热纤梭菌内切葡聚糖酶在酿酒酵母细胞表面上展示研究

[目的]对热纤梭菌内切葡聚糖酶进行酿酒酵母细胞表面展示研究,探索降低纤维素酶成本和提高酶活的方法。[方法]通过提取产内切葡聚糖酶的热纤梭菌总DNA,根据热纤梭菌内切葡聚糖酶基因序列和酿酒酵母表面展示质粒载体pYD1上的多克隆位点设计引物,克隆内切葡聚糖酶目的基因,将其连接到酵母表面展示质粒载体pYD1上,构建重组质粒pYD1-CelA,并将其转化入酿酒酵母菌株EBY100中,经诱导表达后,测定表达产物的最适温度和pH,并分析影响其活性的金属离子种类和浓度。[结果]PCR扩增获得1 400bp左右的内切葡聚糖酶CelA基因片段,并成功构建了该基因与酵母表面展示质粒载体pYD1的重组质粒pYD1-CelA。重组质粒转化酿酒酵母菌株EBY100后,在鉴定培养基上测定透明圈的大小得出最佳诱导时间为60 h。表达产物性质的研究结果显示其最适反应温度为50℃,在pH 4.6时酶活性相对较高。[结论]该研究结果为后续对纤维素酶的进一步研究、改造、大量生产及应用奠定了一定的基础。     

玉米ZmPsaH基因真核表达载体的构建及转化

[目的]PsaH是光合系统Ⅰ(PSI)中的一个亚基,在植物光合系统中起着重要的作用.为研究玉米ZmPsaH基因在抗逆中的作用提供基础.[方法]构建玉米ZmPsaH基因真核表达载体是了解玉米中该基因功能的重要途径之一.利用RT-PCR技术扩增得到大小约为420 bp的玉米ZmPsaH基因,经限制性内切酶SalⅠ和NotⅠ进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP-5N连接,获得重组真核表达质粒ZmPsaH-5N.[结果]通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒ZmPsaH-5N构建成功.制备酵母感受态,将重组质粒电击转入酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功.[结论]成功构建了玉米ZmPsaH基因真核表达载体,并且成功转化了酵母.     

玉米ZmCPK12基因真核表达载体的构建及转化

[目的]CDPK是一类依赖于Ca2+而不依赖CaM及磷脂的蛋白激酶,或类钙调素结构域的蛋白激酶,是植物和低等动物所特有.研究为玉米CDPK基因家族在抗逆中的作用提供基础.[方法]构建玉米ZmCPK12基因真核表达载体是了解玉米中该基因功能的重要途径之一.实验利用RT - PCR技术扩增得到大小为1 533 bp的玉米ZmCPK12基因,经限制性内切酶SalI和NotI进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP -5N连接,获得重组真核表达质粒ZmCPK12 - 5N.[结果]通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒ZmCPK12-5N构建成功.制备酵母感受态,将重组质粒电击转人酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功.[结论]成功构建了玉米mCPK12基因真核表达载体,并且成功转化了酵母.     

盐穗木HcPS_H基因真核表达载体的构建及转化

[目的]盐穗木(Halostachys caspica)属藜科盐生植物,是广泛分布于新疆干旱或半干旱荒漠盐碱环境中的一种极端耐盐的多年生稀盐多汁半灌木,对盐分适应性极强.PS_H基因是一个参与光合反应光系统的基因,在植物光合作用中起着重要的作用.构建盐穗木HcPS_H基因真核表达载体对于了解该基因在盐穗木耐盐过程中的作用有着重要意义.[方法]利用PCR技术扩增得到大小为441 bp的盐穗木HcPS_H基因,经限制性内切酶SalI和NotI进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP-5N连接,获得重组真核表达质粒HcPS_H-5N.[结果]通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒HcPS_H-5N构建成功.制备酵母感受态,将重组质粒电击转入酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功.[结论]成功构建盐穗木HcPS_H基因真核表达载体,并且能在真核细胞中正常表达.     

