胶孢炭疽菌致病相关基因Plv2功能分析

胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的橡胶树炭疽病是橡胶树三大叶部病害之一,严重威胁着橡胶树的生长。本研究从构建的胶孢炭疽菌RC178 T-DNA突变体库中筛选获得一株致病力明显减弱的突变菌株T1103,其T-DNA为单拷贝。采用TAIL-PCR克隆了该突变体T-DNA插入位点的侧翼序列,通过比对胶孢炭疽菌全基因组序列,发现该TDNA插入位点所在的序列包含一个5 400 bp的基因,将其命名为Plv2。Plv2基因包含3个外显子,编码一个假定的甾醇C-24甲基转移酶。敲除野生型菌株RC178中的Plv2,发现敲除突变体与T1103的致病力表现基本一致,由此推测Plv2基因为致病相关基因。     

一个编码富含丝氨酸蛋白的基因影响大丽轮枝菌的微菌核形成、产孢及致病力

 大丽轮枝菌是一种可在广泛的寄主范围内引发黄萎病的土传植物病原真菌,主要以微菌核的形式在土壤中存活多年,因此鉴定与微菌核形成及致病力相关的基因对防治该病害至关重要。本课题组从前期构建的棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库中筛选到一个微菌核明显减少的突变体,致病力测定结果表明,该突变体致病力明显下降。以棉花黄萎病菌野生型菌株V592的基因组DNA为模板,从棉花黄萎病菌中克隆到被T-DNA插入突变的基因(VdSRP1)编码区全长为415 bp,包含一个外显子,编码一个富含丝氨酸蛋白,与任何已知的注释基因没有显著的序列相似性。为了明确VdSRP1基因在大丽轮枝菌中的功能,利用同源重组的原理及农杆菌介导的遗传转化方法获得了VdSRP1基因的2个敲除体菌株,与棉花黄萎病菌野生型菌株V592相比,VdSRP1基因敲除突变体的微菌核形成明显减少,产孢量及孢子萌发率下降,对棉花的毒力也显著下降。对野生型菌株V592及VdSRP1敲除突变体的转录分析表明,VdSRP1调控一系列与微菌核形成、孢子形成及致病力相关基因的表达。这些结果表明,VdSRP1基因影响大丽轮枝菌的致病力、微菌核形成、产孢及孢子萌发。     

一个编码富含丝氨酸蛋白的基因影响大丽轮枝菌的微菌核形成、产孢及致病力

 大丽轮枝菌是一种可在广泛的寄主范围内引发黄萎病的土传植物病原真菌,主要以微菌核的形式在土壤中存活多年,因此鉴定与微菌核形成及致病力相关的基因对防治该病害至关重要。本课题组从前期构建的棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库中筛选到一个微菌核明显减少的突变体,致病力测定结果表明,该突变体致病力明显下降。以棉花黄萎病菌野生型菌株V592的基因组DNA为模板,从棉花黄萎病菌中克隆到被T-DNA插入突变的基因(VdSRP1)编码区全长为415 bp,包含一个外显子,编码一个富含丝氨酸蛋白,与任何已知的注释基因没有显著的序列相似性。为了明确VdSRP1基因在大丽轮枝菌中的功能,利用同源重组的原理及农杆菌介导的遗传转化方法获得了VdSRP1基因的2个敲除体菌株,与棉花黄萎病菌野生型菌株V592相比,VdSRP1基因敲除突变体的微菌核形成明显减少,产孢量及孢子萌发率下降,对棉花的毒力也显著下降。对野生型菌株V592及VdSRP1敲除突变体的转录分析表明,VdSRP1调控一系列与微菌核形成、孢子形成及致病力相关基因的表达。这些结果表明,VdSRP1基因影响大丽轮枝菌的致病力、微菌核形成、产孢及孢子萌发。     

