低水平镉暴露对破骨细胞分化的影响

为研究低水平镉(Cd)暴露对破骨细胞(osteoclast,OC)分化的影响,试验以RAW264.7细胞(单核巨噬细胞系)为材料,在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)存在的条件下,用不同浓度Cd处理4 d;利用CCK-8法检测破骨细胞及其前体细胞活性变化,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色试验观察破骨细胞生成,激光共聚焦显微镜观察破骨细胞形态变化,蛋白免疫印迹(Western blot)技术和荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测破骨细胞标志性蛋白及其mRNA水平。结果显示,随着Cd浓度升高,细胞活力受到明显的抑制(P<0.01),并呈浓度-效应关系;与对照组相比,破骨细胞产生的数目和面积均显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01);2、5μmol·L^-1 Cd处理组破骨细胞封闭带的形成均受到抑制;2和5μmol·L^-1 Cd处理组破骨细胞特异性蛋白及其mRNA表达量均显著或极显著下降(P<0.05或P<0.01),并呈剂量依赖性。结果表明,低微摩尔水平镉暴露能够抑制破骨细胞的分化。     

VEGF对体外培养绒山羊次级毛囊外根鞘细胞的影响

本研究旨在探讨陕北白绒山羊毛囊外根鞘细胞的培养和VEGF对次级毛囊外根鞘细胞增殖、分化及细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)、角蛋白10(K10)和成纤维细胞生长因子5(FGF5)mRNA表达量的影响。采集绒山羊体侧部皮肤,并利用消化等方法分离次级毛囊外根鞘细胞,置于37℃、5%CO_2、饱和湿度条件下培养;选用第5代次级毛囊外根鞘细胞,添加不同质量浓度血管内皮生长因子(VEGF),分别处理24、48h,噻唑兰比色法(MTT)检测细胞活力,EdU核酸标记技术检测细胞增殖;实时荧光定量PCR技术检测PCNA、K 10、FGF5mRNA的表达情况。结果显示:1)成功培养出次级毛囊外根鞘细胞,CK17和CK15细胞免疫组化呈阳性。2)VEGF可以促进绒山羊次级毛囊外根鞘细胞的增殖。相同浓度VEGF处理48h组的细胞活力极显著高于处理24h组(P0.01);在48h处理组中,100ng·mL~(-1)组的细胞活力极显著高于对照组、1ng·mL~(-1)组、10ng·mL~(-1)组(P0.01),并显著高于50ng·mL~(-1)组(P0.05),50ng·mL~(-1)组的细胞活力显著高于对照组(P0.05);100ng·mL~(-1)组和50ng·mL~(-1)组增殖细胞比例均极显著高于对照组、1ng·mL~(-1)组、10ng·mL~(-1)组(P0.01),100ng·mL~(-1)组显著高于50ng·mL~(-1)组(P0.05)。3)PCNA、K10、FGF5mRNA在次级毛囊外根鞘细胞中均有表达。在VEGF处理48h时,PCNA mRNA的表达量100ng·mL~(-1)组最高,极显著高于对照组(P0.01),显著高于10ng·mL~(-1)组(P0.05);K10mRNA的表达量对照组最高,极显著高于10ng·mL~(-1)组与100ng·mL~(-1)组(P0.01);FGF5mRNA的表达量对照组最高,极显著高于100ng·mL~(-1)组(P0.01)。综上表明,本研究成功分离培养了陕北白绒山羊次级毛囊外根鞘细胞;VEGF能够促进次级毛囊外根鞘细胞的增殖,抑制细胞的分化;VEGF可能通过抑制次级毛囊外根鞘细胞中FGF5基因的表达而促进毛囊生长。     

