其它对虾病原呈阴性。IHHNV、TSV、WSSV和YHV模板在多重PCR虾病毒检测体系中的检测下限分别为0.1,1,0.02和0.2 pg。病毒感染病料检测试验中,该检测体系的检测结果与单纯PCR的检测结果呈现出较好的吻合度。     

传染性鲑鱼贫血症病毒实时荧光环介导等温扩增检测方法的建立

根据ISAV的基因保守序列,利用LAMP Designer软件设计了6条引物,采用新型的环介导等温扩增设备进行扩增和检测,优化了反应条件,分析了所建立方法的特异性和灵敏度,并与RT-PCR和实时荧光RT-PCR进行比较。研究表明,该方法最适反应温度为64℃,反应10 min就可以观察到明显的扩增。该方法灵敏度高,检测限为78.4 fg RNA,比常规RT-PCR灵敏度高100倍,与实时荧光定量RT-PCR灵敏度相当;特异性好,与传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、出血性败血症病毒(VHSV)、鱼类病毒性神经坏死病病毒(VNNV)、鱼腹水病毒(YAV)等14种主要鱼类病毒没有交叉反应。结果表明,本研究建立了ISAV的实时荧光环介导等温扩增检测方法,实验能对整个扩增过程进行实时监测,提高检测灵敏度的同时,防止由于开盖跑电泳或加染料而导致的污染。     

食品中牛源性成分荧光PCR检测方法的建立

目的:建立荧光PCR方法检测食品中牛源性成分。方法:本研究以牛线粒体保守基因序列设计特异性引物和探针,建立牛源性成分荧光PCR检测方法;并对方法特异性、灵敏度和稳定性进行评估。结果:该方法能够有效对牛源性成分进行快速检测,具有较的特异性强,灵敏度较高(检出限为0.0001%)。结论:该方法特异性强,灵敏度高,可以快速、准确检测畜肉食品中含有的牛源性成分。     

PCR-DHPLC检测方法在病毒性出血性败血病诊断中的应用

运用RT-PCR与变性高效液相色谱技术(DHPLC)相结合,建立了对病毒性出血性败血症病毒(VHSV)快速检测方法,根据对VHSV病毒N基因保守序列的分析,设计一对特异性引物,将RT-PCR扩增产物经变性高效液相色谱进行快速检测。同时运用荧光RT-PCR方法进行平行检测。结果表明,该方法与荧光RT-PCR检测结果相同,其特异性强,灵敏度较高,检测限为3 pg的病毒核酸模板,PCR-DHPLC技术具有高通量、自动化程度高等优势,是一种快速有效的检测方法。     

对虾肝胰腺细小病毒滚环扩增检测方法的建立

根据对虾肝胰腺细小病毒(HPV)保守基因序列,设计特异性的锁式探针及其扩增引物,优化反应条件,建立了肝胰腺细小病毒超分支滚环扩增检测方法。实验中采用一步法连接,探针在Taq DNA连接酶作用下,58℃连接40 min、62℃扩增30 min便可以扩增出明显条带。反应特异性验证实验表明,该体系能够特异性地检测出HPV,而不与供试的其他对虾病原发生交叉反应;灵敏度分析结果显示该方法的检测极限为105 copies/μl,与PCR检测方法相比,一步法连接的滚环扩增的灵敏度低两个数量级。该方法反应过程中温度变化次数少,基本都在等温条件下进行,不需要PCR仪,可发展成为在简便实验条件下使用的简易检测方法。     

环介导等温扩增技术与横向流动试纸条法快速检测鳗利斯顿氏菌的研究

采用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、横向流动试纸条技术(Lateral flow dipstick,LFD),建立一种鳗利斯顿氏菌快速检测方法。针对鳗利斯顿氏菌金属蛋白酶基因设计一套特异性引物及异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针,结合生物素标记的环介导等温扩增技术扩增反应和横向流动试纸条技术对鳗利斯顿氏菌进行检测;比较LAMP-AGE、LAMP-LFD和PCR-AGE的灵敏度;选取4株鳗利斯顿氏菌和6株非鳗利斯顿氏菌验证LAMP-LFD特异性。试验结果表明,应用LAMP-LFD,能在30 min内完成鳗利斯顿氏菌的检测;LAMP-LFD检测的灵敏度为7.7 cfu/ml,LAMP-AGE和PCR-AGE检测的灵敏度均为77 cfu/ml;4株鳗利斯顿氏菌均呈阳性反应,其他6株非鳗利斯顿氏菌均为阴性。应用LAMP-LFD检测鳗利斯顿氏菌特异性强、灵敏度高、并且操作安全、简便、快捷。     

