不同营养水平日粮对陕北白绒山羊生长性能和小肠组织SLC7A7、SLC3A1及SLC15A1 mRNA表达的影响

本试验旨在研究日粮营养水平对断奶后2~6月龄陕北白绒山羊生长性能及小肠组织中与氨基酸转运吸收相关的SLC7A7、SLC3A1和SLC15A1 mRNA表达的影响。选取健康、日龄（（60±1.60）d）和体重（（10.73±1.03）kg）相近的雌性陕北白绒山羊羔羊36只，随机分为4组，分别饲喂4种试验日粮，其消化能和粗蛋白质水平分别为标准日粮的85%、100%、115%和130%。标准日粮营养水平参考肉羊饲养标准NY/T816-2004，依据生长阶段（10~19 kg、15~27 kg）和目标增重设置。试验期间，分别于120和180日龄称重，于180日龄，每个重复屠宰1只试验羊，采集十二指肠中上部、空肠中段、回肠末端组织样品，通过实时荧光定量PCR检测SLC7A7、SLC3A1和SLC15A1表达水平。结果表明：1）第一阶段（60~120 d）115%水平组平均日增重显著高于其他三组（P<0.05），第二阶段（121~180 d）115%水平组平均日增重显著高于85%和100%水平组（P<0.05），与130%水平组无明显差异。两阶段115%水平组羔羊干物质采食量极显著高于其他3组（P<0.01）。两阶段料重比115%水平组显著低于85%、100%水平组（P<0.05）。2）相同营养水平下，SLC7A7和SLC15A1 mRNA的表达丰度顺序均为回肠>空肠>十二指肠；3）随日粮营养水平的增加，SLC7A7、SLC3A1和SLC15A1 mRNA在小肠各段的相对表达量呈先上升后下降的趋势，且115%水平组表达量最高。115%水平组SLC7A7和SLC15A1 mRNA相对表达量显著高于其他3组（P<0.05）；115%水平组SLC3A1 mRNA的相对表达量显著高于85%和130%水平组组（P<0.05）。本试验条件下，与其他营养水平组相比，115%水平组陕北白绒山羊羔羊在2~6月龄生长性能最佳，SLC7A7、SLC3A1和SLC15A1 mRNA在小肠各段的表达量最高。     

猪胎盘营养转运相关基因在不同妊娠期的表达

【目的】探究不同妊娠时期猪胎盘的氨基酸、葡萄糖、脂肪酸转运体的表达模式。【方法】选择15头遗传背景、产仔数接近的杜洛克2~4胎经产健康母猪平均分为3组,所有母猪发情后使用相同公猪精液进行人工授精,在妊娠第40天(D40)、65天(D65)和95天(D95)通过麻醉分别取出每组母猪子宫,快速打开子宫分离出每个胎儿的胎盘组织,提取胎盘组织总RNA并反转录合成cDNA,利用合成的引物进行普通PCR扩增,用2.0%琼脂糖凝胶检测扩增产物。采用实时荧光定量PCR检测并比较3个时期胎盘中氨基酸、葡萄糖、脂肪酸转运体相关基因mRNA相对表达水平。【结果】PCR检测结果显示,氨基酸转运体相关基因(SLC7A1、SLC7A2、SLC7A3、SLC7A4、SLC7A10、SLC1A3、SLC1A5、SLC38A10、SLC36A1)、葡萄糖转运体相关基因(SLC2A1、SLC2A2、SLC2A3、SLC2A10、SLC2A12、SLC2A13)及脂肪酸转运体相关基因(FATP1、FATP2、FATP3、FATP4、FABP3、FABP5、FABP7、CD36)的片段长度均与预期相符。实时荧光定量PCR结果显示,在氨基酸转运体中,D65胎盘中SLC7A4、SLC7A10、SLC38A10基因表达水平显著高于D40胎盘(P＜0.05),而SLC7A2基因表达水平显著低于D40胎盘(P＜0.05),且D65胎盘的SLC1A3和SLC7A4基因表达水平均显著低于D95胎盘(P＜0.05);在葡萄糖转运体中,D65和D95胎盘的SLC2A3和SLC2A13基因表达水平显著高于D40胎盘(P＜0.05),D95胎盘的SLC2A1、SLC2A2和SLC2A12基因表达水平显著低于D65胎盘(P＜0.05);在脂肪酸转运体中,D65胎盘的FATP2、FATP4、FABP3、FABP5、FABP7和CD36基因表达水平显著高于D40胎盘(P＜0.05),而FATP1、FATP4和CD36基因表达水平显著低于D95胎盘(P＜0.05)。【结论】在猪妊娠过程中,胎盘中SLC7A10、SLC38A10、SLC7A4、SLC2A3、FATP1、FATP4、FABP5、CD36等基因可能是影响胎儿生长发育的重要营养转运基因。     