RhoU基因沉默对破骨细胞分化的影响

为了研究RhoU(Wrch1)在破骨细胞(osteoclast,OC)分化过程中的作用及其机理,试验以RAW 264.7细胞(单核巨噬细胞系)为基础材料,分别转染阴性慢病毒和siRhoU慢病毒并建立稳定的细胞系;在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)存在的条件下,阴性对照组和RhoU沉默组细胞系分别诱导3或4 d。采用荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)技术检测RhoU和破骨细胞标志性mRNA的表达,蛋白免疫印迹(Western blot)技术检测RhoU和破骨细胞标志性蛋白的表达,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察OC的形成,激光共聚焦显微镜观察OC及其前体细胞的形态变化。结果显示,与阴性对照组相比,RhoU沉默组RhoU基因mRNA和蛋白表达量极显著降低(P0.01);OC形成的数量和面积极显著减少(P0.01);OC前体细胞丝状伪足形成受阻,破骨细胞缺乏完整的封闭带;OC特异性基因mRNA和蛋白表达量均显著或极显著下降(P0.01或P0.05),而TRAP基因mRNA变化不显著(P0.05)。综上表明,沉默RhoU基因能抑制破骨细胞的分化,抑制前体细胞丝状伪足的形成进而影响其融合可能是其主要原因。     

2种方法诱导形成的破骨细胞特性比较

采集ICR小鼠骨髓单核细胞在体外培养过程中加入25.0 μg/L M-CSF+50.0 μg/L RANKL诱导形成破骨细胞,同时选择RAW264.7细胞培养过程中添加100.0 μg/L RANKL诱导分化为破骨细胞.通过检测抗酒石酸碱性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色阳性数及骨吸收陷窝,比较小鼠骨髓单核细胞和RAW264.7细胞株诱导形成的破骨细胞活性.结果显示,小鼠骨髓诱导的细胞TRAP阳性数显著低于RAW264.7细胞株(P＜0.05),而小鼠骨髓诱导的破骨细胞所形成骨吸收陷窝的面积显著大于RAW264.7细胞株(P＜0.05).结果表明,2种方法均可诱导形成具有典型特征的破骨细胞,骨髓单核细胞诱导形成的破骨细胞活性更强,但破骨细胞的数量和纯度明显低于RAW264.7细胞株.     

自然感染OPA的羔羊肺组织中自噬相关因子的表达分析

为研究细胞自噬现象在绵羊肺腺瘤(ovine pulmonary adenocarcinoma,OPA)发生发展过程中的作用,本试验以自然感染OPA的羔羊肺组织为材料,以健康羔羊肺组织为对照组,利用免疫组织化学(IHC)染色、实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot等方法综合检测了自噬基因MAP1LC3B、BECN1、SQSTM1及其对应的自噬蛋白LC3、Beclin1、P62的表达情况。结果显示:在对照组中,LC3、Beclin1、P62主要表达于细支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞中;在OPA肺组织中,LC3、Beclin1、P62主要表达于肿瘤化增生的细支气管上皮细胞、增生的Ⅱ型肺泡上皮细胞和浸润的巨噬细胞中。与对照组相比,OPA肺组织中MAP1LC3B基因表达量极显著升高(P0.01),BECN1基因表达量显著升高(P0.05),而SQSTM1基因表达量则极显著降低(P0.01)。在蛋白水平上,OPA肺组织中LC3和Beclin1表达量均显著高于对照组(P0.05),而P62表达量则极显著低于对照组(P0.01)。结果表明自然感染OPA的羔羊肺组织中自噬水平明显高于健康羔羊肺组织,提示当病毒入侵机体时机体为了抵抗病毒带来的伤害并维持内环境的稳态,细胞自噬水平升高。本试验为深入探讨自噬在OPA发生发展过程中的作用提供了依据。     

Cdc42调控细胞骨架影响破骨细胞分化的研究

研究Cdc42在破骨细胞分化成熟过程中的作用及分子机制。采用慢病毒干扰技术构建Cdc42沉默的RAW264.7细胞株,经嘌呤霉素筛选出稳转株。利用荧光定量PCR与Western blot检测其沉默效率。采用TRAP染色观察细胞分化能力。利用激光共聚焦显微镜观察Cdc42沉默经微丝和微管对细胞伪足形成的影响。利用荧光定量PCR与Western blot检测TRAP、PAK4、Cofilin转录和蛋白表达水平。与对照组比较,Cdc42沉默组Cdc42基因的转录极显著下降,蛋白表达水平显著下调,基因沉默效率在50%以上。TRAP阳性破骨细胞数量也急剧减少,细胞呈圆形。丝状伪足和板状伪足减少,TRAP、PAK4、Cofilin转录水平极显著下降,关键蛋白PAK4和Cofilin蛋白表达显著或极显著下调。Cdc42可通过调控细胞骨架蛋白,经丝状伪足和板状伪足,影响破骨细胞的分化。     