用生物素标记寡核苷酸DNA探针快速检测鱼传染性胰脏坏死病病毒IPNV

研究了用生物素标记的寡核苷酸ＤＮＡ探针快速检测鱼传染性胰脏坏死病病毒ＩＰＮＶ，取得了较好的结果。对探针的灵敏度，特异性进行了灵敏度、特异性进行了测定，并与其它快速检测技术作了比较。     

草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法的建立

根据草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)衣壳蛋白VP6编码基因的序列设计特异性引物,以病毒全基因组RNA为模板,通过对反应条件进行优化,建立了GCRV的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。检测结果表明,本方法可在63℃下1 h内实现靶片段的大量扩增,扩增产物经凝胶电泳呈现梯型条带,反应体系中添加SYBR Green I荧光染料后,绿色阳性结果明显区别于橙色阴性结果。该检测体系针对草鱼呼肠孤病毒的检测灵敏度高,其最低检测限为33 pg,与常规RT-PCR方法相比较,灵敏度高10倍,且与斑点叉尾鮰呼肠孤病毒(CCRV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、大鲵虹彩病毒(GSIV)等无交叉反应。该方法灵敏度及特异性高,且不需昂贵仪器设备,为快速检测草鱼呼肠孤病毒与诊断草鱼出血病提供了简捷快速的技术手段。     

我国一株新型黄头病毒的分子流行病学

为查明黄头病毒(Yellow Head Virus,YHV)在我国的存在和变异情况,本研究采用世界动物卫生组织(OIE)《水生动物诊断手册》中YHV套式RT-PCR检测方法对2012-2014年采集的299份样品进行了YHV监测,并对部分YHV阳性样品基因进行了克隆测序及系统发育分析.流行病学调查显示,299份样品中YHV的阳性率为11％,我国养殖的中国明对虾、凡纳滨对虾、日本囊对虾以及罗氏沼虾的部分样品中均检出了YHV,中国明对虾和罗氏沼虾是本次调查中新发现的YHV自然宿主,而且YHV在中国明对虾中的检出率最高.对6份较强阳性样品YHV基因组ORF1b内1002 bp的分型片段进行克隆测序和序列分析,序列比对结果显示,阳性样品的YHV与国外报道的YHV的6个基因型相似度为81.0％-90.5％;系统发育分析显示,6份阳性样品归于同一分支,但与已知YHV的6个基因型均不在同一分支内,其与YHV基因1型(YHV-1)亲缘关系较近.对阳性样品YHV基因组ORF3内编码gp116蛋白的一段序列进行克隆测序,得出其序列长度为509 bp,与YHV-1a的545 bp、YHV-1b的383 bp和YHV-2(即鳃联病毒GAV)的476 bp均不同;依据该片段构建的系统发育树显示,6份阳性样品归于同一分支,与YHV已知的6个基因型不同,与YHV-1亲缘关系较近,且与YHV-1a相似度大于YHV-1b.对其中两份样品的ORF2序列进行比对显示,两份样品序列相似性为99.8％,蛋白序列完全相同,与YHV-1的序列相似度为85.9％,与YHV-2相似性为80.9％.样品调查结果对增补YHV的宿主范围有重要意义;YHV核酸检测和序列比对结果表明,感染我国养殖对虾的YHV为一种新的致病株型.     

