金针菇深层发酵的研究：Ⅱ.影响金针菇胞外多糖产量的因素

研究了金针菇不同菌株、ｐＨ值、淀粉原料、微量元素、多糖的组成单糖、表面活性剂等几个重要因素对金针菇胞外多糖生产的影响。结果表明，供试菌株中以Ｆ－１９产胞外多糖的能力最强；产多糖培养基的最适ｐＨ值为６．５左右；以马铃薯淀粉和甘薯淀粉作碳源，胞外多糖的产量比其他淀粉的高；在培养基中添加质量分数为１００×１０－６－１６０×１０－６的Ｍn2 能显著提高胞外多糖的产量。而添加同等浓度的Ｃｕ２＋反而降低胞外多糖     

铜绿假单胞菌PA14 H3-T6SS的调控功能研究

【目的】研究模式病原细菌铜绿假单胞菌PA14（Pseudomonas aeruginosa PA14）第三套六型分泌系统（H3-T6SS）的调控机制和在环境适应等方面的功能，为该菌致病机制研究和治疗方案开发奠定基础。【方法】以铜绿假单胞菌PA14为研究对象，利用凝胶迁移阻滞试验（EMSA）验证σ^s因子（RpoS）与H3-T6SS启动子区的结合能力；构建rpoS敲除菌株（ΔrpoS）及回补菌株（rpoS），用启动子酶活试验研究RpoS对H3-T6SS表达的调控作用；构建H3-T6SS关键组分clpV3敲除菌株（ΔclpV3）及回补菌株（clpV3），测定其在酸、渗透压等不同胁迫下的细胞存活率；检测H3-T6SS对铜绿假单胞菌PA14生物膜形成和运动能力的影响。【结果】RpoS蛋白可以直接结合H3-T6SS启动子区；成功构建了铜绿假单胞菌PA14的rpoS和clpV3敲除菌株及回补菌株，RpoS正调控H3-T6SS的表达，H3-T6SS有助于细菌抵抗酸胁迫，但对渗透压胁迫响应不明显；H3-T6SS可显著增强细菌的生物膜形成和运动能力。【结论】铜绿假单胞菌PA14的H3-T6SS受调控因子RpoS的正调控，在增强细菌抗酸胁迫、生物膜形成和运动能力等方面有重要作用。     

金针菇深层发酵的研究──Ⅱ．影响金针菇胞外多糖产量的因素

研究了金针菇不同菌株、ｐＨ值、淀粉原料、微量元素、多糖的组成单糖、表面活性剂等几个重要因素对金针菇胞外多糖生产的影响．结果表明，供试菌株中以Ｆ－１９产胞外多糖的能力最强；产多糖培养基的最适ｐＨ值为６．５左右；以马铃薯淀粉和甘薯淀粉作碳源，胞外多糖的产量比其他淀粉的高；在培养基中添加质量分数为１００×１０－６－１６０×１０－６的Ｍｎ２＋能显著提高胞外多糖的产量，而添加同等浓度的Ｃｕ２＋反而降低胞外多糖产量．发酵过程中添加胞外多糖的组成单糖中的Ｄ－木糖、Ｄ－甘露糖和Ｄ－阿拉伯糖能显著提高胞外多糖的产量，并以Ｄ－木糖的效果最佳．此外，发酵过程中添加质量比值为５００×１０－６的表面活性剂吐温８０能显著提高胞外多糖的产量．     