山羊RPL27A基因克隆及组织表达特性分析

为研究山羊核糖体蛋白L27A （ribosome protein L27A，RPL27A）基因结构及其相关的生物学功能，试验采集简州大耳羊的14种组织样品（心脏、肝脏、脾脏、背最长肌、皮下脂肪等），利用RT-PCR扩增并克隆获得山羊RPL27A基因序列，通过在线工具进行生物信息学分析；采用实时荧光定量PCR技术检测RPL27A基因在各个组织及不同分化阶段的皮下前体脂肪细胞中的表达水平。结果显示，山羊RPL27A基因CDS区长447 bp，可编码148个氨基酸。生物信息学分析表明，RPL27A基因在不同的物种间具有较高的保守性，RPL27A蛋白是不稳定的亲水碱性蛋白，其与脂代谢及脂肪沉积相关的RPS18、RPL26、RPL34、RPL32、RPL37A等核糖体蛋白存在相互作用，RPL27A蛋白没有跨膜结构域，且无信号肽，亚细胞定位表明其主要存在于细胞质中。实时荧光定量PCR结果显示，RPL27A基因在山羊心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、背最长肌、皮下脂肪等14种组织中均有广泛表达，且在瘤胃中表达水平最高，在臂三头肌和股二头肌中也存在较高的表达水平，均显著高于其他组织（P<0.05）；RPL27A基因在成脂诱导60 h的山羊皮下脂肪细胞中的表达水平显著高于分化前（P<0.05）。本研究成功克隆了山羊RPL27A基因CDS序列，并揭示了RPL27A基因在山羊14种组织中的表达特性，研究结果可为阐明RPL27A基因对山羊脂肪细胞分化的调控机制提供材料。     

山羊y~+L碱性氨基酸转运系统转录水平表达的研究

旨在研究山羊y+L碱性氨基酸转运系统中4F2hc、y+LAT1和y+LAT2mRNA表达的组织特异性及其在不同年龄山羊小肠中的发育性表达规律。试验选取健康、体重相近的1日龄、6月龄、8月龄、10月龄、12月龄陕北白绒山羊各3只,共15只,屠宰后采集心、肝、肾、大脑、背最长肌、体侧皮肤、瘤胃、十二指肠、空肠、回肠和结肠组织,利用实时荧光定量PCR技术检测4F2hc、y+LAT1和y+LAT2mRNA在1日龄山羊上述组织和全部山羊十二指肠、空肠和回肠的表达情况。结果表明,(1)4F2hc、y+LAT1和y+LAT2mRNA在1日龄山羊多种组织中均有表达,且有一定的组织特异性。其中,4F2hc mRNA在皮肤表达量最高,y+LAT1 mRNA在回肠表达量最高,y+LAT2mRNA在大脑和回肠表达量最高。(2)4F2hc mRNA在山羊十二指肠、空肠和回肠表达量均以1日龄山羊为最高,其他月龄山羊相同肠段之间表达量无显著差异(P0.05);y+LAT1mRNA在十二指肠、空肠和回肠表达量随山羊年龄的增加均呈现逐渐降低的趋势;y+LAT2mRNA在十二指肠、空肠和回肠表达量随山羊年龄的增加呈现先升高后降低的趋势,其在10月龄山羊表达量最高;y+LAT2mRNA在回肠表达量以1日龄山羊为最低,其他月龄山羊之间差异不显著(P0.05)。结果说明,山羊y+L碱性氨基酸转运系统的主要转运部位为小肠;该系统中轻链y+LAT1和重链4F2hc构成的异二聚体转运蛋白可能发挥更为主要的转运作用;4F2hc和y+LAT2基因可能分别在山羊皮肤和大脑中发挥重要的生理功能;4F2hc、y+LAT1和y+LAT2基因在山羊小肠中受肠段和发育阶段的影响,具有不同的发育性表达规律。     

家兔小肠不同区段营养物质转运载体相关基因的分布规律

旨在研究家兔小肠不同区段营养物质转运载体相关基因的分布规律。本研究选取110日龄体重相近的健康白色獭兔10只,屠宰后采集十二指肠、空肠、回肠样品,采用real-time PCR研究家兔不同肠段小肽转运载体Pep T1,氨基酸转运载体CAT1、B~0AT、EAAT3、rBAT,葡萄糖转运载体SGLT1、GLUT2、GLUT5,以及脂肪酸转运载体FATP4的mRNA表达丰度。结果显示,小肽转运载体Pep T1 mRNA在十二指肠表达量最高,空肠略低;碱性氨基酸转运载体CAT1、兼性氨基酸转运载体rBAT和中性氨基酸转运载体B~0AT mRNA的表达量均在回肠最高,空肠次之;酸性氨基酸转运载体EAAT3 mRNA的表达量在空肠和回肠均较高;葡萄糖转运载体SGLT1和GLUT5 mRNA的表达量在十二指肠和空肠均较高;葡萄糖转运载体GLUT2和脂肪酸转运载体FATP4 mRNA的表达量则是空肠最高,十二指肠次之。结果表明,家兔肠道转运吸收小肽、葡萄糖和脂肪酸的主要部位是小肠前半段,转运吸收氨基酸的主要部位是小肠后半段。     