苹果炭疽叶枯病菌致病相关基因CgNVF1的功能初步分析

苹果炭疽叶枯病是主要由胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的一种苹果重要叶部病害,严重威胁着苹果树的生长。本研究从构建的苹果炭疽叶枯病菌T-DNA突变体库中筛选获得一株致病力缺失的突变菌株A3083,采用hiTAIL-PCR方法克隆了该突变体T-DNA插入位点的右翼序列;通过与胶孢炭疽菌基因组序列比对分析,发现T-DNA插入位点位于1个预测的CGGC5_9603基因内,并将该基因命名为CgNVF1。CgNVF1基因全长2252 bp,含有2个内含子,编码709个氨基酸。CgNVF1定位于细胞质,在苹果炭疽叶枯病菌菌丝、分生孢子和附着胞中均有表达。通过构建CgNVF1敲除菌株和CgNVF1互补菌株,并结合表型分析,证实CgNVF1基因在苹果炭疽叶枯病菌附着胞形成及致病中具有重要的作用。     

水培致病测定体系在Foc致病机理分析与香蕉品种抗性评价中的应用

为验证已建立的水培苗直接浇菌法的准确性与适用范围,利用此方法分析了5个致病相关基因敲除突变体对巴西蕉的致病力,评价了巴西蕉、皇帝蕉、粉蕉、宝岛蕉4个香蕉品种对4株尖镰孢菌古巴专化型病原菌株的抗性,并观察了接菌后巴西蕉根部与球茎组织的病原菌入侵过程。结果表明,foste12基因敲除突变株△Foste12菌株对巴西蕉的致病力与野生型菌株相比下降41%,且与传统的盆栽苗伤根淋菌法测试的下降趋势基本一致;皇帝蕉、宝岛蕉对4株病原菌均表现为中抗或高抗,粉蕉均表现为感病或高感;且观察到病原菌孢子附着根部、菌丝入侵根细胞间隙、维管束组织内的菌丝纵向生长及球茎组织内的菌丝侵入定殖等入侵过程。研究证实水培苗直接浇菌法可用于病原菌致病机理分析及与不同香蕉种质资源对尖镰孢菌古巴专化型的室内抗性评价。     

苦瓜枯萎病菌Ⅱ型卤酸脱卤酶基因FoHAD-type Ⅱ功能分析

苦瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌苦瓜专化型(Fusarium oxysporum f. sp.momordicae Sun&Huang)侵染引起的一种严重制约苦瓜安全生产的土传病害。明确苦瓜枯萎病菌的致病机理对苦瓜枯萎病的防治具有重要的指导意义,但目前苦瓜枯萎病菌的致病机理尚不明确。前期分析苦瓜枯萎病菌强致病力菌株SD-1和弱致病力菌株SD-V(携带真菌病毒)转录组差异表达基因时,发现Ⅱ型卤酸脱卤酶(FoHAD-typeⅡ)基因在SD-V菌株中表达量显著下调,推测该基因与苦瓜枯萎病菌的致病性相关。本研究根据同源重组的原理,利用分割标记法(Split-Marker PCR)获得了FoHAD-typeⅡ基因的融合片段,分别通过PEG介导的原生质体转化和农杆菌介导的遗传转化获得该基因的敲除突变体和回补突变体,并对敲除和回补突变体的生物学特性和致病力进行了分析。结果表明,敲除突变体的生长速率和产孢量与野生型菌株相比没有显著差异,菌丝尖端形态和孢子形态也无明显差异,但气生菌丝减少,对渗透胁迫耐受性降低,致病力显著下降;回补突变体的生物学性状和致病力与野生型菌株一致。表明FoHAD-typeⅡ基因...     