自噬在骨保护素对破骨细胞及其前体凋亡过程的调控机制

为了探讨骨保护素(osteoprotegerin,OPG)对破骨细胞及其前体自噬与凋亡的影响,本研究以RAW264.7细胞诱导分化形成的破骨细胞(osteoclasts,OCs)及其前体(osteoclast precursors,OCPs)为研究对象,通过自噬促进剂雷帕霉素(rapamycin,RAP)或自噬抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)分别预处理1h和30 min后,再添加80ng·mL-1OPG作用细胞6h,试验分为对照组(Con)、OPG、CQ、CQ+OPG、RAP和RAP+OPG组,利用免疫印迹法(Western blot)检测细胞自噬相关蛋白;流式细胞术Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡率。结果显示,与对照组相比,OPG组OCPs的Atg5和Beclin-1水平极显著或显著上调(P0.01或P0.05),但LC3-Ⅱ无显著差异(P0.05);与OPG组相比,RAP+OPG组OCPs中的LC3-Ⅱ水平极显著上调(P0.01);与对照组相比,OPG组OCs中LC3-Ⅱ、Atg5和Beclin-1水平极显著下调(P0.01);与OPG组相比,RAP+OPG组OCs的Atg5和Beclin-1水平极显著下调(P0.01)。与对照组相比,OPG处理组和RAP+OPG组OCPs凋亡率极显著上升(P0.01),CQ+OPG组凋亡率无显著差异(P0.05);RAP+OPG比OPG组OCPs凋亡率极显著增加(P0.01);与对照组相比,OPG组OCs凋亡率极显著降低(P0.01),CQ+OPG组凋亡率极显著下降(P0.01),RAP+OPG组凋亡率极显著下降(P0.01)。表明OPG能够促进OCPs发生自噬,而自噬的激活促进了OCPs的凋亡;OPG抑制OCs自噬的发生,并且抑制和激活自噬都能抑制OCs的凋亡。     

维生素D介导鸡BMSCs和BMMs共培养体系中破骨细胞的形成

为探究1α, 25-(OH)_2D_3对鸡骨髓间充质干细胞(BMSCs)和骨髓单核巨噬细胞(BMMs)体外共培养体系中破骨细胞(OC)形成的影响,笔者对1α, 25-(OH)_2D_3处理后的细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)、骨吸收功能鉴定、OC标志基因mRNA和蛋白表达的检测。结果表明:1α, 25-(OH)_2D_3能够上调BMSCs中核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的表达,下调骨保护素(OPG)的表达。1α, 25-(OH)_2D_3处理共培养细胞5 d,OC数目较对照组明显增多,骨吸收活性较对照组极显著增强,基质金属蛋白酶9(MMP-9)、Ⅱ型碳酸酐酶(CAⅡ)、组织蛋白酶K(CtsK)及TRAP等标志性蛋白的mRNA和蛋白表达极显著高于对照组(P0.01),其中10~(-8) mol·L~(-1) 1α, 25-(OH)_2D_3效果最明显。结果表明,10~(-8) mol·L~(-1) 1α, 25-(OH)_2D_3能够介导鸡BMSCs和BMMs共培养体系中OC的形成,该OC具有骨吸收活性,为进一步研究OC在家禽骨骼及钙磷代谢紊乱性疾病中的作用机制奠定基础。     