地衣芽孢杆菌XJ-2菌株产胞外多糖发酵条件的优化及其抗氧化活性研究

【目的】优化海洋源性细菌Bacillus licheniformis XJ-2(简称XJ-2菌株)产胞外多糖的培养基,并探究其抗氧化性。【方法】采用单因素法研究XJ-2菌株产胞外多糖培养基中碳源、氮源、pH及发酵时间等因素对胞外多糖产率的影响,采用经典的Fenton法及NADH-PMS-NBT系统研究该多糖的抗氧化性。【结果】优化后发酵条件为:蔗糖8%、硝酸钾2%、pH 7.5、发酵时间84h;胞外多糖产量高达17.752mg/mL;其对·OH和O-2·有较强的清除能力,IC50分别为2.0mg/mL(·OH)、0.06mg/mL(O-2·)。【结论】优化后发酵培养基明显提高了XJ-2菌株胞外多糖产量,且该多糖具有很高的抗氧化性,为胞外多糖的规模化生产以及开发新多糖类免疫调节剂提供了重要的参考资源。     

胞外多糖研究

 采用摇瓶培养法对2种真姬菇的发酵工艺进行研究,结果表明：真姬菇Ⅰ、Ⅱ发酵生产菌丝体及胞外多糖的碳源是葡萄糖,氮源是酵母膏;液体发酵培养基是葡萄糖3%、酵母膏 0.4%、vitB1 10mg/100ml、KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄ 0.1%,pH值为6.0;液体发酵的优化条件是初始pH 6.0~7.0,振荡速度110~130r/min,培养温度25~28℃,装液量150ml/250ml。2种真姬菇菌丝体及胞外多糖产量较高,真姬菇Ⅰ菌丝体干重、胞外多糖产量分别是 3.92、8.83 mg /ml;真姬菇ⅠⅠ菌丝体干重、胞外多糖产量分别是3.25、7.69 mg /ml,即真姬菇Ⅰ摇瓶发酵菌丝体干重、胞外多糖产量高于真姬菇Ⅱ。     

泛素结合酶UBE2T基因在布鲁氏菌感染过程中的作用

【目的】探讨泛素结合酶E2T（UBE2T）在布鲁氏菌感染过程中的功能。【方法】构建UBE2T基因过表达载体pLVX-puro-UBE2T，对其进行PCR和EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切验证，并将其转染小鼠巨噬细胞RAW264.7，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测UBE2T基因过表达效果。设计并合成3条UBE2T基因沉默表达的siRNA（UBE2T-379-siRNA、UBE2T-599-siRNA和UBE2T-661-siRNA），将其转染小鼠巨噬细胞RAW264.7，利用qRT-PCR检测UBE2T基因沉默表达效果。采用四甲基偶氮唑盐（MTT）试验，检测UBE2T沉默或过表达对RAW264.7细胞活性的影响。利用qRT-PCR，检测M5-90感染对RAW264.7细胞UBE2T基因相对表达量的影响，以及对过表达或沉默表达UBE2T基因的RAW264.7细胞中含pyrin结构域NOD样受体家族3（NLRP3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）基因相对表达量的影响。用布鲁氏菌M5-90菌株感染过表达和沉默UBE2T基因的RAW264.7细胞，用活菌计数法检测UBE2T沉默或过表达对RAW264.7细胞内布鲁氏菌增殖的影响，利用相应的试剂盒检测细胞乳酸脱氢酶（LDH）水平、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）活性及白细胞介素6（IL-6）、IL-18、IL-1β和γ-干扰素（IFN-γ）等细胞因子的水平。【结果】成功构建了UBE2T基因过表达载体pLVX-puro-UBE2T，过表达效果良好。3条siRNA中，UBE2T-661-siRNA的干扰效果最佳，其对UBE2T基因的沉默效率为84%。UBE2T沉默或过表达对RAW264.7细胞活性无影响。M5-90感染可提高RAW264.7细胞UBE2T的表达量；沉默UBE2T可提高M5-90介导的NLRP3和Caspase-1的表达，而过表达UBE2T会抑制M5-90介导的NLRP3表达，提高M5-90介导的Caspase-1表达。沉默表达UBE2T可抑制胞内M5-90的增殖，而过表达UBE2T可促进胞内M5-90的增殖。沉默表达UBE2T可抑制M5-90介导的LDH水平，提高Caspase-3活性及IFN-γ、IL-6和IL-1β水平；而过表达UBE2T可提高M5-90介导的LDH水平，抑制Caspase-3的活性及IFN-γ、IL-1β水平。【结论】泛素结合酶UBE2T对胞内布鲁氏菌增殖具有正调控作用。     