河南商丘地区棉花黄萎病菌分离鉴定和致病力分析

为探讨河南商丘地区棉花黄萎病菌的致病型群体变异,对该地区棉花上分离的8株单孢菌株的菌落形态、显微结构、致病力、ITS序列、系统进化及菌体蛋白等方面进行了研究。结果表明:这些菌株均属于棉花黄萎病菌Verticilliumdahliae;系统进化树显示8株菌株并没有聚在同一进化枝上;8株黄萎菌菌株存在致病力差异,SQ4菌株致病力最强,属于落叶型,而其它致病力较弱的7个菌株属于非落叶型;不同致病力的菌株间蛋白谱带存在差异。     

苎麻疫霉抗甲霜灵突变株对棉苗的致病力及其遗传

研究了苎麻疫霉抗甲霜灵(Mt^r)突变株对棉苗的致病力及其遗传,结果显示,抗性突变株对棉苗的致病力与其野生型亲本间无显著差异。而Mt^r突变株XC-6-2对棉苗的致病力在其无性第1代(ZG₁)单孢株间及其与亲本间均存在极显著差异,且XC-6-2对棉苗的致病力性状在单游动孢子第2代(ZG₂)持续发生分离;XC-6-2单卵孢第1代(OG₁)对棉苗的致病力间亦存在极显著差异。上述结果提示,抗甲霜灵突变株对棉苗的致病力在无性单孢和单卵孢子后代间均不能稳定遗传。对比研究发现,野生型亲本菌株XC-6对棉苗的致病力在单游动孢子和单卵孢后代有相似的遗传规律,且单游动孢子群体对棉苗致病力的变异系数较其单卵孢株间的变异系数大。     

甜瓜细菌性果斑病菌致病性突变体筛选与hrcR基因的克隆

 细菌性果斑病(Bacterial Fruit Blotch,BFB)是西瓜和甜瓜的重要病害。本实验从发病甜瓜果实上分离得到致病菌株MH21,经鉴定为燕麦食酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp. citrulli)。利用转座子Mini-Tn5构建MH21菌株的突变体库,Southern印迹杂交结果显示Mini-Tn5在菌株MH21染色体上可随机、单拷贝插入。通过浸种处理甜瓜种子进行突变体的致病性检查,筛选得到1株致病性完全丧失的突变体M543。对M543中转座子插入基因的克隆和测序表明其突变基因为燕麦食酸菌Ⅲ型分泌系统(TTSS)中的保守基因hrcR。推测菌株MH21中hrcR基因编码的蛋白定位于细菌内膜,是分泌通道主要成分之一。hrcR基因互补菌株的致病性检查结果显示其致病力恢复到野生型的84%。研究同时发现hrcR基因突变后MH21菌株丧失了在烟草上诱导过敏性坏死反应的能力。本研究从遗传学角度说明TTSS是西甜瓜果斑病菌致病性的重要因子。     

多菌灵、三环唑对大丽轮枝菌微菌核、黑色素形成及致病力的影响

 在离体和活体条件下测定了多菌灵、三环唑对大丽轮枝菌的微菌核黑色素形成的影响,以及经2种杀菌剂处理产生的形态变异菌株对棉苗的致病力。结果表明:多菌灵在培养基内含量超过0.1μg/ml时,即可抑制大丽轮枝菌微菌核的形成,随着培养基内多菌灵浓度的增加,微菌核形成时间逐渐延长,形成量逐渐减少;三环唑浓度为0.5μg/ml时,可抑制微菌核的黑色素形成,微菌核从黑色变为浅红至红褐色。三环唑对微菌核黑色素形成呈可逆抑制,变色的微菌核菌落移入不含药的培养基后,大多可恢复形成黑色素。培养基内三环唑浓度的提高,也可抑制大丽轮枝菌微菌核的形成;因2种杀菌剂的抑制而丧失形成微菌核的白色菌丝体移入不含药的培养基,微菌核形成能力也不能恢复。多菌灵和三环唑经棉株吸收后均能抑制植株内大丽轮枝菌微菌核的形成,但对微菌核色素的形成未见有明显影响。2种杀菌剂处理产生的形态变异菌株的致病力与野生型菌株致病力差异不显著。     

Disruption of Cerevisin via Agrobacterium tumefaciens‐mediated transformation affects microsclerotia formation and virulence of Verticillium dahliae

