鱼类胚胎干细胞研究进展

胚胎干细胞(Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ,ＥＳ细胞)是从动物早期发育胚胎内细胞团或原始生殖细胞分离得到的一种未分化的永久性细胞系,它一方面保留了所有的发育潜力,在适合的条件下,能够分化成多种类型的细胞、组织。将ＥＳ细胞移植到动物囊胚后,它可以参与宿主胚胎各种组织的构成,形成嵌合体,直至达到种系嵌合,遗传给后代;另一方面,人们可以对ＥＳ细胞的基因组进行各种遗传操作,包括随机引入外源基因到ＥＳ细胞基因组中,或通过同源重组,定点引入外源基因到ＥＳ细胞基因组中或破坏基因组中某一特定的靶基因;通过细胞移植或核移植技…     

南方鲶胚胎细胞培养及其细胞周期特性检测

南方鲶晚期胚胎细胞经原代和传代培养４０次，历时３６个月建立了上皮型细胞系（ＳＭ）。该细胞系表现低世代生长缓慢，每代时间随代龄增加而减少，经ＦＭＦ测定：Ｇ１期细胞占７０．％－８５．６％；Ｓ期细胞占１２．２％－２５．３％，Ｇ２＋Ｍ期细胞占１．６％－４．６％，由３０代到４０代Ｇ２＋Ｍ细胞增加了一倍多，ＳＭ细胞能在１－４℃冰箱长期存活并可保持繁殖能力达１３个月。     

漠斑牙鲆胚胎细胞系的建立与鉴定

漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma)是中国近年新开发的重要海水养殖鱼类,本研究以漠斑牙鲆囊胚期胚胎为材料,探索了鱼类胚胎细胞分离和培养的条件,建立了漠斑牙鲆胚胎细胞培养技术。建立的漠斑牙鲆胚胎细胞系(SFEC)至今已经培养了240多天,传至80多代。SFEC的完全培养基采用添加抗生素、胎牛血清(FBS)、花鲈血清(SPS)、成纤维生长因子(bFGF)的DMEM。SFEC形态小而呈圆形、多边形,在培养基中生长迅速。本实验检测了温度、胎牛血清浓度、成纤维生长因子对SFEC生长的影响。在24~30℃之间SFEC生长良好,但当温度低于18℃时细胞生长速度明显减慢。在含15?S的培养基中,SFEC生长速度明显比在含7.5?S的培养基中快,在培养基中添加bFGF可以使细胞生长速度显著提高。SFEC的二倍体核型为2n=6st 42t。将GFP报告基因通过脂质体介导的方法转入SFEC中并成功地获得了表达,转化率为20%。     

Towards obtaining long term embryonic stem cell like cultures from a marine flatfish, Scophtalmus maximus

Culturing pluripotent embryonic stem cells represents a unique model system for in vitro studies of embryo cell growth and differentiation, and represents a connection between in vitro and in vivo manipulation of genes. To further develop and refine stem cell technology for marine fish, we have established cultures of embryonic stem cells isolated from turbot blastulas. The pluripotent nature of our turbot-ES-like cells was supported by their morphology and elevated levels of alkaline phosphatase enzyme activity, their ability to remain undifferentiated for a prolonged culture period, their spontaneous differentiation potential in vitro and their ability to form embryoid bodies (EB) in response to changes in the extracellular environment. In addition, we show that turbot ES like cells express Oct-4 required for the maintenance of pluripotency of ES cells. Cells from 100 blastulas (>10⁵ cells/well) were seeded into gelatine coated 24 well cell culture clusters. The cells were polygonal in shape, with dense cytoplasm and large nuclei. The ES-like cells formed colonies within 24 h following seeding, multilayered in a pyramidal fashion, with maximum cell densities in the middle. The cells proliferated vigorously when seeding densities were high and the cells still had not attached to the gelatine-coated surface. Most of the cells became attached to the surface 48 h following seeding. Attached cells grew more slowly and 20% of the plated colonies could be kept stable for 60 days. Eventually, most of the cultures showed extensive differentiation or died. Only a few cultures (4–5%) survived prolonged culturing (>2 months). The cells were stained for alkaline phosphatase activity, a marker of pluripotency and showed intense staining. More specific, turbot ES like cells in culture expressed Oct-4, detected by immunofluorescence staining. Changing the medium conditions by adding retinoic acid and removing LIF, the proportion of embryoid bodies in our cultures increased. ES-like cells as well as fresh, intact fertilised eggs where successfully cryopreserved. ES cells from the cryopreserved eggs could be isolated and seeded into cultures, forming colonies like the cells from freshly fertilised eggs. Also cryopreserved ES-like cells could be successfully plated. The prolonged survival of these cryopreserved cells has not yet been investigated. The establishment of in vitro cultures of turbot ES-like cells represents a new experimental model for marine flatfish. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