嗜线虫致病杆菌CB6菌株胞内外杀虫蛋白的纯化及比较研究

 【目的】分离和纯化嗜线虫致病杆菌北京变种（Xenorhabdus nematophila var. pekingensis）CB6菌株胞内和胞外杀虫蛋白，鉴定其蛋白种类。为进一步利用此类杀虫蛋白奠定基础。【方法】采用硫酸铵沉淀、DEAE Sepharose FF离子交换柱层析、Butyl Sepharose FF疏水柱层析和Sephacryl S-200 HR凝胶过滤对该类蛋白进行分离和纯化，采用Native-PAGE和SDS-PAGE技术对所纯化蛋白进行组分分析。【结果】获得达电泳纯的胞内杀虫蛋白E1和胞外杀虫蛋白E2。以2.58 μg•ml-1含量E1、以4.21 μg•ml-1含量E2喂饲棉铃虫初孵幼虫，对幼虫的生长抑制率分别达62.63％和97.9％。E1、E2经相同纯化参数处理获得的洗脱图相似，经native-PAGE和SDS-PAGE呈现出相似的单带电泳图谱。SDS-PAGE测得E1、E2表观分子量大于212 kD，该杀虫蛋白在60℃仍表现出较强的活性。电泳染色结果表明该类蛋白非糖蛋白也非酯蛋白。【结论】CB6菌株胞内杀虫蛋白E1和胞外杀虫蛋白E2可能是同一种（类）蛋白。     

土壤微生物发酵液对猪苓菌丝生长的影响

【目的】研究土壤微生物发酵液对猪苓菌丝生长发育及胞外多糖质量浓度的影响,为其大规模人工栽培提供技术支持。【方法】从猪苓生活的土壤中分离微生物(细菌、放线菌、真菌),通过平板试验,筛选对猪苓菌丝或菌核生长有促进作用的菌株;用筛选出的微生物发酵液培养猪苓,以不添加发酵液的培养基为对照,比较不同发酵液处理对猪苓菌丝生物量及胞外多糖质量浓度的影响。【结果】平板培养中,细菌L2、L3、L5、L9处理菌丝均有分泌物出现;随着培养时间延长,菌丝颜色逐渐变黄变褐,除L2外,其余细菌菌株处理猪苓均有菌核生成;放线菌A14处理猪苓菌丝生长速度较快,但与对照差异不显著;真菌P3处理猪苓菌丝生长速度与对照相比显著提高。在液体培养基中,真菌P4发酵液可显著提高猪苓菌丝生物量,菌丝体干质量达7.67 g/L;放线菌A3发酵液处理猪苓菌丝胞外多糖质量浓度最高,达0.133 g/L。【结论】从土壤中筛选出了能够促进猪苓菌丝生长发育、提高猪苓胞外多糖质量浓度的菌株。     

茅山地区蝉花菌株的分离及其多糖生物活性的研究

对采自江苏句容茅山地区的蝉花进行组织分离,获得1株组织分离菌株,运用rNDA ITS区段对分离菌株进行分子生物学鉴定。结果表明,该菌株为虫草属类的被孢霉属菌株,命名为JR＿cds1。蝉花中虫草素含量显著高于蚕蛹虫草和冬虫夏草。通过水提醇沉以及Sevage法除蛋白等方法提取蝉花多糖,研究其生物学活性及抑菌作用,结果显示,该蝉花多糖具有较高的清除DPPH自由基活性,高的Fe2＋螯合能力,抑制血管紧张素转化酶（ACE）的活性;对大肠杆菌（G－）和枯草芽孢杆菌（G＋）以及链格孢属真菌显示较好的抑菌效果。     