基于AMPK通路研究葛根素对猪前体脂肪细胞成脂分化的影响

【目的】 探究葛根素是否通过AMPK通路促进松辽黑猪前体脂肪细胞分化,以期为在饲粮中添加葛根素改善猪肉肉质提供参考。【方法】 待松辽黑猪前体脂肪细胞汇合度达90%时进行为期4 d的诱导分化。诱导分化时,将细胞分为对照组（Con）、葛根素组（Pue）、葛根素+AMPK激活剂AICAR组（AICAR）及葛根素+AMPK抑制剂CompoundC组（CompoundC）,对照组诱导液中不添加葛根素,Pue组添加40 μmol/L葛根素,AICAR组添加40 μmol/L葛根素+500 μmol/L AICAR,CompoundC组添加40 μmol/L葛根素+20 μmol/L CompoundC。诱导分化结束,收集各组细胞,用甘油三酯（TG）酶法检测细胞中甘油三酯浓度;实时荧光定量PCR检测AMPK各亚基以及成脂分化相关基因的表达水平;用Western blotting检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）、p-AMPK （Thr-172）、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）的蛋白表达水平;通过Autodock Vina 1.20对葛根素、AMPKα亚基做分子对接预测。【结果】 甘油三酯测定结果显示,与Con组相比,Pue组甘油三酯浓度显著增加（P<0.05）;与Pue组相比,AICAR组甘油三酯浓度显著降低（P<0.05）。实时荧光定量PCR结果显示,与Con组相比,Pue组PPKAG2、PPKAB1、PPKAB2、PPKAA1、PGC-1α表达量均显著降低（P<0.05）,Pue组C/EBPα、PPARγ、ACC表达量均显著增加（P<0.05）;与Pue组相比,AICAR组PPKAG1、PPKAG2、PPKAB1、PPKAB2、PPKAA1表达量显著增加（P<0.05）,AICAR组C/EBPα、PPARγ、ACC表达量均显著降低（P<0.05）,CompoundC组PPKAG1、PPKAG2、PPKAB2表达量均显著降低（P<0.05）,CompoundC组C/EBPα、ACC表达量均显著增加（P<0.05）。Western blotting结果显示,与Con组相比,Pue组PPARγ、ACC蛋白表达量显著增加（P<0.05）,AMPK、p-AMPK蛋白表达量显著下降（P<0.05）,且p-AMPK/AMPK显著下降（P<0.05）;与Pue组相比,AICAR组PPARγ、ACC蛋白表达量显著下降（P<0.05）,AMPK、p-AMPK蛋白表达量显著增加（P<0.05）,CompoundC组PPARγ、ACC蛋白表达量显著增加（P<0.05）,AMPK、p-AMPK蛋白表达量及p-AMPK/AMPK显著下降（P<0.05）。【结论】 40 μmol/L葛根素能够显著增加脂肪细胞中甘油三酯含量,显著上调成脂分化基因PPARγ、C/EBPα、ACC的表达量,显著下调AMPK各亚基的表达量,AMPK激活剂AIRCR可显著抑制葛根素的作用,说明葛根素可通过抑制AMPK通路调节松辽黑猪前体脂肪细胞成脂分化。     

积雪草酸对LPS诱导肉鸡急性肝损伤的保护作用

旨在探讨积雪草酸(asiatic acid, AA)预处理对LPS诱导雏鸡急性肝损伤的影响及AA对AMPK-mTOR通路与肝细胞自噬的作用。60只1日龄雏鸡适应性饲养7 d后，随机分为对照组、LPS组、LPS+AA(低、中、高剂量)预处理组和AA对照组。除对照组和LPS组，AA低、中、高剂量预处理组和AA对照组使用相应剂量的AA预处理14 d外，对照组和LPS组灌胃相同剂量的羧甲基纤维素钠悬浮液。AA预处理组和LPS组在16,18和20日龄腹腔注射LPS(0.5 mg/kg),21 d时采集肝脏样品，-80℃保存，用于后续试验。通过HE染色评估鸡肝细胞的病理损伤，试剂盒检测肝脏组织中AST和ALT的活力，RT-qPCR、Western blot检测自噬相关基因和蛋白的表达；免疫组化、免疫荧光分别检测Beclin 1、LC3-Ⅱ在肝组织的表达。结果显示：LPS导致肉鸡肝脏出现细胞肿胀、大面积空泡变性以及炎性细胞浸润；而AA预处理有效缓解了LPS引起病理变化，下调mTOR的基因和蛋白表达，提高AMPK、ATG5、Beclin 1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的基因和蛋白表达；Beclin 1和L...     