多基因串联发酵木糖产乙醇重组菌株构建初探

[目的]解决酿酒酵母不能发酵或利用木糖的问题,以期选育出高效转化秸秆生产乙醇的菌株.[方法]将来自近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)的木糖还原酶基因(xyl1),热带假丝酵母(Candida tropicalis)的木糖醇脱氢酶基因(xyl2),树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的木酮糖激酶基因(xks1),以及酿酒酵母内源的转醛酶基因(tal1)和转酮酶基因(tkl1),通过串联共表达的方法构建到表达载体pAUR123上,构建了一株重组酿酒酵母.[结果]经过酶活性分析和Western blot蛋白免疫实验,证明转化子pAUR123-XL成功导入酿酒酵母并得到表达.以木糖为唯一碳源进行限氧发酵,能稳定利用木糖,木糖发酵结果表明:木糖的利用率为79.5;,乙醇产率为31;.[结论]构建的重组菌株能较好的利用木糖,为进一步的乙醇发酵提供了依据.     

酿酒酵母ARS304及其侧翼序列重组质粒的构建与鉴定

采用PCR扩增酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Ⅲ号染色体ARS304序列(S1)及以ARS304为核心上下游延伸1 kb的侧翼序列(S2),并将目的片段分别构建到酵母整合载体pRS405中,获得重组质粒pRS1和pRS2.质粒电转化试验发现重组质粒pRS2的转化率大于pRS1,说明ARS304侧翼序列能显著提高ARS304在酿酒酵母中自主复制的能力.     

密码子优化烟曲霉壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达

[目的]烟曲霉(Aspergillus fumigatus)壳聚糖内切酶基因(Chitosanase,EC.3.2.1.132)(csn)的高效表达研究。[方法]根据毕赤酵母密码子的偏爱性对壳聚糖内切酶的基因进行了优化,利用连续延伸PCR方法扩增全长csn基因,构建重组质粒pPIC9k-csn,将重组质粒pPIC9k-csn线性化后转化毕赤酵母GS115,分析重组蛋白的表达,测定其酶活性,并对其酶解产物成分进行分析。[结果]实现了密码子优化后的壳聚糖内切酶的高效表达,重组菌株比野生菌株所产的壳聚糖内切酶活性提高了近20倍。[结论]该研究成功实现了烟曲霉壳聚糖内切酶基因在毕赤酵母中的高效表达,为工业化大规模生产壳聚糖酶奠定了基础。     

新孢子虫NcGRA2基因真核表达质粒的构建及其在293细胞内的表达

[目的]为了构建新孢子虫NcGRA2基因的真核表达载体,探讨重组载体在体外细胞的表达.[方法]从含有NcGRA2基因的重组质粒pGEX-4T1-NcGRA2中,用限制性内切酶进行酶切获得带有粘性末端的NcGRA2基因片段.经琼脂糖凝胶电泳切胶回收NcGRA2基因片段,与pcDNA3.1载体连接.将构建的真核表达质粒pcDNA3.1-NcGRA2转染到293细胞中表达.[结果]经酶切分析和序列测定,证实了重组质粒的正确连接.经免疫荧光抗体试验验证pcDNA3.1-NcGRA2能在293细胞中表达NcGRA2蛋白.[结论]获得重组质粒pcDNA3.1-NcGRA2,并能在体外细胞中表达NcGRA2蛋白,为进一步研究核酸疫苗的动物免疫试验奠定了基础.     

黑曲霉糖化酶基因的克隆及其在毕赤酵母X33中的表达

[目的]以毕赤酵母（Pichia pastoris）X33为宿主菌高效表达黑曲霉（Aspergillus niger）糖化酶,为进一步扩大糖化酶在工业上的应用奠定基础。[方法]利用RT-PCR技术,提取黑曲霉总RNA进行反转录,以得到的cDNA为模板,根据NCBI数据库中A.nigerCBS513.88糖化酶的cDNA序列（glaA）设计引物,通过PCR扩增得到去除天然信号肽的糖化酶成熟肽编码基因glaAm,并将其克隆到pUC19载体中,序列分析表明,glaAm的开放阅读框由1 879个核苷酸组成,编码625个氨基酸。以此片段构建了pFLDα-glaAm重组表达载体,经NsiI线性化后,电击转化毕赤酵母X-33。摇瓶培养中通过添加终浓度为0.5%的甲醇诱导糖化酶的分泌。[结果]SDS-PAGE和Starch-PAGE显示,糖化酶得到正确的分泌表达,且具有较高的生物活性,发酵上清液中酶活最高达到380.78 U/ml（发酵液）。重组糖化酶的最适反应温度和最适pH分别为6065℃和4.0,在pH2.55.5范围内均保持90%以上的酶活力。该酶具有较高的热稳定性,pH4.0条件下,该酶在50℃下稳定;60℃处理60 min,仍能保持90%以上的酶活力;65℃下的半衰期约为44 min。[结论]黑曲霉糖化酶基因在毕赤酵母X33中得到了异源高效表达。     