不同碳氮源对苹果树腐烂病菌胞外果胶酶活性的影响

【目的】探索苹果树腐烂病菌致病力与胞外果胶酶的关系,筛选最佳产酶的碳、氮源,为揭示该病菌致病机理提供依据。【方法】用MS培养基培养苹果树腐烂病菌野生型菌株03-8及其2个突变体(致病力增强突变体X907,致病力丧失突变体T1)菌株,于5,10,15和20d取样,用3,5-二硝基水杨酸(DNS)比色法测定其培养滤液中果胶酶的活性,探讨致病力与酶活性的关系。以野生型菌株03-8为供试菌株,改变MS培养基中的碳(葡萄糖、麦芽糖、根皮苷、果胶、可溶性淀粉)、氮(硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、L-天门冬酰胺)源培养03-8菌株,于5,10,15和20d取样,分别测定各培养滤液中果胶酶的活性,确定最佳碳氮源。用不同含量的最佳碳、氮源与MS培养基培养03-8菌株,10d时取样,测定胞外果胶酶活性,确定培养基中最佳碳、氮源的含量。【结果】在MS培养基中发酵10d,苹果树腐烂病菌致病力增强突变体(X907)产生的胞外果胶酶活性最高,致病力丧失突变体(T1)产生的酶活性最低。用可溶性淀粉、果胶为碳源培养野生型菌株03-8,在第10天培养滤液中果胶酶活性均高于其他供试碳源;以可溶性淀粉为碳源,其含量为0.5%时培养滤液中果胶酶活性最高。在5种供试氮源中,以0.25%蛋白胨为氮源发酵10d产生的胞外果胶酶活性最高。【结论】3种苹果树腐烂病菌发酵10d产生的胞外果胶酶的活性与其致病力相关;含0.50%可溶性淀粉和0.25%蛋白胨的MS培养基为苹果树腐烂病菌产酶的最佳培养基,发酵10d培养滤液中果胶酶的活性最高。     

猪源致病性链球菌的分离鉴定及药敏试验

2006年4月新乡某猪场2～6周龄仔猪发生了急性、热性、败血性传染病.根据病、死猪的发病情况、临床症状和剖检特征,疑似链球菌病.为了确诊,无菌采集病料, 经细菌培养分离出3株链球菌,并对其进行了生化鉴定、动物致病性和药物敏感性试验.结果表明,此病原菌为猪源致病性链球菌,并且分离菌对该猪场常用的几种抗菌药物有不同程度的耐药性.     

陕西及周边地区PRRSV Nsp2与GP5基因变异分析

【目的】了解陕西及周边省份部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2和GP5的变异情况。【方法】采用套式RT-PCR方法,从肝、脾、肺和血清中直接扩增Nsp2、GP5基因并克隆测序,将获得的PRRSV流行毒株序列与GenBank中30个PRRSV参考毒株进行比对分析,构建进化树。【结果】获得了13株PRRSV的Nsp2基因序列(GenBank登录号KM233849~KM233861)和12株GP5基因序列(GenBank登录号KM233862~KM233873)。基因进化树分析显示所有测定PRRSV流行毒株均属北美洲型。对Nsp2基因序列分析发现,12株PRRSV为氨基酸缺失毒株,1株PRRSV为经典毒株。发现GSXF毒株有可能是一株重组毒株。PRRSV变异株与经典株相比,GP5蛋白中存在多处氨基酸点突变。【结论】陕西猪场PRRSV流行毒株以变异株为主,同时存在经典毒株和重组毒株。     