山羊DGAT1基因的克隆及对前体脂肪细胞脂质沉积的调控作用研究

旨在克隆山羊DGAT1基因序列,明确DGAT1基因在山羊不同组织中的表达模式,并进一步揭示过表达DGAT1基因对山羊肌内前体脂肪细胞脂质代谢的影响。本试验以10月龄健康简州大耳公羊（n=7）为试验动物。采用RT-PCR法克隆山羊DGAT1基因序列,并对序列进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR （real-time quantitative PCR,RT-qPCR）检测DGAT1在山羊不同组织中的相对表达水平;采用双酶切法构建pcDNA3.1-DGAT1真核表达载体并转染至山羊肌内前体脂肪细胞;使用RT-qPCR检测DGAT1过表达效率及脂质代谢相关基因的表达情况;通过油红O染色法观察过表达DGAT1对脂滴形成的影响,利用GPO-Trinder酶学反应检测甘油三酯含量。结果显示,获得山羊DGAT1基因序列全长1 651 bp （GenBank登录号：MT221183）,包含5'UTR 125 bp,CDS 1 470 bp,3'UTR 56 bp,编码489个氨基酸残基;山羊DGAT1基因在小肠中的表达量最高,在脾中表达量最低;RT-qPCR检测结果显示,DGAT1在细胞中过表达极显著（P<0.01）,GPAM基因的相对表达水平显著上调（P<0.05）,ADRP和ACOX1基因极显著上调（P<0.01）,而AGPAT6基因相对表达水平显著下调（P<0.05）,MLYCD和HSL基因极显著下调（P<0.01）;油红O染色结果显示,过表达DGAT1后脂滴聚积相较于对照组极显著增多（P<0.01）,甘油三酯测定结果显示,过表达DGAT1基因可极显著增加山羊肌内脂肪细胞甘油三酯含量（P<0.01）。本研究成功获得山羊DGAT1基因CDS区序列并构建了pcDNA3.1-DGAT1真核表达载体,过表达DGAT1可显著促进山羊肌内前体脂肪细胞脂质沉积,并显著影响脂质代谢相关基因的表达,这些结果为进一步阐明DGAT1对调控山羊肌内脂肪代谢的作用机制提供了重要数据。     

新西兰白兔CYP11A1基因的克隆、生物信息学分析及其对繁殖相关基因的影响

【目的】旨在通过分析细胞色素P450家族成员11A1（CYP11A1）的生物信息功能及其在新西兰白兔卵巢颗粒细胞中对繁殖性能相关基因的调控作用，为探究其在卵泡发育过程中调控功能奠定基础。【方法】根据GenBank上兔CYP11A1基因的序列，设计特异性引物，以新西兰白兔卵巢组织cDNA为模板，PCR扩增并克隆CYP11A1基因序列，构建pcDNA3.1-CYP11A1过表达重组载体；用Mega 5.1在线软件构建系统进化树，并通过生物信息学软件对CYP11A1蛋白的氨基酸组成、理化性质、磷酸化位点、保守结构域、二级结构、三级结构、亚细胞定位、蛋白互作进行预测分析。分离新西兰白兔卵巢颗粒细胞，并通过免疫荧光法鉴定颗粒细胞特异性抗体卵泡刺激素受体（FSHR）的表达。设计3条干扰CYP11A1基因表达的引物（siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3），筛选出干扰效率最高的1条，并将其与pcDNA3.1-CYP11A1过表达重组载体转染到卵巢颗粒细胞中，用实时荧光定量PCR检测颗粒细胞中羟基类固醇17-β脱氢酶1（HSD17B1）、骨形态发生蛋白15（BMP15）和促卵泡刺激素受体（FSHR）等繁殖相关基因mRNA表达水平。【结果】成功克隆新西兰白兔CYP11A1基因，其CDS全长序列为1 557 bp，编码518个氨基酸，其中亮氨酸含量（10.6%）最高，精氨酸（7.6%）、缬氨酸（7.4%）和丙氨酸（7.2%）次之。进化树分析显示，CYP11A1蛋白序列与家鼠、人和猩猩的距离最近。生物信息学分析显示，CYP11A1蛋白理论等电点为7.4，正负电荷残基数各占50个，脂肪族氨基酸指数为82.16，不稳定性指数39.54，其中氨基酸序列中亲水性残基数量多于疏水性残基；CYP11A1蛋白具有40个潜在的磷酸化位点，其中以苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸最为丰富；CYP11A1蛋白二级结构由α-螺旋（48.31%）、无规则卷曲（40.22%）、延伸链（7.42%）和β-转角（4.04%）组成，三级结构为弯曲螺旋状。亚细胞定位预测结果显示，CYP11A1蛋白主要分布于线粒体（52.2%）、细胞质（17.4%）和细胞核（13.0%）中，还具有1个p450家族的结构域，并与多个繁殖性能相关的蛋白（STAR、CYP21A2、CYP17A1和FDX1）相互作用。分离的兔颗粒细胞表达FSHR，可以用于后续试验；CYP11A1基因在颗粒细胞中过表达后，HSD17B1和FSHR基因表达量极显著上调（P＜0.05），BMP15基因表达量显著上调（P＜0.01）；干扰CYP11A1基因表达后，BMP15和FSHR基因的表达量极显著下调（P＜0.01），HSD17B1基因表达量显著下调（P＜0.05）。【结论】CYP11A1是一个稳定、亲水、相对保守且具有抗氧化和类固醇激素合成功能的蛋白。CYP11A1基因可调控卵巢颗粒细胞中与繁殖性能相关的基因HSD17B1、BMP15、FSHR的表达，说明CYP11A1基因在母兔繁殖过程中发挥一定作用。     