Agrobacterium tumefaciens‐mediated transformation (ATMT) was used to obtain a large number of Verticillium dahliae (Vd991) T‐DNA insertion mutants that were randomly integrated. Insertion mutants that produced significantly fewer microsclerotia were chosen for further analysis. Mutant T0065 was identified as having the Cerevisin gene interrupted by T‐DNA, and it was named cerevisin. The cerevisin protein showed a high amino acid sequence similarity with the vacuolar protease B. The mutant strain cerevisin displayed decreased production of microsclerotia and conidia, significantly reduced growth rate and reduction in virulence compared to the wild type. Moreover, the composition of secreted proteins differed between the cerevisin mutant and the wild type. Loss of function of Cerevisin decreased secretion of proteins of low molecular weight (14–25 kDa). Upon treatment with the secreted proteins of the mutant, the degree of leaf wilting decreased, indicating that Cerevisin is implicated in production of these proteins, which are putative pathogenicity factors of V. dahliae. The results suggest that Cerevisin is involved in controlling multiple processes of development and metabolism, plays an important role in vegetative growth and microsclerotia formation and affects virulence of V. dahliae.     

向日葵黄萎病菌突变体库的建立及其阳性转化子的鉴定

为揭示向日葵大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb.的致病机理,利用农杆菌介导法将带有潮霉素抗性标记和绿色荧光蛋白报告基因的双元载体转入大丽轮枝菌的分生孢子中并获得阳性转化子,以野生型菌株为对照,对随机挑取的阳性转化子的菌落形态、菌丝生长速率、产孢量、粗毒素分泌量和致病力进行了研究。结果表明,共获得800株阳性转化子,随机选取的40株阳性转化子中有2株的菌落只产生白色气生菌丝,不能形成黑色微菌核。与对照相比,40株转化子的生长速率均有不同程度降低,其中转化子A1生长速度降低最显著,菌落直径仅为3.28 cm,比对照下降了38.92%。40株转化子中有3株的产孢量高于对照,其中转化子A9的产孢量最高,为3.50×10~7个/mL,比对照提高1.10倍;转化子A1的产孢量最低,仅为1.35×10~7个/mL,比对照下降了19.16%。40株转化子中有4株的粗毒素分泌量较对照显著升高,占测定菌株的10%,有24株较对照显著降低,占60%,其余12株与对照无显著差异。40株转化子中有3株的致病力较对照显著增强,占测定菌株的7.5%;有7株的致病力较对照显著降低,占17.5%;其余30株与对照无显著差异。     

限制性内切酶介导的串珠镰刀菌插入突变和致病性突变体的分离

 插入突变是研究和分离生物功能基因的重要技术手段,即通过将外源标记基因随即插入生物基因组创建突变体,再利用"质粒拯救"、TAIL-PCR或Reverse-PCR等技术来克隆突变基因。     

根癌农杆菌介导的胶孢炭疽菌遗传转化体系的建立

本研究基于农杆菌介导的遗传转化方法,建立了芒果胶孢炭疽菌高效的遗传转化体系,获得一批炭疽菌的T-DNA插入突变体,其目的是为炭疽菌的功能基因组学研究和致病相关基因的克隆奠定基础。结果如下:通过摸索并优化了体系的各项因子,在潮霉素筛选浓度为200μg/mL,菌液浓度为OD₆₆₀=0.15条件下,AS为200μmol/L,选择pH5.5的IM共培养基中转化效果最好;进一步通过对转化子的继代稳定性和PCR检测,结果发现潮霉素抗性稳定遗传和假阳性率低;通过菌落形态观察和产孢能力的测定获得3个菌落形态异常突变体,6个产孢能力下降突变体。     

