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为后期青天葵DXR基因的全长克隆、功能鉴定和调控研究奠定基础,采用生物信息学方法对前期通过转录组测序获得的青天葵DXR基因编码蛋白序列进行分析.结果表明:NfDXR序列包含457个氨基酸,分子量约为49.72 Ku,为亲水性、混合结构型蛋白质.NfDXR属于1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶超级家族,含有DXR功能域、2个NAPDH结合基序和2个DXR活性位点基序,不具有跨膜结构域和信号肽结构.NfDXR与其他单子叶植物DXR同源性高,其中与铁皮石斛DXR的序列相似度达90％.     

青天葵PAL基因序列特征和表达分析

在前期完成的青天葵(Nervilia fordii)转录组测序数据的基础上,采用生物信息学方法对3个青天葵PAL基因家族成员(NfPAL1、NfPAL2和NfPAL3)的c DNA序列及其编码蛋白质的氨基酸序列进行特征分析,并计算这些基因在青天葵叶片和球茎中的表达量。结果表明,从转录组数据中获得的3个青天葵PAL基因家族成员c DNA序列长度为1 743~2 091 bp,编码581~697个氨基酸。这些PAL基因编码包含苯丙氨酸解氨酶多功能域,并且不含跨膜结构域、信号肽和转运肽的亲水性稳定蛋白。3个青天葵PAL基因在青天葵中的表达呈组织特异性,其中,NfPAL1和NfPAL3在球茎中的表达量较高,而NfPAL2在叶片中具有较高的表达水平。     

中药青天葵黄酮醇合成酶基因的克隆与生物信息学分析

【目的】克隆中药青天葵黄酮化合物生物合成途径的关键调控酶—黄酮醇合成酶(flavonol synthase,FLS)基因并分析其序列特征及编码蛋白的功能。【方法】在前期青天葵转录组测序获得的FLS基因序列片段的基础上,通过cDNA末端快速扩增技术(RACE-PCR)克隆FLS基因的cDNA全长及其编码区;利用生物信息学方法对其编码蛋白进行同源性比对和功能分析。【结果】青天葵FLS基因cDNA全长1268 bp,其中包含993 bp的开放阅读框,编码331个氨基酸。编码蛋白的氨基酸序列预测显示,青天葵FLS蛋白为酸性、亲水性蛋白,分子量约为37.3 kDa;不含有信号肽、转运肽和跨膜结构域,可能定位于细胞质中;具有黄酮醇合成酶保守功能域,与铁皮石斛等同科植物FLS蛋白的同源性可达82%。【结论】成功克隆了青天葵黄酮醇合成酶基因,为后续的基因功能鉴定和生物合成调控,进而提高青天葵黄酮类药效成分积累奠定了基础。     

黄花蒿1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因的生物信息学分析

以黄花蒿(Artemisia annua L.)1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因(DXR)为研究对象,利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站及生物信息学软件对碱基分布、氨基酸组成、亲疏水性及编码蛋白结构进行预测,用Clustal W进行多序列比对,用MGEA构建系统发育树,用STRING进行蛋白互作网络分析,研究黄花蒿DXR基因特征并预测分析DXR蛋白结构与功能。结果表明:黄花蒿DXR基因mRNA序列长度为1 419 bp,编码蛋白包含472个氨基酸,等电点为6.15;DXR蛋白为疏水性蛋白,无信号肽,无跨膜结构域。多序列比对及系统发育树分析表明,黄花蒿DXR蛋白与杭白菊DXR(BAE79548.1)的相似度最高,为98%,且处于同一分支,亲缘关系较近。蛋白结构分析显示,α-螺旋、无规则卷曲是黄花蒿DXR蛋白的主要结构元件。互作网络分析显示,黄花蒿DXR在2-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)代谢途径中,可与CMS、DXS、HDS等多个蛋白发生互作。黄花蒿DXR基因在进化过程中相对保守,获得的保守区序列信息为其他物种DXR基因的克隆奠定了基础,深入研究该蛋白酶的结构和功能特征,也为今后提高青蒿素的生物合成量提供理论支持。     