臭氧对斜带石斑鱼胚胎发育和初孵仔鱼的毒性效应

为了评价臭氧消毒技术及其对石斑鱼(Epinephelus)潜在的毒性, 首先评价了两种质量浓度(0.05 mg/L和0.30 mg/L)臭氧对亚硝酸盐和弧菌的水处理效果, 并以斜带石斑鱼(E. coioide)受精卵为实验材料, 探讨臭氧对胚胎发育和初孵仔鱼的毒性作用。结果显示, 臭氧的水处理效果良好, 0.30 mg/L的臭氧在3 h内对水中亚硝酸盐的去除率可达72.29%; 0.05 mg/L的臭氧处理20 min后也能完全杀灭弧菌。但高浓度臭氧(0.30 mg/L)对胚胎发育具有一定的毒性, 会造成胚胎油球数目增多、萎缩、解体和死亡, 而低浓度组(0.05 mg/L)臭氧处理后22 h胚胎孵化率高达(87.14±7.20)%, 与对照组无显著差异。与胚胎相比, 初孵仔鱼对臭氧更加敏感, 0.05 mg/L的臭氧处理24 h也会导致初孵仔鱼的全部死亡。本研究结果旨在为石斑鱼育苗及养殖过程中正确使用臭氧消毒技术提供重要的数据参考和理论依据。

     

卵形鲳鲹的早期胚胎发育

对人工繁殖的卵形鲳鳆（Trachinotus ovatus）受精卵的胚胎发育过程进行了连续观察。受精卵由人工养殖的性成熟亲鱼，经人工催产、自然产卵受精获得。卵形鲳鲮的成熟卵呈圆形，平均卵径为967．8μm。受精卵在水温18～21℃、盐度31的条件下，胚胎发育历时41h27min后孵出仔鱼。胚胎发育为盘状卵裂，胚体后期的发育速度较快；仔鱼脱膜孵化的速度非常快，基本上在1min内就可以完成。初孵仔鱼平均全长为1．548mm，卵黄囊较大。     

小体鲟胚胎发育特征观察

观察了水温(18±1)℃条件下,小体鲟(Acipenser ruthenus Linnaeus)的胚胎发育特征。结果显示:成熟小体鲟卵圆球形、黑色、不透明,为粘性卵,卵径2.2～2.8 mm。水温(18±1)℃条件下,小体鲟受精卵历时110 h孵化出膜,所需总积温为2023～2308℃·h。小体鲟受精卵的卵裂方式为特殊的辐射状卵裂;原肠中期时动物极细胞覆盖胚胎三分之二;心跳期,心脏呈C型;尾端接近心脏时,眼囊内已经有色素沉着。根据胚胎发育过程的形态特征,可将小体鲟胚胎发育过程分为受精卵、卵裂、囊胚、原肠、神经胚、器官发生和出膜7个连续阶段,34个时期。另外,本研究还将小体鲟胚胎发育和鲟形目其他鱼类胚胎发育特征进行了对比分析。     

河川沙塘鳢胚胎发育的研究

对河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila Günther)的胚胎发育进行研究.结果显示:河川沙塘鳢胚胎发育可分成受精卵、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、体节分化、腮和出膜等8个阶段.根据每个阶段的形态建成和发育特点,卵裂阶段被细分为2～32细胞期和桑葚期,囊胚阶段分为囊胚早期、中期和晚期,原肠阶段分为原...     

星点东方纯胚胎发育的观察

为探讨星点东方鲀(Takifgu niphobles)作为海水鱼遗传生物学和鱼类行为学研究实验动物的可行性提供科学依据,选取北戴河海域自然成熟的星点东方鲀亲鱼,经人工催产授精,受精卵在水温20. 0～21. 0℃条件下,于300 L玻璃钢水槽循环水中孵化。参考暗纹东方鲀(Takifugu obscure)、青鳉(Oryzias layioes)和斑马鱼(Barchydanio rerio var)胚胎发育分期形态指标,按分裂球数目、大小,胚盘形状、延展、下包,神经系统发育,体节数目,视觉和听觉器官的发育以及血液循环系统的不同发育阶段,记录了星点东方鲀完整的胚胎发育过程。研究结果表明,星点东方鲀受精卵卵径约为756～863μm,胚胎发育可分为33期,主要分期与对应时间点为:2细胞期:受精后1 h 40 min;囊胚期:受精后8 h 6 min;原肠期:受精后13 h 48 min;心脏原基期:受精后58h 45 min;孵化期:受精后99 h 31 min;初孵仔鱼期:受精后108 h 31 min。值得注意的是,在32细胞期,观察到了与青鳉相同的边缘细胞和部分水平分裂。本实验中的星点东方鲀卵径在东方鲀属鱼中是最小的,也明显小于日本的星点东方鲀。本研究星点东方鲀胚胎发育不仅快于暗纹东方鲀和红鳍东方鲀(Takifgu rubripes),而且大大快于日本种群。     