22个榧树优株种子理化性质分析比较

为了筛选指标优良的种质,对来自安徽黟县宏村镇泗溪村和黄山区新明乡樵山村等地的22个榧树优株种子的理化指标进行了研究。分别测定了种仁的水分、油脂、蛋白质、木质素、纤维素含量及榧树种子的物理特征,对取得的各性状进行综合分析。结果表明：7个榧树优株种仁脂肪含量变化在36.20% ～ 57.03%之间,平均质量分数为42.36%;蛋白质含量变化在6.67%～14.69%之间,诸暨1号、高产木榧与其他优株之间差异显著（P＜0.05）;种仁木质素含量范围为7.19%～16.72%,纤维素含量范围为6.24%～7.93%,高产木榧、大圆榧与其他优株之间差异显著（P＜0.05）。来自黟县的诸暨1号脂肪、蛋白质含量在各优株中最高,硬度在各优株中居中,而高产木榧的脂肪、蛋白质和纤维素含量在各优株中最低,木质素和食物纤维含量在各优株中最高,与当地市场评价一致。     

镉硫交互作用对茭白生理生化指标及产量的影响

以茭白(Zizania latifolia Turcz.)的单季茭品种‘蒋墅茭’和双季茭品种‘葑红早’为试材,土壤为栽培介质,对Cd2+100 mg·L-1的胁迫进行不同肥料处理,并添加不同浓度的硫,对茭白部分生理生化指标及产量进行了测定。结果表明,随硫处理浓度的增加,茭白植株受镉胁迫伤害的程度呈逐渐下降的变化趋势。当硫处理浓度为2 mmol.L-1时,茭白的产量达最大,其后随硫处理浓度的增加而持续下降,但均高于不施硫的处理。不同肥料处理间以有机肥处理时茭白的可溶性蛋白含量、根系活力及产量高于无机肥处理;品种间存在差异。     

福建柏组织培养体系的建立及优化

【目的】探究福建柏不同外植体再生过程中最适激素配比，为建立福建柏组织培养体系提供技术支持。【方法】以福建柏鳞叶和茎段作为外植体，在饱和洗衣粉液浸泡20 min和体积分数75%酒精浸泡30 s条件下，研究体积分数0.1% HgCl₂浸泡不同时间(5,8,10,12,15 min)后的消毒效果；以福建柏鳞叶和茎段为材料，通过单因素试验,研究生长素（NAA和2,4-D）对不同外植体愈伤组织诱导的影响，再通过正交试验研究NAA、2,4-D、6-BA不同配比对外植体愈伤组织诱导的影响；以福建柏愈伤组织为材料，采用正交试验研究NAA、2,4-D、6-BA、KT对愈伤组织继代增殖的影响；以福建柏带芽茎段为材料，研究细胞分裂素6-BA对芽诱导和萌发的影响；以福建柏分化苗为材料，采用正交试验研究6-BA、2,4-D、KT对分化苗继代生长的影响；以福建柏无根苗为材料，研究无根苗扩增繁殖的效果。【结果】（1）福建柏鳞叶最适消毒配方为体积分数75%酒精30 s+体积分数0.1% HgCl₂ 10 min，污染率为16.67%；茎段为体积分数75%酒精30 s+体积分数0.1% HgCl₂ 15 min，污染率为23.33%。（2）鳞叶愈伤组织诱导最适配方为MS培养基+NAA 2.0 mg/L+2,4-D 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L，诱导率为81.67%；诱导出的愈伤组织白色近透明，长势良好。而茎段为MS培养基+NAA 0.5 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L，诱导率为78.33%，诱导出的愈伤组织淡绿色，长势良好。（3）愈伤组织最适增殖配方为MS基本培养基+2,4-D 1.0 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+KT 0.5 mg/L，增殖质量为1.984 g，褐化率23.33%。（4）芽诱导萌发最适配方为MS基本培养基+6-BA 2.0 mg/L，平均诱导芽数2.05个，平均萌动数1.70个，分化率100%。（5）分化苗生长和扩繁的最适配方为1/2MS基本培养基+2,4-D 0.5 mg/L+KT 1.0 mg/L，平均生长长度为2.241 cm，无褐化，扩繁成活率为95.50%，扩繁系数为3.18。【结论】福建柏以带芽茎段作为芽增殖再生途径外植体，鳞叶作为愈伤组织再生途径的外植体进行组织培养效果最佳，长势好且稳定。     