猪SGK家族基因的生物信息学分析及其在猪脂肪组织和细胞中的表达

【目的】 扩增猪血清和糖皮质激素诱导型激酶（SGK）家族基因并进行生物信息学分析,探索其在猪脂肪组织和细胞中的表达模式。【方法】 以藏猪脂肪细胞cDNA为模板PCR扩增SGK家族基因,通过在线工具预测其编码蛋白的理化性质及亚细胞定位;用Mega X软件构建系统进化树;采集30日龄巴马猪心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、背肌、腿肌、颈部脂肪、背部脂肪、腹股沟脂肪、肾周脂肪等组织及7日龄和4月龄猪腹股沟脂肪组织,通过实时荧光定量PCR检测SGK家族基因在猪不同部位组织中的表达;采集30日龄巴马猪腹股沟脂肪组织并分离基质血管成分（SVF）细胞,诱导SVF细胞向白色脂肪细胞分化,通过实时荧光定量PCR检测SGK家族基因及脂肪分化标记基因CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）在脂肪细胞中的表达。【结果】 SGK1、SGK2和SGK3基因CDS区序列长度分别为1 296、1 104和1 473 bp,分别编码431、367和490个氨基酸;SGK1和SGK2定位于细胞质,SGK3定位于细胞核,三者均为亲水性蛋白,3个蛋白均含有相同基序,保守性高;系统进化树结果表明,猪与牛的亲缘关系最近;SGK1和SGK3基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、多种肌肉及脂肪组织广泛表达,SGK2基因在颈部、背部、腹股沟、肾周脂肪组织中均有较高表达;SGK1和SGK2基因在7日龄猪脂肪组织中表达量极显著高于4月龄猪脂肪组织（P<0.01）,SGK3基因在4月龄和7日龄的猪脂肪组织中表达量无显著差异（P>0.05）,且SGK3基因的表达量低于SGK1和SGK2基因;与未分化脂肪细胞相比,在分化后的脂肪细胞中SGK1和SGK2基因的表达量极显著上调（P<0.01）,且SGK1基因的表达量远高于SGK2基因,而SGK3基因的表达量无显著变化（P>0.05）。【结论】 SGK家族蛋白具有保守结构域,可能发挥着相似的功能,SGK1和SGK2可能参与调控猪脂肪细胞的分化过程,结果可为探究猪脂肪沉积的分子机制提供一定的理论基础。     

过表达NR4A1促进山羊皮下脂肪细胞分化

旨在克隆山羊NR4A1基因的CDS区序列,明确其组织和细胞表达模式,以及探究过表达NR4A1基因对山羊皮下脂肪细胞分化的影响。本试验利用双酶切法构建山羊过表达载体pcDNA3.1-NR4A1。以1周岁简州大耳羊（n=5）为试验动物。利用RT-PCR方法和实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）技术克隆NR4A1基因编码区序列并明确其时空表达特性,再将山羊pcDNA3.1-NR4A1载体转染皮下脂肪细胞使NR4A1过表达,利用形态学方法检测过表达后脂滴聚集的变化,同时采用qPCR方法检测脂肪分化标志基因相对表达水平的变化。结果获得山羊NR4A1基因的编码区序列是1 797 bp,编码598个氨基酸;NR4A1在山羊各组织中广泛表达,且在山羊背最长肌中的相对表达水平最高（P<0.01）,在山羊皮下脂肪细胞分化60 h表达量最高（P<0.01）;过表达NR4A1基因显著促进山羊皮下脂肪细胞的脂滴积累,并且显著提高C/EBPα、C/EBPβ、PPARγ、LPL、SREBP1和AP2的相对表达水平（P<0.05）。NR4A1基因可能是山羊皮下脂肪细胞分化的正调控因子,且可能是协同脂肪分化标志基因的表达量来实现的。     