PCR法制备地高辛标记DNA探针斑点杂交检测对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)

利用非放射性标记物地高辛(DIG),通过PCR方法制备了对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)DNA探针,探针长度705bp,标记产量为20ng／μL。通过核酸探针斑点杂交检测方法对此探针特异性及灵敏度进行验证,结果表明,该探针具有较高的灵敏度和较强的特异性,检测IHHNV DNA的检出灵敏度为24．8pg,可检出26．6ng患病对虾组织DNA中的IHHNV,与250．4ng健康虾组织DNA、202．5ng健康虾匀浆液,白斑综合症病毒(WSSV)DNA和肝胰腺细小病毒(HPV)DNA均不发生交叉反应。本方法可应用于健康亲虾、苗种的培育和无特定病原(SPF)对虾种群的选育及IHHNV流行病学调查,并具有较高的应用价值。     

应用PCR和RT-PCR技术对4种对虾病毒的检测

探讨了应用PCR和RT－PCR技术对4种主要的对虾病毒进行检测的方法。同时使用该方法检测了对虾天然饵料－－卤虫中的4种对虾病毒。结果显示，含病毒核酸的阳性对照样品分别扩增出了大小为824bp,705bp,260bp和216bp的预期产物，但未能从卤虫样品中检测到此4种病毒的存在。本文报道的病毒检测方法具有快速、灵敏、准确的特点，可以用于进出口贸易中对活体或冰冻对虾，虾苗，对虾饵料等进行相关对虾病毒的检疫，也为制定我国对虾病毒检疫检验规范提供了技术参考。     

对虾6种病毒多重PCR检测方法的建立

本研究针对养殖对虾6种病毒,包括白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、肝胰腺细小病毒(HPV)、桃拉综合征病毒(TSV)、对虾杆状病毒(BP)和传染性肌肉坏死病毒(IMNV),选择各自的基因分别设计特异性引物和探针,首先进行了单一病毒的PCR验证,在此基础上建立了同时特异性检测6种对虾病毒的多重PCR检测体系。对反应条件进行优化并进行特异性和灵敏度的验证。50μl反应体系,Mg2+的最佳浓度为5mmol/L,ExTaq酶最佳用量为3.75U,反应程序中最佳退火温度为55.5℃。6种病毒之间以及与对虾基因组都存在很好的特异性。最终经试验验证,该系统的检测灵敏度对WSSV可达104拷贝,IHHNV可达102拷贝,HPV可达104拷贝,TSV可达103拷贝,BP可达105拷贝,IMNV可达105拷贝。虽然该多重PCR方法灵敏度不如单一的PCR检测高,但是通过实际样品检测验证了该方法省时、消耗较少,又不失准确性,在实际应用中具有可靠性和应用价值。     

对虾的主要疾病及其诊断方法

诊断对虾病原的方法有传统的形态病理学（光镜和电镜直接观察和组织病理学等）、扩增和生物测定、微生物学和血清学方法，对皮下及造血组织坏死病毒病（IHHNV）、肝胰脏细小病毒病（HPV）、拖拉症（Taura syndrome,TS）、白斑综合症（WSSV）、斑节对虾型杆状病毒病（MBV）和杆状对虾病毒病（BP）等病原均采用非放射性的基因组探针目前已研制出了NHP、某些弧菌（Vibrio spp）和微孢子虫的传统基因探针，根据聚合酶链式反应（PCR），采用DNA扩增方法确立的检测某些病原的高敏感性方法也应用在对虾病原诊断上。     

江苏地区对虾3种病毒病的流行病学调查及5株IHHNV的编码区基因序列分析

对虾白斑综合征病毒(WSSV)、桃拉综合征病毒(TSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)是威胁对虾养殖的重要病毒。为了调查这3种病在江苏境内的流行情况,根据世界动物卫生组织(OIE)推荐的《水生动物疾病诊断手册》的PCR检测法对2015年5月—2016年5月采集的1436尾对虾样品进行3种疾病的流行病学调查。结果显示WSSV阳性率为17.20%,TSV阳性率为0%,IHHNV阳性率为39.48%。对江苏不同地区分离出的5株IHHNV进行基因序列分析,数据显示这5个地区的毒株均属于Ⅰ型感染株,与韩国株的进化关系较为接近。本研究通过调查以上3种病毒病在江苏境内的流行情况,并进行序列分析,发现江苏不同地区的凡纳滨对虾IHHNV感染均为Ⅰ型,研究结果对养殖虾的疾病防控有重要参考价值。     

多重PCR检测对虾白斑综合症病毒和传染性皮下组织坏死病毒

采用对虾白斑综合症病毒和传染性皮下组织坏死病毒的特异引物,在一个PCR反应中同时扩增到大小分别为271 bp和356 bp的病毒特异片段,多重PCR条件优化后可从最少100 fg级病毒DNA模板中定性检测出此两种病毒。     