魔芋GDP甘露糖焦磷酸化酶基因及其启动子的克隆与分析

以花魔芋和白魔芋为材料,通过魔芋5个转录组高通量测序数据库,与拟南芥进行tBlastn比对、拼接,得到魔芋中的GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因GMP的推定全长,设计基因特异性引物,克隆得到魔芋GMP基因的部分cDNA序列,长度为1 233 bp,其中基因编码区长度为1 086 bp,编码的氨基酸为361个.在此基础上运用FNPI-PCR技术得到了魔芋GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因GMP上游启动子2 116 bp,经生物信息学分析,该序列具有典型的TATA-box、 CAAT-box及与胁迫相关的元件和光应答元件.     

光照度对蛹虫草生长发育的影响

以蛹虫草CM-16菌株为供试材料,分别在75、150、300、500和650lx的光照度环境下进行培养,以蛹虫草的菌丝体颜色饱和度、子座颜色饱和度、生物学效率、栽培周期、子座密度、子座长度、基质利用率为指标,研究不同光照度对蛹虫草生长发育的作用规律。结果表明,供试范围内,光照度与以上各指标之间均呈显著的二次函数关系,蛹虫草生长最适的光照度为140~280lx。可见,光照度对蛹虫草的生长发育有显著影响,在蛹虫草的栽培管理中,应分阶段调节培养环境的光照度。     

温度对玉米蚜发育和繁殖的影响

5种恒温条件下，研究了玉米蚜的生长发育及繁殖规律。在10－25℃时，随温度的升高，若蚜的发育速率加快，发育历期缩短；无翅蚜若虫期的发育起点温度为3．03℃，有效积温为12．80日度，有翅蚜若虫期的发育起点温度为4．32℃，有效积温为135，33日度；在15－30℃时，若蚜存活率为62．8％－84．9％，10℃和35℃时，若蚜存活率下降到13．6％和36．3％；平均寿命随温度升高而缩短；不同温度下繁殖能力不同，25℃时繁殖能力最强，每雌平均产仔量无翅蚜为38．5头，有翅蚜为35．1头。25℃为玉米蚜生长发育及繁殖的最适温度。     

二穗短柄草DREB1G基因表达模式分析和在拟南芥中的异源过量表达

CBF/DREB基因是一类植物特异性转录因子,通过调控下游抗逆相关基因的表达,在植物逆境胁迫应答过程中发挥重要作用。为了研究新型的禾本科模式植物二穗短柄草DREB基因的功能,克隆BdDREB1G的cDNA序列,分析该基因在各种非生物胁迫条件下的表达,构建过表达载体,获得转基因拟南芥。结果表明:高温、低温和水杨酸胁迫处理显著诱导BdDREB1G的表达,暗示该基因响应高温和低温胁迫。初步观察结果说明,该与野生型拟南芥相比,转基因植株生长发育迟缓。这些为研究该基因响应非生物胁迫的功能奠定基础。     

欧洲卫矛愈伤组织分化及其生理生化特性

以欧洲卫矛生长健壮的叶片愈伤组织为材料,通过不同激素配比筛选出适宜其分化的培养基,将愈伤组织置于不同条件下培养。结果表明,适宜欧洲卫矛愈伤组织分化的培养基为MS+1.0 mg·L^-1 6-BA+0.1 mg·L^-1 NAA;欧洲卫矛愈伤组织适宜在光照条件下进行培养,生长周期为28 d,28 d后愈伤组织出现不同程度的褐化;可溶性糖含量先升后降;SOD和POD活性均出现2个峰值,可溶性蛋白变化趋势与POD变化趋势基本一致;可溶性蛋白在分化中起重要作用,且光照条件下,可溶性糖和可溶性蛋白含量、SOD和POD活性均高于黑暗条件下,PPO在培养后期活性下降,可能与愈伤组织褐化有一定关系。