番鸭GDF9基因克隆、生物信息学及组织表达分析

【目的】 对番鸭（Cairina moschata）生长分化因子9（growth differentiation factor 9,GDF9）基因进行克隆及结构和功能的预测,并检测其在就巢期和产蛋期番鸭各组织中的表达差异。【方法】 以番鸭卵巢组织cDNA为模板,利用快速扩增cDNA末端（rapid-amplification of cDNA ends,RACE）技术对GDF9基因进行扩增和克隆,利用生物信息学软件对GDF9基因的编码序列进行相似性分析和进化树构建,分析其基本理化性质和编码氨基酸序列的结构特征。利用实时荧光定量PCR技术检测就巢期番鸭和产蛋期番鸭各组织中GDF9基因的相对表达量。【结果】 GDF9基因CDS区全长1 380 bp,编码459个氨基酸;番鸭GDF9基因序列与GenBank已公布的凤头潜鸭、绿头鸭、天鹅、棕硬尾鸭、浙东白鹅、企鹅、鸡、牛、绵羊、猪和小鼠对应序列的相似性依次为98.8%、97.5%、96.4%、95.8%、94.4%、90.2%、87.5%、64.5%、64.2%、63.9%和60.6%。系统进化树结果显示,番鸭与凤头潜鸭和绿头鸭的亲缘关系较近,与小鼠的亲缘关系较远。GDF9蛋白分子质量为52.81 ku,是一种不稳定的碱性亲水膜外蛋白,有1个信号肽,含有45个磷酸化位点,8个O-糖基化位点,3个N-糖基化位点,存在1个转化生长因子-β（TGF-β）结构域;蛋白质的二级结构由无规则卷曲、α-螺旋、T-转角和β-折叠构成,所占比例分别为58.61%、22.22%、16.56%和2.61%。GDF9蛋白三级结构预测结果与二级结构一致。GDF9蛋白可能与BMP15、BMPR1B、BMPR2、TGFBR1、ACVR1B、POF1B、ZP2、ZAR1和MOS蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR结果显示,就巢期和产蛋期番鸭各组织中均有GDF9基因的表达,其中两个时期卵巢中的表达量均最高,且均极显著高于同一时期其他组织基因表达量（P<0.01）。同一组织不同时期相比,就巢期番鸭GDF9基因在脾脏、心脏和肾脏的表达量显著或极显著低于产蛋期（P<0.05;P<0.01）,在卵巢中的表达量极显著高于产蛋期（P<0.01）,其他组织中的表达量在两个时期间差异均不显著（P>0.05）。【结论】 本研究成功克隆番鸭GDF9基因,GDF9基因在番鸭各组织中均有表达,GDF9基因为番鸭产蛋期和就巢期卵巢、心脏、肾脏和脾脏的差异表达基因。该研究为进一步探索番鸭GDF9基因的功能提供了理论依据,也为研究GDF9基因在卵巢发育中的生物学功能及其分子机制奠定基础。     

Cloning and Expression of Caprine Cationic Amino Acid Transporter Gene SLC3A1 cDNA Sequence

The objective of this study was to clone caprine cationic amino acid transporter gene SLC3A1 and investigate its mRNA expression in different tissues and its development regularity in small intestine.The cDNA sequence of caprine SLC3A1 gene was cloned with the primer which was designed according to mRNA sequence of Ovis aries and Bos taurus in GenBank.Then its expression was quantified by Real-time PCR in 11 tissues from goats at the age of day 1 and duodenum,jejunum and ileum from goats at the age of day 1,month 6,month 8,month 10 and month 12.The results indicated that cDNA sequence of SLC3A1 gene was obtained,and its homology with SLC3A1 gene in Ovis aries,Bos taurus,Sus scrofa,Homo sapiens,Mus musculus and Rattus norvegicus were 99%,97%,88%,86%,80%,79%,respectively.SLC3A1 gene was expressed in all of these collected tissues,whereas the expression level varied from tissues.Specifically,its expression in kidney,jejunum,ileum and colon were significant higher than that in other tissues at the age of day 1 and decreased systematically (P<0.05).The expression of SLC3A1 in small intestine at the same age of goat was ileum>jejunum>duodenum.SLC3A1 gene expression in duodenum at the age of day 1 was significant higher than that at the other ages (P<0.05),it decreased with age in jejunum,and there was no significant difference among ileum with age (P>0.05). In conclusion,SLC3A1 gene and b^0,+ cationic amino acid transporter system were mainly expressed in kidney and intestine.The expression of SLC3A1 gene was differentially regulated and distributed by developmental stages and segments of small intestine in goat.     