青天葵HMGR 基因片段的鉴定 和生物信息学分析

采用生物信息学对青天葵转录组测序获取的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶编码基因片段Nf HMGR及其编码蛋白进行功能鉴定和表达分析。结果表明,Nf HMGR基因片段序列长度为1 563 bp,与其他植物HMGR基因的同源性最高可达88%;编码含有521个氨基酸、分子量约为55.34 ku的亲水性不稳定蛋白。Nf HMGR蛋白具有3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶Ⅰ类酶功能域,归属于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶超级家族,包含3处跨膜结构域,不含任何信号肽、转运肽,二级结构表现为混合型结构蛋白质。在青天葵不同组织中,Nf HMGR基因在球茎中的表达量高于在叶片中的表达量。     

复方青天葵组方筛选及对猪呼吸道疾病治疗效果

文章旨在筛选复方青天葵(青天葵-A、鱼腥草-B、黄芪-C)最优组方及对猪呼吸道疾病治疗效果。采用内毒素腹腔注射法建立小鼠呼吸窘迫综合症模型;利用正交试验方法,以肺组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)为指标筛选最优组方;向断奶仔猪日粮中添加最优组方比例高、中、低剂量复方青天葵,以氟苯尼考为对照组针对自然感染呼吸道疾病猪进行治疗。结果表明,正交组中SOD、MDA与模型组相比差异显著(P<0.05),青天葵最优解为A1、鱼腥草最优解为B3、黄芪最优解为C2;与对照组相比,复方青天葵高、中、低剂量组分别有较高治愈率和有效率。因此,复方青天葵最优组方为:青天葵0.5 g.kg-1,鱼腥草0.1 g.kg-1,黄芪0.05 g.kg-1,最优处方比例复方青天葵针对呼吸道疾病猪有较好治疗效果。     

药用植物青天葵叶片原生质体的制备与纯化

[目的]研究青天葵原生质体的制备与纯化方法。[方法]以青天葵新鲜叶片为试验材料,以青天葵叶片原生质体产量及原生质体存活率为考察指标,研究了预处理、酶解方式、酶解温度、离心转速、光照、筛网目数等因素对青天葵原生质体分离纯化效果的影响。[结果]适宜青天葵叶片原生质体游离的条件是用浓度13%甘露醇溶液预处理叶片1 h、酶解温度（25±1）℃、黑暗、静置;原生质体纯化采用离心沉淀法,以200目筛网过滤后离心8 min（800 r/min）,操作2次,可得到大量完整清晰、细胞碎片少的原生质体。[结论]该方法获得了制备青天葵原生质体的理想条件与参数,为建立青天葵原生质体再生体系提供了依据。     

复方青天葵组方筛选及对猪呼吸道疾病治疗效果

文章旨在筛选复方青天葵(青天葵-A、鱼腥草-B、黄芪-C)最优组方及对猪呼吸道疾病治疗效果.采用内毒素腹腔注射法建立小鼠呼吸窘迫综合症模型;利用正交试验方法,以肺组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)为指标筛选最优组方;向断奶仔猪日粮中添加最优组方比例高、中、低剂量复方青天葵,以氟苯尼考为对照组针对自然感染呼吸道疾病猪进行治疗.结果表明,正交组中SOD、MDA与模型组相比差异显著(P＜0.05),青天葵最优解为A1、鱼腥草最优解为B3、黄芪最优解为C2;与对照组相比,复方青天葵高、中、低剂量组分别有较高治愈率和有效率.因此,复方青天葵最优组方为:青天葵0.5 g·kg-1,鱼腥草0.1 g·kg-1,黄芪0.05 g·kg-1,最优处方比例复方青天葵针对呼吸道疾病猪有较好治疗效果.     