钙磷对体外培养SD大鼠破骨细胞生成和活化的影响

通过成骨细胞与脾细胞共培养，在体外诱导脾细胞转化为破骨细胞，转化过程中分别加入3、5mmol／L的钙或磷及不同比例的钙、磷，设不添加钙、磷因子对照。经形态学观察、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色计数、扫描电镜观察象牙片吸收陷窝研究钙、磷因子对大鼠破骨细胞生成和活化的影响。结果表明，培养液中钙、磷浓度分别为3、5mmol／L时对破骨细胞的生成及活化均有显著抑制作用（P〈0．05），5mmol／L Ca对破骨细胞生成活化的抑制与对照组差异极显著（P〈0．01）。Cca：Cp=2：1组对破骨细胞生成和活化的抑制作用最强。证实钙、磷通过抑制破骨细胞的生成和活化抑制破骨细胞的骨吸收活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒对Marc145细胞自噬相关基因转录的影响及分析

自噬参与多种疾病过程,且与病毒感染与增殖关系密切。为探究Marc145细胞感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)后自噬相关基因Beclin1、ATG5和ATG12mRNA转录差异及规律、PRRSV增殖与细胞自噬的联系;采用实时荧光定量PCR方法对自噬相关基因Beclin1、ATG5和ATG12 mRNA的转录进行测定,绘制了转录规律曲线图;并经实时荧光定量测定并绘制PRRSV在Marc145细胞中增殖规律图。结果显示,试验组自噬相关基因转录量明显高于对照组,表明PRRSV能诱导Marc145细胞自噬,且使Beclin1、ATG5和ATG12mRNA提前进入高转录状态;其转录规律与细胞病变、PRRSV增殖规律呈正相关。     

1,25(OH)_2D_3对体外诱导培养鸡胚破骨细胞的影响

为了研究1,25(OH)2D3对体外诱导培养鸡胚破骨细胞的作用,从18日龄鸡胚长骨(股骨和胫骨)分离骨髓细胞进行培养,在培养过程中分别添加10-7,10-8和10-9mol/L的1,25(OH)2D3。通过倒置显微镜观察其活体形态,对培养1,3,5,7 d的破骨细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)鉴定,培养7 d后进行骨吸收陷窝和功能分析。结果显示,10-8mol/L组除第1天和其他各组差异不显著以外,第3,5,7天诱导所生成的破骨细胞的数量都显著高于10-7和10-9mol/L这2组(P0.05),极显著高于对照组(P0.01)。经扫描电镜观察,无论是吸收陷窝面积还是陷窝吸收程度,10-8mol/L组均显著高于其2组;对照组无明显陷窝。由此可知,1,25(OH)2D3能诱导鸡胚骨髓细胞形成破骨细胞,且浓度为10-8mol/L时效果最好,所诱导的破骨细胞活性较高。     

番鸭破骨细胞骨髓诱导培养体系的建立

无菌分离、冲洗7日龄内番鸭长骨骨髓,收集、培养破骨细胞（Osteoclasts,OC）。培养过程中对照组不添加钙、磷因子,试验组加入不同浓度比例的钙磷双因子（Ca∶P分别为2∶1、1∶1、1∶2）,进行破骨细胞骨髓诱导培养。倒置显微镜观察细胞形态,于培养1、3d进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）计数,培养7d后扫描电镜观察象牙片吸收陷窝。结果显示,培养3d时试验组TRAP阳性细胞均多于对照组,差异极显著（P〈0.01）;试验2∶1组与1∶1组差异不显著（P〉0.05）,其余各组间均差异极显著（P〈0.01）;扫描电镜观察,象牙片吸收陷窝程度与钙磷比例大小（2∶1、1∶1、1∶2）成反比。当钙磷比例为1∶2时,破骨细胞数量最多,功能活跃。结果表明,鸭破骨细胞骨髓诱导培养体系已成功建立。     

伏马毒素B_1对人脐静脉血管内皮细胞的毒性作用研究

为探究伏马毒素B_1(FB_1)对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的毒性及作用机制,采用不同质量浓度的FB_1处理HUVEC,通过CCK-8法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期,荧光显微镜观察细胞氧化应激,流式细胞术检测线粒体膜电位变化,Hoechst33342染色检测细胞凋亡,荧光定量PCR检测细胞凋亡相关基因的转录情况。结果显示:FB_1处理组在低质量浓度(2.5、5μg·mL~(-1))短时间(6、12h)处理后细胞活力变化不显著,超过此剂量和时间细胞活力显著降低(P0.05或P0.01),且质量浓度为10、20μg·mL~(-1) FB_1处理组活性氧(ROS)的荧光信号增强;FB_1处理组细胞周期由G_0/G_1期向S期转换时阻滞,细胞线粒体膜电位降低,细胞凋亡相关基因Caspase-3转录升高,Bcl-2转录显著降低(P0.05),Caspase-9和Bax转录极显著升高(P0.01)。结果表明,FB_1对人脐静脉血管内皮细胞有毒性作用,能抑制细胞增殖,使细胞周期阻滞在G0/G1期;能通过线粒体途径诱导HUVEC凋亡。研究结果为深入研究FB_1对人类细胞的毒性作用机制及相关疾病治疗奠定基础。     