犏牛L-PGDS基因克隆及其在各组织和睾丸不同发育阶段的表达研究

本研究旨在克隆犏牛前列腺素D合成酶（prostagland D synthase,L-PGDS）基因序列,并检测其在不同组织及不同发育时期睾丸中的表达水平,从而为深入研究L-PGDS基因在犏牛睾丸发育过程中的作用机制提供依据。采集成年健康犏牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠、小肠、胃、大脑及不同发育时期犏牛睾丸组织：胎牛期（5~6月）、幼年期（1~2岁）、青春期（2.5~4岁）、老年期（7~9岁）,Trizol法提取各组织总RNA,利用RT-PCR技术扩增、克隆L-PGDS基因序列并利用相关生物学软件进行分析,利用实时荧光定量PCR检测犏牛各组织及4个不同发育阶段睾丸中L-PGDS基因mRNA的表达水平。结果显示,L-PGDS基因序列全长624 bp,包括完整的开放阅读框576 bp,编码191个氨基酸。同源性比对发现,犏牛与黄牛和绵羊的同源性最高,分别为99.28%和94.0%。系统进化树分析结果显示,犏牛与黄牛亲缘关系最近,其次是绵羊、马。L-PGDS蛋白为不稳定疏水蛋白,分子质量为21.229 ku,分子式为C₉₅₃H₁₄₇₁N₂₅₁O₂₈₁S₉,等电点为6.43,不稳定指数为47.25,不含跨膜区及信号肽,蛋白质二级结构预测显示α-螺旋、无规则卷曲、延伸链分别占25.65%、53.40%和20.94%。实时荧光定量PCR检测结果显示,L-PGDS基因在犏牛睾丸组织中特异性高表达,极显著高于其他组织（P<0.01）;随着年龄增长L-PGDS基因mRNA在犏牛睾丸中呈先上升后下降趋势,其中在青春期相对表达量最高,极显著高于其他时期（P<0.01）。本研究结果为深入探究L-PGDS基因在犏牛睾丸发育过程中的作用机制提供了基础资料。     

Cloning of L-PGDS Gene and Its Expression Pattern in Different Tissues and Testis at Different Development Stages in Cattle-yak

The purpose of this study was to clone the prostaglandin D synthase (L-PGDS) gene and identify its expression pattern in various tissues and testis at different development stages in cattle-yak,in order to provide experimental basis for studying the mechanism of L-PGDS gene in testis development of cattle-yak.The total RNA of heart,liver,spleen,lung,kidney,large intestine,small intestine,gastric,brain and testis at different development stages (fetal,calve tuberty and old) of healthy cattle-yak were extracted by Trizol method.The L-PGDS gene sequence was amplified and cloned by RT-PCR,and analyzed by related biological software.The expression of L-PGDS gene mRNA in different tissues and testicular tissues at different development period of in cattle-yak were detected by Real-time quantitative PCR.The results showed that the length of L-PGDS gene was 624 bp,including the ORF of 576 bp,which encoded 191 amino acids.Homology alignment results showed that L-PGDS gene in cattle-yak had high homology with Bos taurus and Ovis aries,which were 99.28% and 94.00%,respectively.Phylogenetic tree results showed that the relation between cattle-yak and Bos taurus was the closest,followed by Ovis aries and Equus caballus.The L-PGDS protein was an unstable hydrophobic protein,the molecular weight was 21.229 ku,the molecular formula was C₉₅₃H₁₄₇₁N₂₅₁O₂₈₁S₉,the isoelectric point was 6.43,and the instability index was 47.25.The L-PGDS protein had no transmembrane region and no signal peptide.The secondary structure of L-PGDS protein contained alpha helix,random coil and extended chain,the rats of them were 25.65%,53.40% and 20.94%,respectively.L-PGDS gene was highly expressed in testis of cattle-yak,which was extremely significantly higher than that in other tissues (P<0.01).The expression of L-PGDS gene mRNA in testis of cattle-yak increased firstly and then decreased along with age,and with the highest expression in puberty stage,which was extremely significantly higher than that at other periods (P<0.01).This study provided basic data for further study on the mechanism of L-PGDS gene in the development of testis in cattle-yak.     