黑莓鲈胚胎发育观察及温度对胚胎发育的影响

对黑莓鲈(Pomoxis nigromaculatus)的胚胎发育进行了连续跟踪观察,并探讨了水温对其胚胎发育的影响.结果表明:水温(24±1)℃时,孵化时间为40.23 h;胚胎发育的温度系数Q10值为2.01,适宜胚胎发育的温度范围为22℃ ～24℃;孵化温度与孵化时间呈负相关关系;温度与孵化率的回归方程式为:y=25.899x-0.5 407x2-216.92 (R2 =0.9217);温度与畸形率之间的回归方程式为:y=0.5496x2-22.857x +236.44 (R2=0.9422);胚胎发育生物学零度为10.22℃,有效积温为(545.14±22.60)～(554.42±22.74)℃·h.     

斑鱾胚胎发育初步观察

通过对人工网箱养殖4年的斑鱾(Girella punctata Gray)亲鱼进行LHRH-A3激素催产,获得自然产卵的受精卵,于实验室中进行培育孵化,连续观察斑鱾胚胎发育的全过程。实验结果表明,斑鱾受精卵呈圆形,卵径0.882±0.041 mm、卵黄直径0.807±0.036 mm,具1个圆形油球,油球径为0.266±0.023 mm。在孵化水温23±0.5℃、盐度33.8条件下历时28 h 20 min完成整个胚胎发育过程,初孵仔鱼全长1.574±0.109mm。胚胎发育过程可划分为6个阶段,即受精卵、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期和器官形成期,包括27个发育时期。实验旨在了解斑鱾的胚胎发育规律,为开展斑鱾的人工繁殖提供基础资料。     

拟目乌贼的胚胎发育

采捕野生拟目乌贼进行室内培育,利用显微成像系统观察其胚胎发育过程.结果表明,拟目乌贼受精卵乳白色,半透明,呈椭圆形,乳头状,一端呈圆环状套住附卵基质,如葡萄般成串有规律地聚集一起.刚产出的受精卵长径为(39.7±1.7) mm,短径为(17.1±1.1) mm,体质量为(4.3±0.2)g.胚胎呈椭圆形,长径(8.85±0.41) mm,短径为(7.74±0.54) mm.在水温为27℃,盐度为30条件下,孵化第10天卵粒变得最小,长径为(27.2±0.6) mm,短径为(13.3±0.6)mm,体质量为(2.02±0.02)g.第11天后受精卵开始膨大,孵化前受精卵长径为(32.7±0.8) mm,短径为(19.3±0.6)mm,体质量为(4.68±0.02)g.胚胎发育分为11个阶段:受精卵期、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、胚体形成期、器官形成期、红珠期、心跳出现期、色素出现期、内骨骼形成期和孵化期.胚胎发育历时20 d,初孵乌贼胴长(8.1±0.2)mm,胴宽(6.1±0.2) mm,体质量(0.18 ±0.02)g.     

东方扁虾胚胎发育的观察

东方扁虾的胚胎发育包括以下九个阶段：卵裂期、囊胚期、原肠胚期、卵内无节幼体期、五对附肢期、胸部附肢发生期、复眼色素形成期、近孵化期和孵化期。东方扁虾胚胎复眼的色素斑随胚胎发育的进程而增大。与日本龙虾和中国龙虾不同的是,东方扁虾整个胚胎发育未能观察到第一颚足。     

黄鳝的胚胎及胚后发育

将黄鳝的受精卵静水控温孵化后,经活体解剖和透明处理,记录黄鳝孵化时序,显微观察并拍摄黄鳝胚胎发育及胚后发育过程的形态特征。黄鳝卵圆球型,橙黄或淡黄色,沉性,卵粒重25～38mg,卵径1.7～3.1mm。受精吸水3～5min膨胀后,卵径增大至3.0～3.7mm。黄鳝出膜时全长15～21mm,卵黄吸收完成时,全长25～35mm。黄鳝胚胎发育过程中出现具有丰富的微血管分布的胸鳍。胸鳍在胚体出膜后卵黄囊完全消失前退化。在温度26℃时,胚胎发育所需时间为168h,所需积温“度·时”值为4368;在温度32℃时,胚胎发育所需时间为144h,所需积温“度·时”值为4608。在温度32℃时,胚后发育所需时间(从出膜至卵黄全部吸收)为216h,所需积温“度·时”值为6912。26～30℃是黄鳝卵适宜的胚胎发育温度。     