A single-step multiplex PCR for simultaneous detection of white spot syndrome virus and infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus in penaeid shrimp

White spot syndrome virus (WSSV) and infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) are the major viral pathogens of penaeid shrimp worldwide (Lightner & Redman 1998). Litopenaeus vannamei was introduced into China from the Americas, and quickly became widely cultured. Following its introduction, both IHHNV and WSSV have become important pathogens of cultured penaeid shrimp and have had a huge impact on the culture industry in China in recent years.     

凡纳滨对虾商业苗种抗WSSV性能比较

白斑综合征病毒(WSSV)一直是甲壳类生物的高致病性病原。为了解市场上不同凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)商业苗种病原携带情况及其抗WSSV性能,本研究收集了6个品牌的凡纳滨对虾商业苗种(分别简称为海南Z、海南S、广州P、广州Z、黄骅R和东营M),先进行包括WSSV在内的8种病原的检测,然后,采用单尾定量口饲感染方式进行抗WSSV性能测试,并比较各组苗种感染WSSV后的平均存活时间、存活率以及累积死亡率的差异。结果显示,6个商业苗种都不携带WSSV,部分苗种检测有潜在虾肝肠胞虫(EHP)和偷死野田村病毒(CMNV)。各苗种感染WSSV后,平均存活时间从长到短依次为海南Z、广州P、黄骅R、海南S、广州Z、东营M。东营M感染WSSV后第4天达到死亡高峰,而海南Z在第6~7天到达死亡高峰,比东营M晚了2~3d。感染实验结束后,海南Z和广州P存活率最高,同为72.5%,而东营M和黄骅R的存活率最低。本研究表明,海南Z和广州P抗WSSV性能最强,研究结果可为凡纳滨对虾抗病新品种的选育提供基础数据。     

Presence of multiple viruses in non-diseased, cultivated shrimp at harvest

Histological examinations were carried out with 400 cultivated black tiger shrimp (Penaeus monodon) from 12 commercial rearing ponds from three different areas in Thailand over a period of 3 years. The shrimp were collected at or near harvest time as two arbitrary size groups of 10–20 each from each pond. Aside from size difference, they showed no gross signs of disease and were normally active. Pathognomonic histopathological lesions were found only for hepatopancreatic parvovirus (HPV) or monodon baculovirus (MBV). Although these were relatively frequent, no unusual shrimp mortality had occurred in any of the ponds examined. Severity of these infections was negatively correlated with shrimp size. When grouped together, HPV-infected shrimp gave mean lengths of approximately 6.5 cm that were significantly different from uninfected shrimp at 9 cm length, early in the cultivation cycle while MBV-infected groups of approximately 9 cm length were not readily distinguishable until uninfected shrimp were 10 cm or more, later in cultivation. Thus, HPV infection was correlated with more severe stunting than MBV. In addition to histopathological examination, polymerase chain reaction (PCR) assays for HPV, white spot syndrome virus (WSSV) and infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) were carried out on one large sample of 240 shrimp from 6 ponds where visible lesions were apparent for MBV only. Surprisingly, 94% of the specimens gave a positive test for at least one of the four viruses. HPV and IHHNV alone or in combination were detected at high prevalence (approximately 60%) despite the absence of visible histological lesions and were confirmed by southern blot hybridization. Although the prevalence of the four viral pathogens was very high, it would normally have gone unnoticed, since normal shrimp are rarely examined for viruses.     

传染性皮下及造血组织坏死病毒致病性研究进展

传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)是一种分布较广、危害较大的对虾病毒,已被世界动物卫生组织(OIE)列为须向其申报的甲壳类重要疫病病原。IHHNV在我国已形成了一定的流行趋势,目前仍是严重危害我国养殖虾类的重要病毒。本文从IHHNV的流行地区及危害、宿主、致病类型、对宿主不同年龄阶段的致病性差异、与白斑综合征病毒(WSSV)的干扰作用、感染机制和致病机理方面,综述了与IHHNV致病性相关的研究进展,以期为进一步深入研究IHHNV防控提供参考资料。