绵羊CREBRF基因克隆、生物信息学及组织表达分析

【目的】 对绵羊Luman/CREB3募集因子(CREBRF)基因进行克隆和生物信息学分析,并检测其在绵羊不同组织中的表达量,为探究CREBRF基因在绵羊中的生物学功能提供理论参考。【方法】 以绵羊卵巢cDNA为模板,通过PCR扩增和克隆绵羊CREBRF基因完整CDS区序列,并进行相似性比对、系统进化树构建及生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR方法检测CREBRF基因在绵羊不同组织中的表达水平。【结果】 绵羊CREBRF基因CDS区序列全长1 920 bp,编码639个氨基酸。相似性比对结果表明,绵羊CREBRF氨基酸序列与山羊、牛、人、小鼠、猪、犬、马、鸡、鸭和斑马鱼的相似性分别为99.8%、99.1%、95.4%、93.6%、98.3%、97.5%、98.4%、88.0%、87.5%和61.3%。系统进化树分析结果显示,绵羊与山羊、牛的亲缘关系最近,与斑马鱼亲缘关系最远。生物信息学分析发现,绵羊CREBRF蛋白分子式为C₃₁₂₆ H₄₉₁₄ N₈₅₈ O₁₀₅₆ S₂₁,分子质量为72.08 ku,等电点(pI)为4.77,半衰期为30 h,肽链N-端为蛋氨酸(Met),不稳定系数为54.83;CREBRF蛋白存在于细胞核内,不具备跨膜性,无信号肽,为亲水性不稳定蛋白。CREBRF蛋白二级结构主要以无规则卷曲(47.57%)为主,其次为α-螺旋(37.09%)。实时荧光定量PCR结果显示,CREBRF基因在绵羊不同组织中均有表达,其中在心脏、肾脏和卵巢中表达量显著高于其他组织(P<0.05)。【结论】 本试验获得了绵羊CREBRF基因CDS区全长序列,并初步研究了其组织表达规律,为研究绵羊胚胎发育的调控机制及提高繁殖力等提供了材料。     

猪SKP1基因的克隆及其在梅山猪与杜洛克猪卵泡中的表达研究

为探索SKP1(S-phase kinase association protein 1)基因在猪卵泡中的表达规律,本试验从猪卵泡组织中克隆了猪SKP1基因CDS区全长序列,采用Real-time PCR方法检测SKP1基因在不同组织中的表达谱,进一步分析了该基因在梅山猪和杜洛克猪S卵泡、M1卵泡、M2卵泡、L卵泡中的表达。结果表明,经克隆测序,得到了猪SKP1基因492 bp编码区全长序列,与羊、人、黑猩猩、牛、大鼠的同源性分别为93.10%、92.90%、92.29%、91.89%、89.86%。SKP1基因在各组织中均有不同程度的表达(肌肉、脂肪、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、十二指肠、卵巢、输卵管、子宫、子宫角、垂体、黄体、大脑、下丘脑),其中在子宫、脾脏、输卵管中表达量较高。SKP1基因的表达量在梅山猪S卵泡、M1卵泡和M2卵泡中的表达量均高于杜洛克猪,特别是在梅山猪M1卵泡和M2卵泡中SKP1基因的表达量极显著高于杜洛克猪(P<0.01),分别达到了2.39、2.82倍,而在L卵泡中的表达量却是杜洛克猪高于梅山猪,结果提示SKP1基因可能参与猪卵泡发育过程。     

Cloning of Porcine SKP1 Gene and it's Expression Studies between Meishan and Duroc Pigs with Follicle

To detect the expression pattern of S-phase kinase association protein 1 (SKP1) gene in during porcine follicle development.The coding sequence (CDS) of SKP1 gene was cloned from porcine follicular tissue.To analyze the tissue expression profiling of SKP1 gene and its expression level in follicles with different diameter (S,M1,M2,L) from Duroc and Meishan pigs were investigated by Real-time fluorescence quantitative PCR.The results showed that the length of CDS of porcine SKP1 was 492 bp,and it's similarity with that of Ovis aries,Homo sapiens,Pan troglodytes,Bos taurus and Rattus were 93.10%,92.90%,92.29%,91.89% and 89.86%,respectively.SKP1 mRNA was expressed in all tested tissues (muscle,fat,heart,liver,spleen,lung,kidney,stomach,duodenum,ovarian,tubal,uterine,uterine horn,pituitary,corpus luteum,brain,hypothalamus),and especially high in uterine,spleen and tubal.Both in Meishan pig.The expression of SKP1 mRNA in S,M1 and M2 follicles were higher than Duroc pig.Especially,the expression in Meishan pig M1 and M2 follicles were significantly higher than Duroc pig (P<0.01),respectively 2.39,2.82 times,and the expression of L follicle in Duroc pig was higher than Meishan pig,which suggested that SKP1 gene might be involved in the process of procine's follicular development.     