钙螯合羊骨胶原多肽抑制骨质疏松发生的RANK/RANKL/OPG信号机制

OPG/RANKL/RANK信号通路在破骨细胞形成过程中起着至关重要的作用,本研究将探讨钙螯合羊骨胶原多肽(SBCP-Ca)对骨质疏松(OP)发生的抑制作用及其基于OPG/RANKL/RANK信号通路的作用机制。通过摘除大鼠双侧卵巢建立OP模型,SBCP-Ca(100mg·mL~(-1))的灌胃剂量为10mL·(kg·d)~(-1),持续8周。试验期结束后,股骨远端干骺端扫描电镜观察结果表明OP造模成功。模型组大鼠血液中反映骨形成和吸收的PINP和β-CTx水平均极显著高于假手术组(P0.01),股骨中的钙含量和羟脯氨酸含量则极显著低于假手术组(P0.01)。SBCP-Ca组的血清PINP、β-CTx水平则与假手术组无显著差异(P0.05),股骨中的钙含量和羟脯氨酸含量极显著高于模型组(P0.01)。荧光定量PCR结果表明模型组股骨组织中RANK和RANKL相对转录水平均极显著高于假手术组(P0.01),骨质疏松对OPG的表达没有显著影响。SBCP-Ca组的RANK和RANKL极显著低于模型组(P0.01),OPG水平则极显著高于模型组和假手术组(P0.01)。以上结果表明:SBCP-Ca可有效抑制OP的发生,通过抑制RANK和RANKL表达,促进OPG表达的三重作用来抑制破骨细胞的形成和骨吸收活性。     

TNF-α/IL-1α机制对破骨细胞形成和活化的影响

为了探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)/鼠重组白介素-1α(IL-1α)是否能独立于RANKL/RANK/ OPG机制之外直接刺激破骨细胞(OC)的形成和活化.提取4周龄C57雌性小鼠脾细胞,加入鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)TNF-α(±IL-1α)进行体外培养,同时加入骨保护素(OPG)和可溶性NF-κB受体活化子配体(sRANKL)以区别RANKL/RANK/OPG机制.通过OC形态学观察、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、骨吸收陷窝方法鉴定OC的形成和活化水平.结果显示:TNF-α(±IL-1α)能诱导睥细胞融合产生TRAP阳性的多核细胞并在象牙片上产生吸收陷窝,加入OPG不能阻断其诱导破骨细胞形成和产生骨吸收陷窝.结果表明:在MCSF存在的情况下,TNF-α以一种独立于RANKL/RANK/OPG之外的机制诱导破骨细胞的形成和活化,而且IL-1α能显著促进TNF-α的诱导作用(P＜0.05).     

过表达TRPV6基因对小鼠破骨细胞钙转运基因与凋亡相关基因表达的影响

破骨细胞是体内唯一的骨吸收细胞,对钙离子跨细胞膜转运及维持正常血钙水平有非常重要的作用。瞬时性受体电位通道香草酸受体6(transient receptor potential vanilloid receptor 6,TRPV6)是TRP家族中的一员,对钙离子有高度选择性,且是钙离子跨细胞转运的限速门控通道。本试验旨在研究TRPV6过表达对破骨细胞钙转运相关基因及细胞凋亡相关基因表达的影响。用TRPV6过表达慢病毒载体(LV-TRPV6)转染培养7 d的破骨细胞构建TRPV6过表达破骨细胞模型,以阐释小鼠破骨细胞中TRPV6与钙离子转运和细胞凋亡的关系。将破骨细胞分为3组:空白对照组、阴性对照组和LV-TRPV6组。结果显示:与空白对照组比较,破骨细胞TRPV6过表达后钙离子转运相关基因(calbindin-D28K,NCX1) mRNA和蛋白表达水平显著增加(P0.05);破骨细胞TRPV6过表达后细胞凋亡相关基因mRNA和蛋白表达水平显著降低(Fas和Fas L除外)(P0.05)。流式细胞仪分析显示,LV-TRPV6组凋亡率显著下降6.33%±0.235%(P0.05)。研究表明,破骨细胞过表达TRPV6基因导致钙转运相关基因表达增加并抑制破骨细胞凋亡。     