甜瓜β-氨基己糖苷酶基因家族的全基因组分析

茁-氨基己糖苷酶(茁-Hexosaminidase, 茁-Hex, EC 3.2.1.52)是生物界广泛存在的一种糖苷水解酶。通过全 基因组信息鉴定甜瓜茁-氨基己糖苷酶基因家族,初步在甜瓜全基因组数据库中发现5 个茁-Hex 基因成员,采用 Pfam 等在线软件预测候选蛋白的结构域,去除2 个不完整的基因,最后将筛选出的3 个基因与拟南芥、青椒、番茄、 可可树、谷子、葡萄和黄瓜的相应基因编码的蛋白序列进行进化分析比对、建立系统发生树和保守基序的预测分析。 结果表明,进化树亚族成员中基序相同,并且在保守区序列高度相似;亚族之间基序差异也较小,保守区序列也具有 较高相似性。     

马铃薯ERECTA基因克隆和生物信息学分析

ERECTA是一种类受体蛋白激酶,在植物株型控制、器官形态建成和逆境响应等方面起着重要作用。以马铃薯(Solanum tuberosum)为研究对象,通过RT-PCR技术扩增ERECTA基因的cDNA序列,并进行生物信息学分析。结果表明,马铃薯ERECTA基因的cDNA序列全长为3 281 bp,包括一个2 973 bp的开放阅读框,可编码990个氨基酸,含有10个保守基序。通过系统发育树和多序列比对可知,马铃薯ERECTA氨基酸序列与其他植物ERECTA氨基酸序列的同源性较高。马铃薯ERECTA以α-螺旋和无规卷曲为主,包含8个富含亮氨酸的LRR基序。马铃薯ERECTA基因的克隆与生物信息学分析,为进一步研究马铃薯ERECTA功能提供了参考。     

外源激素及浸泡条件对青天葵球茎休眠破除率的影响

【目的】研究破除青天葵球茎休眠的方法,为促进青天葵产业的发展和球茎类植物打破休眠提供技术参考。【方法】分别用赤霉素(GA)、玉米素(ZT)和激动素(KT) 3种激素对打破青天葵球茎休眠进行试验;再取其中破眠效果较好的激素进行不同激素浓度、不同浸泡时间和不同培养温度进行破眠试验,研究各处理对打破青天葵球茎休眠的效果。【结果】3种外源激素破除青天葵球茎休眠的优先顺序为KT ZT GA; KT浓度为5和10 mg/L时,以及浸泡10 min和1 h处理,均可在第4天破除青天葵球茎休眠;青天葵球茎浸泡清水后或10 mg/L的KT处理的第6天,均可在28和31℃的条件下破除青天葵球茎休眠。【结论】打破青天葵球茎休眠以选KT激素,浓度为10 mg/L,浸泡10 min,在28℃的条件下培养,破除球茎休眠时间最短,出芽整齐、健壮。     

青天葵叶片原生质体分离条件的优化

以青天葵Nervilia fordii(Hance)Schltr.的新鲜叶片为试材,对青天葵原生质体的制备分离技术进行研究。用不同浓度的甘露醇溶液处理青天葵叶片下表皮细胞,进行细胞质壁分离试验,确定青天葵叶片细胞的等渗浓度;采用正交设计研究酶解法制备青天葵叶片原生质体的最适合纤维素酶浓度、离析酶浓度及酶解时间。结果表明,青天葵叶片细胞的等渗浓度为11%甘露醇;采用1.0%纤维素酶R-10+0.6%离析酶R-10的混合酶液酶解青天葵叶片12 h能达到很好的分离效果,获得高质量的原生质体。     

青天葵EBP1基因原核表达载体的构建

[目的]构建青天葵器官大小调控基因——Erb3结合蛋白(Erb3-binding protein,EBP1)编码基因的原核表达载体,以期为通过原核表达体系鉴定该基因的功能奠定基础。[方法]将引入酶切位点的NfEBP1基因的PCR产物及表达载体pET-28、pET-16b分别进行双酶切,之后连接相应的酶切产物,热击转化到E.coli Top10细胞,通过菌落PCR、测序和酶切筛选阳性重组子。将确认的阳性重组子质粒转化至E.coli BL21表达宿主菌,并对其进行双酶切验证。[结果]构建了重组表达质粒pET-28-NfEBP1-1188和pET-16-NfEBP1-1188,其转化E.coli BL21表达宿主细胞后,分别获得含有2个载体的工程菌。[结论]该研究成功构建了青天葵EBP1基因的原核表达载体,为后续通过原核表达体系鉴定该基因的功能奠定了基础。     