藏山羊SFRS18基因克隆、表达及其与肌内脂肪含量相关性研究

试验旨在克隆藏山羊SFRS18(splicing factor arginine/serine-rich 18)基因CDS序列,并进行生物信息学分析,同时分析其组织表达特征以及与肌内脂肪含量进行相关性分析,为深入研究该基因在山羊肌内脂肪沉积中的作用积累数据。采用RT-PCR技术获得藏山羊SFRS18基因序列,结合生物信息学分析蛋白的理化性质、结构和不同物种的同源性,实时荧光定量检测SFRS18 mRNA表达情况,并将表达量与肌内脂肪含量相关联。结果表明,藏山羊SFRS18基因cDNA序列长为1299 bp,开放阅读框(ORF)长为1272 bp,编码423个氨基酸,蛋白分子结构式为C₂₀₀₃H₃₄₂₄N₇₆₀O₆₉₆S₄,分子质量为49.42 ku,等电点pI=11.20,SFRS18蛋白为不稳定的亲水性蛋白,无信号肽;有103个磷酸化位点,2个N-糖基化位点和39个O-糖基化位点;亚细胞定位于在细胞核(82.6%)、细胞质(8.7%)、细胞骨架(4.3%)和质膜(4.3%),属于非跨膜蛋白;预测二级结构由0.71% α-螺旋和99.29%无规则卷曲组成;藏山羊核苷酸序列和氨基酸序列与牛、绵羊和水牛的相似性最高(99%),系统进化树分析表明藏山羊与牛亲缘关系最近;实时荧光定量PCR结果显示,SFRS18基因在藏山羊的不同组织中都存在表达,其中在脾脏中表达水平最高,在背最长肌中表达水平最低;在藏山羊背最长肌和腿肌中SFRS18 mRNA表达与肌内脂肪含量均呈显著正相关(r=0.081,P<0.05;r=0.373,P<0.05)。SFRS18基因可以作为调节山羊脂肪沉积的候选基因。     

藏羊MSTN基因克隆、生物信息学及组织表达分析

【目的】 对藏羊肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）基因进行克隆和生物信息学分析，检测其在藏羊不同组织中的表达，为探究MSTN基因在藏羊中的生物学功能提供参考。【方法】 以藏羊背最长肌组织cDNA为模板，克隆藏羊MSTN基因完整CDS区序列并测序，用SeqMan程序对测序结果进行拼接，并用BLAST在线程序对组装后的序列进行分析鉴定。用生物信息学软件进行相似性比对、系统进化树构建及生物信息学分析，用实时荧光定量PCR检测MSTN基因在藏羊不同组织中的表达量。【结果】 藏羊MSTN基因CDS全长为1 128 bp，编码375个氨基酸。藏羊MSTN基因氨基酸序列与绵羊、牦牛、牛、猪、恒河猴、人、黑猩猩、犬、鸡及斑马的相似性依次为100.0%、93.4%、93.4%、95.2%、94.4%、94.2%、94.4%、93.1%、87.8%和87.5%；系统进化树分析结果表明，藏羊与绵羊的亲缘关系最近，与斑马和鸡的亲缘关系最远。藏羊MSTN蛋白属于亲水性分泌蛋白，且具有不稳定性，不含跨膜结构，含1个信号肽，存在31个潜在的磷酸化位点、2个N-糖基化修饰位点，主要分布在线粒体和细胞质中；MSTN蛋白二级结构以无规卷曲为主，其次是α-螺旋、延伸链和β-转角；三级结构预测结果与二级结构一致。实时荧光定量PCR结果显示，MSTN基因在藏羊不同组织中均有表达，其中在臂三头肌和半腱肌的表达量显著高于肺脏、下丘脑、心脏、肝脏、十二指肠、瘤胃和肾脏（P<0.05）。【结论】 成功克隆了藏羊MSTN基因；该基因在藏羊肌肉中的表达量高于内脏组织。该结果为进一步研究MSTN基因对藏羊肌肉生长发育的调控机制奠定了基础。     

含赖氨酸二肽对奶牛乳蛋白合成和乳腺氨基酸转运相关基因表达的影响

试验旨在研究含赖氨酸二肽对奶牛乳腺组织中乳蛋白合成和氨基酸转运的影响。在体外培养的奶牛乳腺组织培养液中添加不同含赖氨酸二肽(赖氨酸-赖氨酸(KK)、赖氨酸—组氨酸(KH)、赖氨酸—苯丙氨酸(KF)、赖氨酸—亮氨酸(KL)和赖氨酸—苏氨酸(KT)),分别等量取代培养液中0、5%、10%、15%和20%的游离赖氨酸(赖氨酸总浓度为210μg/mL)进行培养,试验结束后收集乳腺组织用于基因表达检测。结果显示,同游离氨基酸替代量为0组相比,KH替代Lys比例为15%,KF替代比例为10%,KK、KL和KT替代比例为5%时,α_s1酪蛋白(CSN1S1)mRNA丰度最高(P<0.05);KK替代Lys比例为5%、10%、15%和20%,KH替代比例为10%和15%,KF替代比例为15%,KL替代比例为5%、20%及KT替代比例为5%、10%和15%时,均显著促进了奶牛乳腺组织中小肽转运载体2(SLC15A2)的基因表达(P<0.05);KH替代Lys比例为15%,KK、KL替代比例分别为10%,KF、KT替代比例分别为5%时,赖氨酸转运载体B⁰⁺(SLC6A14)的mRNA丰度最高(P<0.05);KH替代Lys的15%、20%,KK替代比例为5%、10%和15%,KL替代比例为5%和10%时,显著促进了雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因的表达(P<0.05)。结果提示,奶牛乳腺摄取赖氨酸二肽能促进氨基酸的吸收和乳蛋白的合成。