牙鲆的胚胎发育

在牙鲆胚胎玻璃化冷冻中,为了准确选择胚胎的冷冻时期,掌握胚胎发育进程,同时为牙鲆苗种培育提供一定的依据,对海水工厂化养殖牙鲆的胚胎发育进行了研究。牙鲆受精卵培养在14-16℃、盐度29．9的海水中,利用Olympus显微镜对牙鲆胚胎发育过程连续观察,对各个胚胎时期的发育时间进行了记录,并对每一时期的特征用Olympus照像机进行了拍摄。实验记录了从受精卵到出膜后5d的29个具体发育时期的特征和发育时间,拍摄了30张具有代表性的胚胎和鱼苗图片,将牙鲆胚胎发育划分为卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、肌节期、尾芽期、心跳期、胚体转动期、出膜前期、出膜期10个连续的典型时期。在此培养条件下牙鲆胚胎历时93h完成整个胚胎发育,孵化出膜,再经96h的胚后发育卵黄囊完全吸收,之后进入变态期,向成鱼转化。     

曼氏无针乌贼胚胎发育的初步观察

将曼氏无针乌贼受精卵卵膜剥离,在显微镜或解剖镜下观察胚胎发育的全过程,结合室内人工育苗的孵化技术进行探讨。曼氏无针乌贼卵为粘性卵,呈黑色,类型属端黄卵,卵膜属三级卵膜,卵裂类型为不全卵裂,囊胚呈盘状,发生类型为直接发生型。在水温为23.8～26.2℃、盐度29.3时,最快14d孵出幼体,最慢23天孵出幼体,孵出幼体高峰期为18～21d,高峰期的孵出量占总孵出量的79.4%,孵化率为83.1%。胚胎发育速度与温度高低（20～30℃）成正比,盐度低于22对孵化率有严重影响。     

鳡的人工繁殖技术与胚胎发育

于2003年至2006年,在浙江湖州市锦山鱼种场进行了鳡的亲鱼培育及人工繁殖的研究。结果表明:2龄野生鳡在池塘中经3年专塘培育后,雌雄鱼的性腺成熟率达100%;性腺成熟的亲鱼经催产,产卵率达100%、受精率86.5%、孵化率88.3%。与此同时,对鳡的胚胎发育作了详细观察。鳡受精卵在21~23℃下孵化至出膜,有效积温为705.34℃.h。     

裸体异鳔鳅(鱼它)人工繁殖与胚胎发育研究

为了解裸体异鳔鳅(鱼它)(Xenophysogobio nudicorpa)人工繁殖和胚胎发育规律，以从金沙江采集到的10尾雌鱼(平均体长17.5 cm,体质量22.3 g)、8尾雄鱼(平均体长15.6 cm,体质量17.5 g)作为亲本，分3批次开展了人工繁殖试验，并观察在水温(20.0±0.5)℃下该鱼的胚胎发育情况。试验结果显示：在水温(15.0±0.5)、(18.0±0.5)、(20.0±0.5)℃的条件下催产，催产剂(雌鱼第1针注射LHRH-A₃ 2μg/kg,第2针注射LHRH-A₃ 10μg/kg+HCG 1 200 IU/kg+PG 8 mg/kg,间距12 h;雄鱼不注射)的效应时间分别为21、15、14 h,受精率分别为8.5%、76.8%、74.5%。将受精卵在水温(15.0±0.5)℃条件下孵化288 h,大部分仔鱼未能正常出膜；当水温升至(18.0±0.5)℃,大部分仔鱼在孵化168 h后破膜而出，但仍有小部分无法正常出膜；当水温升至(20.0±0.5)℃时，仔鱼正常出膜，且出膜时间缩短至120 h。裸体异鳔鳅(鱼它...     

眼斑双锯鱼胚胎发育的形态学观察

在实验室水温26±1℃、盐度28±1的条件下,对眼斑双锯鱼(Amphiprion ocellaris)胚胎发育过程中的形态学变化和时间进行了观察研究。结果表明,眼斑双锯鱼受精卵属一端带有附着丝的沉性卵,呈长椭圆形,长径2.0±0.1 mm,短径0.95±0.1 mm;其卵裂方式为端黄卵盘状卵裂;胚胎发育可分为10个主要阶段:卵裂前期、卵裂期、囊胚期、原肠期、神经胚期、体节期、翻转期、血管形成期、器官形成期和孵化期。发育过程中胚胎的颜色逐渐加深,呈现由橙黄色到棕黄色的变化;在26℃水温条件下,整个胚胎发育过程需200 h左右。