牛巴贝斯虫DXR酶的结构特征分析

利用反转录PCR方法扩增牛巴贝斯虫陕县株DXR基因,对其推导氨基酸序列进行生物信息学分析。研究牛巴贝斯虫DXR酶的结构,并探讨其是否可以作为磷胺霉素的作用靶点。结果表明：该基因编码框长度为1 152 bp,编码383个氨基酸,与NCBI上公布的美国牛巴贝斯T2Bo株DXR的相似性为97.4%。同源模建表明,DXR酶的三维结构同恶性疟原虫的三维结构相似,与磷胺霉素结合位点氨基酸具有保守性。     

青天葵EBP1基因原核表达载体的构建(英文)

[目的]构建青天葵器官大小调控基因———Erb3结合蛋白(Erb3-binding protein,EBP1)编码基因的原核表达载体,以期为通过原核表达体系鉴定该基因的功能奠定基础。[方法]将引入酶切位点的NfEBP1基因的PCR产物及表达载体pET-28、pET-16b分别进行双酶切,之后连接相应的酶切产物,热击转化到E.coli Top10细胞,通过菌落PCR、测序和酶切筛选阳性重组子。将确认的阳性重组子质粒转化至E.coli BL21表达宿主菌,并对其进行双酶切进行验证。[结果]构建了重组表达质粒pET-28-NfEBP1-1188和pET-16-NfEBP1-1188,其转化E.coliBL21表达宿主细胞后,获得含有2个载体的工程菌。[结论]该研究成功构建了青天葵EBP1基因的原核表达载体,为后续通过原核表达体系鉴定该基因的功能奠定了基础。     

人参皂苷生物合成相关基因PgRg2BBE克隆及生物信息学分析

克隆与人参皂苷Rg₂合成相关的重要酶基因PgRg₂BBE全长cDNA序列，并利用在线软件对该基因编码的蛋白质进行理化性质、结构域、亚细胞定位和系统进化等分析。结果表明：PgRg₂BBE基因cDNA序列长为1 638 bp，编码545个氨基酸。PgRg₂BBE蛋白分子量为60 967.10 u，等电点为8.88，不稳定性指数为34.04，预测该蛋白为一种稳定的亲水性跨膜蛋白，主要由α-螺旋和无规则卷曲组成。PgRg₂BBE蛋白含有FAD＿binding＿4和BBE功能结构域，定位于叶绿体中，含有24个氨基酸序列信号肽。系统发育树分析发现，其与智利茄的亲缘关系最近，氨基酸序列多重比对发现，RgRg₂BBE中含有4个保守基序，进一步与拟南芥AtBBE家族蛋白进行同源序列比对，发现它们同时具有4个保守基序(RKYGL、MGED、FWAIRGG、FPEI)。     