脂肽类抗生素fengycin对大丽轮枝菌孢子萌发和微菌核形成的影响

 枯草芽胞杆菌NCD-2菌株能够产生脂肽类抗生素fengycin和surfactin。本研究分别比较了NCD-2野生型菌株、丧失fengycin合成的突变子MF和丧失surfactin合成的突变子MS对大丽轮枝菌的抑菌活性。结果表明,NCD-2菌株和突变子MS周围能形成清晰的透明圈,而突变子MF周围透明圈模糊,说明fengycin对大丽轮枝菌具有抑菌活性。不同浓度的脂肽提取物对大丽轮枝菌孢子萌发的抑制试验表明,NCD-2野生型菌株的脂肽提取物能抑制大丽轮枝菌孢子萌发,在0.1 mg·mL^-1浓度下对孢子萌发的抑制率为46.30%,且随着脂肽浓度的提高抑制效果更加明显;同野生型菌株相比,突变子MF脂肽提取物显著降低了对大丽轮枝菌孢子萌发的抑制效果,在0.1 mg·mL^-1浓度下对孢子萌发的抑制率仅为18.48%,而突变子MS的脂肽提取物对大丽轮枝菌孢子萌发抑制效果与野生型菌株没有显著差异。通过测试脂肽提取物对微菌核形成的影响,发现野生型菌株和突变子MS脂肽提取物均能够显著抑制微菌核的形成,而突变子MF几乎丧失了对微菌核形成的抑制作用。RT-qPCR结果证明,野生型菌株和突变子MS脂肽提取物能抑制微菌核形成相关基因的表达,而突变子MF丧失了对微菌核形成相关基因表达的抑制作用。以上结果证明,fengycin在NCD-2菌株抑制大丽轮枝菌孢子萌发和微菌核形成中发挥主要作用。     

脂肽类抗生素fengycin对大丽轮枝菌孢子萌发和微菌核形成的影响

 枯草芽胞杆菌NCD-2菌株能够产生脂肽类抗生素fengycin和surfactin。本研究分别比较了NCD-2野生型菌株、丧失fengycin合成的突变子MF和丧失surfactin合成的突变子MS对大丽轮枝菌的抑菌活性。结果表明,NCD-2菌株和突变子MS周围能形成清晰的透明圈,而突变子MF周围透明圈模糊,说明fengycin对大丽轮枝菌具有抑菌活性。不同浓度的脂肽提取物对大丽轮枝菌孢子萌发的抑制试验表明,NCD-2野生型菌株的脂肽提取物能抑制大丽轮枝菌孢子萌发,在0.1 mg·mL^-1浓度下对孢子萌发的抑制率为46.30%,且随着脂肽浓度的提高抑制效果更加明显;同野生型菌株相比,突变子MF脂肽提取物显著降低了对大丽轮枝菌孢子萌发的抑制效果,在0.1 mg·mL^-1浓度下对孢子萌发的抑制率仅为18.48%,而突变子MS的脂肽提取物对大丽轮枝菌孢子萌发抑制效果与野生型菌株没有显著差异。通过测试脂肽提取物对微菌核形成的影响,发现野生型菌株和突变子MS脂肽提取物均能够显著抑制微菌核的形成,而突变子MF几乎丧失了对微菌核形成的抑制作用。RT-qPCR结果证明,野生型菌株和突变子MS脂肽提取物能抑制微菌核形成相关基因的表达,而突变子MF丧失了对微菌核形成相关基因表达的抑制作用。以上结果证明,fengycin在NCD-2菌株抑制大丽轮枝菌孢子萌发和微菌核形成中发挥主要作用。     

Vegetative Compatibility Groupings of Verticillium dahliae from Cotton in Mainland China

One hundred and fourteen isolates of Verticillium dahliae obtained from cotton and eggplant in mainland China were successfully assigned to two vegetative compatibility groups (VCGs) except for one self-incompatible isolate. Eleven isolates were strongly compatible with T9, the tester strain of the cotton defoliating pathotype, forming a linear growth of wild type with abundant microsclerotia and dense mycelia between compatible nitrate-nonutilizing mutants. The remaining 102 isolates were grouped into the non-defoliating VCG2, although the strength of the reaction varied; some isolates were strongly compatible with the tester strain while others were only slightly compatible. All VCG1 isolates including T9 showed the same defoliating symptom in greenhouse inoculation tests. This study confirmed the presence of the defoliating pathotype (VCG1) of V. dahliae in mainland China.