酿酒酵母β-葡聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1表达的影响

为了探索β-葡聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞(ruminal epithelial cells,RECs)β-防御素-1(sheepβ-defensin-1,SBD-1)表达的影响。本研究首先建立绵羊RECs培养体系作为体外试验模型,用不同浓度(0、5、10、20、50和100μg·mL~(-1))的β-葡聚糖刺激RECs 8h后,利用qPCR和ELISA方法检测RECs中SBD-1的表达变化,选出诱导SBD-1表达最高的β-葡聚糖浓度。然后用β-葡聚糖的最佳刺激浓度对RECs分别刺激0、2、4、8、12和24h,同样利用qPCR和ELISA方法对RECs SBD-1的表达变化进行检测,从而筛选出诱导SBD-1表达最高的刺激时间。qPCR和ELISA结果显示,β-葡聚糖(5～100μg·mL~(-1))刺激RECs 8h后,SBD-1mRNA和蛋白的表达随着β-葡聚糖浓度的升高均呈现先升高后降低趋势,且当β-葡聚糖浓度为10μg·mL~(-1)时SBD-1mRNA和蛋白的表达量极显著高于对照组(P0.01)。当用10μg·mL~(-1)的β-葡聚糖刺激RECs 0～24h后,qPCR结果显示,10μg·mL~(-1)的β-葡聚糖刺激RECs 2h时SBD-1mRNA的表达量最高(P0.01),之后呈下降趋势,而ELISA结果显示,在β-葡聚糖浓度为10μg·mL~(-1)刺激RECs 4h后SBD-1蛋白分泌水平达到最高(P0.01)。MTT测定结果显示,100μg·mL~(-1)β-葡聚糖会对绵羊RECs活力产生显著的影响(P0.05)。本研究结果表明,β-葡聚糖能够提高绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1的表达,且用浓度为10μg·mL~(-1)的β-葡聚糖分别刺激RECs 2和4h后SBD-1的mRNA和蛋白表达达到最高。     

术芩提取液对脂多糖损伤的IPEC-J2细胞增殖及炎症因子转录的影响

为探究术芩提取液(Zhu Qin extractive fluid,ZQEF)对脂多糖(LPS)损伤的IPEC-J2细胞增殖及炎症因子转录的影响,采用薄层色谱法对ZQEF中主要活性成分进行定性鉴定,高效液相法测定黄芩苷含量。将IPEC-J2细胞随机分为空白组、LPS模型组、药物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组(各组ZQEF浓度分别为10~(-1)、10~(-2)、10~(-3)、10~(-4)、10~(-5)g·mL~(-1)),每组5孔,10~4个细胞·孔~(-1)。MTT法测定细胞增殖率,qRT-PCR测定TFF3、TNF-α和IL-8的mRNA转录变化。结果显示,ZQEF含有黄芩苷、黄芪甲苷和白术内酯Ⅰ,其中黄芩苷含量为1.469 8%;LPS模型组细胞增殖率降低,TFF3、TNF-α和IL-8的mRNA转录量显著增高,与空白组比较差异均极显著(P0.01);与LPS模型组比较,药物Ⅱ组(10~(-2)g·mL~(-1))和药物Ⅲ组(10~(-3) g·mL~(-1))细胞增殖率均增高,差异分别达到极显著和显著(P0.01和P0.05)水平,药物Ⅱ组TFF3和TNF-α的mRNA转录量降低,差异极显著(P0.01),IL-8的mRNA转录量降低,差异不显著(P0.05)。结果提示,ZQEF能促进LPS损伤的IPEC-J2细胞增殖,抑制炎症因子转录,推测与修复肠黏膜作用有关。