源于Paecilomyces sp. FLH30内切β-1,3(4)葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

[目的]β-1,3(4)-葡聚糖酶是一种重要的工业用酶,广泛地应用于饲料业、酿造业及纺织业.[方法]以来源于Paecilomyces sp.FLH30的葡聚糖酶基因为研究对象.据毕赤酵母GS115对密码子的简并性和偏爱性,对来源于淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)β-1,3(4)-葡聚糖酶基因进行了优化,通过全基因技术合成了全长基因GLUnm并构建重组酵母表达载体pPIC9K-GLUnm,用SacI线性化重组质粒pHC9K-GLUnn,电击转化至毕赤酵母GS115中进行表达.[结果]通过表型筛选,遗传霉素抗性筛选,经PCR鉴定表明,葡聚糖酶基因整合至酵母染色体DNA中.在试管中经甲醇诱导表达,并测定葡聚糖酶酶活性.在试管水平表达的酶活性是0.68 IU/mL,即可以认为在摇瓶表达水平的初始酶活性为0.68 IU/mL,将此菌株在摇瓶水平表达,酶活性在表达84h为最高,是11.26 IU/mL.[结论]重组β-1,3(4)-葡聚糖酶的最适pH为5.0,最适反应温度为50℃,在pH 5.0 ～8.0,温度37～50℃的条件下较稳定.     

酿酒酵母与糖化酵母的核倍性融合株的构建

在探讨原生质体制备、融合及再生条件的基础上，采用聚乙二醇（ＰＥＧ）对耐高温的酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＨＵ－ＴＹ－１Ａ菌株和淀粉发酵力最强的糖化酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｄｉ－ａｓｔａｔｉｃｕｓ）５２０６－１Ｂ菌株进行种间或同株间的原生质体融合，获得了数株ＨＵ－ＴＹ－１Ａ和５２０６－１Ｂ的同株以及种间融合株，融合率为（１．３～９．０）×１０￣（－６）．通过测定融合株的细胞体积大小、ＤＮＡ含量、遗传稳定性和营养要求等表明：融合株细胞体积和ＤＮＡ含量约为两亲株之和；种间融会株具有双亲株的遗传特性；融合株的倍性为２ｎ，３ｎ，４ｎ及５ｎ。     

耐高渗蜂蜜酒酵母的选育

根据酵母菌的生理特性,通过改变酵母的生长和繁殖条件,即通过逐渐提高培养液浓度,将中国科学院微生物研究所的As2612,As2614,As2400,As2420 4种酵母分别定向驯化成DP_1,DP_2,DP_3,DP_4 4株耐高渗的适宜酿制蜜酒的酵母。发酵力对比试验和酿制蜂蜜酒比较试验表明:DP酵母的发酵力显著提高,发酵蜜酒的周期缩短了1/2以上。     

复合载体对啤酒酵母细胞的固定化效果

以海藻酸钠-琼脂为复合载体,用包埋法对啤酒酵母细胞固定化.将固定化的啤酒酵母发酵液体培养基,以酒精度为指标,对细胞固定化条件进行了单因素试验.通过正交试验确定了细胞固定化的最佳制备条件.结果表明,固定化的最佳条件为载体浓度1.4g·40mL-1,复合载体之间比例1:1,温度46℃.     