兰州熊蜂气味受体家族鉴定及分析

【目的】了解兰州熊蜂(Bombus lantschouensis)基因组中气味受体基因(odorant receptors,Ors)情况,为进一步分析气味受体功能提供信息,从而为研究该基因家族在熊蜂觅食、交尾、通讯等行为中的重要功能打下基础。【方法】提取兰州熊蜂胸部基因组DNA,进行Illumina高通量测序,对测序所得原始序列进行质控并拼接获得基因组序列,然后使用本地blast 2.2.28+对构建兰州熊蜂基因组本地数据库,使用已知的地熊蜂(Bombus terrestris)和意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)的气味受体蛋白序列作为种子序列搜索数据库获得兰州熊蜂的气味受体序列;使用EMBOSS1.5对气味受体蛋白序列进行基本理化分析,利用GSDS2.0对家族序列的内含子与外显子位置进行分析,然后使用MEME 4.11.2对氨基酸序列进行保守基序分析,最后利用Clusta W 2.1、Trim Al 1.2、Phy ML3.0对兰州熊蜂、地熊蜂和意大利蜜蜂气味受体家族序列进行系统进化分析。【结果】共获得165个兰州熊蜂气味受体基因,包括1个非典型气味受体(olfactory receptor co-receptor,Orco)、5个假基因和159个气味受体。基因结构分析发现,气味受体家族外显子数目从4个到9个不等。其中Or 47—57的序列中外显子数量最少,为4个;Or 128—161中外显子的数量最多,为9个。根据基因结构的不同,将气味受体分为10大类型,每个类型中的序列都有相似的外显子长度与数量。Or 1—38、Or 69—85、Or 128—164这3大类所包含成员数较多(分别为38、17、37),其他7类包含成员个数都约10个,且每个类型中序列在染色体上都呈串联排布,其中Or 1—38中都包含一个较长的第一外显子。保守基序分析发现,在检索的10个保守基序中,除基序5为未知基序外,其他9个基序均包含在其保守结构域(7tm_6 domain)中。Or1—38与Or 39—46多数成员包含全部10个保守基序,基序2、3、4、9广泛存在于该家族成员序列中,这4个基序可能为该家族关键的功能区域。系统发育分析将Ors分为5个亚家族(I—V),其中亚家族II包含2种基因结构类型序列(Bl Or 97—100与Bl Or 69—85),亚家族V包含4种(Bl Or 1—46、47—57、86—95和101—107)。Bl Or 150—155与Am Or 122—139分别聚为两个分支,Bl Or 47—57与Am Or 63—65也发现类似的聚类,这表明在进化中,蜜蜂与熊蜂的Ors出现了特异性的扩张与缺失。在进化树中发现Or 115较早与其他成员分离,位于树的基部,推测该序列可能更接近气味受体家族的祖先序列。【结论】探明了兰州熊蜂的Or基因数量、基因结构及其进化关系;该基因家族在进化过程中部分成员保守基序丢失,这些结果为进一步了解Or基因功能打下了基础。     

复方青天葵组方在猪呼吸道疾病治疗中的效果

青天葵为广东特产药材,其首次记载是在《岭南采药录》中,属于植物毛唇芋兰的干燥全草或是块茎,又叫做独叶莲、天葵、山米子等。青天葵味苦、性平,归心、肺、肝经等效果。且具有润肺止咳、散瘀止痛,清热解毒的功效。本文将主要以青天葵为成分分析的基础上,对复方青天葵在治疗猪呼吸道疾病中的效果进行研究。     

叶蝉EST资源的微卫星信息分析

【目的】分析叶蝉EST序列信息,为其分子标记体系建立、遗传图谱构建及相关致害基因挖掘奠定基础。【方法】利用生物信息学技术对NCBI数据库中的4种叶蝉亚种EST序列进行SSR基序分析与统计,并对筛选出的SSR基序区段进行引物设计,开发出SSR标记。【结果】11044条叶蝉EST序列的总长为5866kb。按照引物筛选设定的参数,筛选获得1946条含有SSR基序的EST序列,占总EST序列的17．6％;其中包含2230个SSR基序并全部获得相应的SSR引物,平均间距为2．63kb。在2～5个核苷酸重复中,3个核苷酸重复为优势基序,占总基序的77．3％,尤以AAT类最丰富,占3个核苷酸重复总数的40．7％;双核苷酸重复中,AG类所占的比例最大,为39．1％。【结论】从叶蝉EST序列中筛选获得2230个SSR引物,以3个核苷酸重复基序所占比重最大。     

洛伐他丁和膦胺霉素对烟草HMGR和DXR活性的影响

HMGR和DXR分别是萜类生物合成途径——MVA和MEP途径的2个关键酶。本研究对烟草施用HMGR和DXR的专一抑制剂洛伐他汀(MEV)和膦胺霉素(FSM),测定烟草Nt HMGR、Nt DXR、FPPS和GGPPS基因转录水平、HMGR和DXR酶活性变化。结果表明,抑制剂处理后烟草内源基因Nt HMGR和Nt DXR表达量在24h受到明显抑制;HMGR和DXR活性均在一定时间内受到抑制。MEV和FSM能有效抑制烟草中HMGR和DXR的活性。