基因敲除GCV2的酿酒酵母构建

[目的]构建低甲醇生成的酿酒酵母工程菌用于酿造低甲醇酒。[方法]利用基因敲除技术,敲除酵母代谢甘氨酸生成甲醇途径的甘氨酸裂解酶系的基因GCV2。[结果]成功构建出基因敲除GCV2的工程酵母L5,用L5酿造酒中的相对甲醇含量为131 mg/L,比初始菌株的192 mg/L降低31%。[结论]利用基因敲除GCV2的工程酵母菌可有效减少酒中由甘氨酸代谢生成甲醇的量。     

利用双乙酰和苯磺隆抗性选育低双乙酰啤酒酵母

采用双乙酰和苯磺隆抗性处理结合双乙酰驯养方法,选育低双乙酰啤酒酵母。结果表明:获得的目标菌株YZB、YZD经小型放大试验双乙酰峰值为0.36mg·L-1,比对照的原菌株下降42%-44%,发酵14d后双乙酰含量为0.07-0.08mg·L-1,真正发酵度为65.8%-66.1%,其他发酵性能基本保持不变,连续转接7代后遗传性状稳定。     

酿酒酵母原生质体形成和再生的研究

用正交实验分析了影响酿酒酵母原生质体形成和再生的原因,发现主要是稳定剂种类和酶浓度,在本实验系统中以１７％稳定剂,１％蜗牛酶３０℃作用６０ｍｉｎ为最佳实验条件。     

酿酒酵母与甘氨酸发酵生成甲醇关系的研究

[目的]研究确定甘氨酸与酿酒酵母生成甲醇的数量关系。[方法]采用高效液相色谱法测定发酵液中甘氨酸含量和顶空气相色谱法测定酒中甲醇含量。[结果]发酵液中甘氨酸浓度在0～0.9 g/L范围内与酿酒酵母生成甲醇的量成线性关系,线性方程:Y=103.3X-4.5。[结论]确定了发酵液中甘氨酸与酿酒酵母生成甲醇的对应关系。     

麦角甾醇对酿酒酵母乙醇产率和耐受性的作用

研究了培养基中添加不同浓度的麦角甾醇对酿酒酵母生长、乙醇生产和乙醇耐受性的影响。麦角甾醇添加浓度依次为0(对照组)、10、20、30、40和50mgL-1。结果显示,添加20和30mgL-1的麦角甾醇能较快的促进细胞的生长,是对照组生长速率的1.06和1.15倍;当麦角甾醇浓度为20、30和40mgL-1时,与未添加麦角甾醇组相比,乙醇产量提高了10.1%～23.5%;然而,在整个实验过程中观察到麦角甾醇在对乙醇耐受性方面的作用不显著。通过此次单因子实验,麦角甾醇在发酵培养基中的推荐剂量为20～30mgL-1。     

南阳酵母原生质体制备与再生条件研究

研究南阳酵母原生质体形成与再生的最佳条件。获取原生质体采用酶法,再生采用双层高渗平板法,因素重要性分析采用正交试验。结果表明:菌龄10h,以2.0%蜗牛酶加0.5%纤维素酶的混合酶液进行酶解破壁,酶解温度30℃,酶解时间2.5h,以0.6mol.L-1蔗糖做再生培养基的渗透压稳定剂,原生质体形成率91.40%,再生率10.56%。不进行预处理,在试验条件下,对南阳酵母原生质体形成与再生影响因素依次为:菌龄>酶解时间>酶浓度>渗稳剂。     

布拉酵母高密度培养条件的研究

[目的]对布拉酵母菌(Saccharomyces boulardii)的高密度培养条件进行研究。[方法]以布拉酵母为试验菌株,通过分批发酵和流加培养筛,分别测定温度、pH、溶氧(DO)、起始葡萄糖浓度、残糖浓度及氨基氮浓度对布拉酵母生长代谢的影响。[结果]试验确定布拉酵母高密度培养的最佳工艺为:培养温度30～32℃,pH 5.0,溶氧30%,初始葡萄糖浓度30 g/L,培养过程中通过流加补料维持发酵液中葡萄糖浓度为0.5 g/L、氨基氮浓度为40 mg/L。在此条件下培养24 h后细胞干重最高可达56.6 g/L,细胞得率为42.4%。[结论]该研究对布拉酵母活菌制剂的生产制备具有重大参考价值。