酵母α-半乳糖苷酶组成型表达基因的重组构建及转化

用PCR方法从酿酒酵母AH109中扩增出α-半乳糖苷酶MEL1基因片段，与乙醇脱氢酶组成型启动子重组后构建成表达重组质粒pGAD-GAL,将重组质粒pGAD-GAL转化不带α-半乳糖苷酶基因的酿酒酵母后，在预先涂布有X-α-Gal的亮氨酸缺陷培养基(SD／-Leu)平板上选择到蓝色菌落，实现了α-半乳糖苷酶在酵母内的组成型表达。     

枯草芽孢杆菌AmyX基因信号肽性能优化研究

从枯草芽孢杆菌1A 747菌株基因组克隆Am yX基因信号肽序列,构建枯草芽孢杆菌分泌表达载体pYGAm yX,转化枯草杆菌W B 700得W B 700(pYGAm yX)。采用重叠PCR技术,将Am yX基因信号肽突变,使其N端正电荷增加,H区疏水性降低,利用突变后信号肽序列构建枯草杆菌分泌表达载体pYGMUT,转化枯草杆菌W B 700得W B 700(pYGMUT)。对W B 700(pYGAm yX)和W B 700(pYGMUT)的表达产物进行检测,研究Am yX基因信号肽突变对枯草杆菌蛋白分泌途径的影响。结果表明,W B 700(pYGAm yX)和W B 700(pYGMUT均能表达β-半乳糖苷酶,W B 700(pYGAm yX)的最高胞外酶活性达2 300 U,W B 700(pYGMUT)的最高酶活性达5 200 U。结果表明Am yX基因信号肽突变后构建的表达载体pYGMUT分泌表达β-半乳糖苷酶明显提高,说明β-半乳糖苷酶通过枯草杆菌T at途径分泌表达。     

构建表达载体提高枯草杆菌β-葡聚糖酶表达量

构建了β-葡聚糖酶表达载体 P~(SGI)。转化枯草杆菌 SO113后,可高效表达β-葡聚糖酶,并分泌到培养基中。其酶活性约为无表达质粒的枯草杆菌的十倍。     

黑曲霉内切β-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达

利用RT-PCR技术,提取黑曲霉(Aspergillus niger)L3的总RNA进行反转录,并通过PCR扩增得到去除天然信号肽的β-1,4-葡聚糖酶基因eg Ⅰ,将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,使之位于α-因子信号肽下游,并与之同框,构建重组表达质粒pPIC9k-eg Ⅰ,电击转化毕赤酵母GS115,经MM、MD、CMC-Na和G418平板筛选,得到重组毕赤酵母工程菌1#和5#,在摇瓶中β-1,4-葡聚糖酶酶活分别达到1456 U/mL和1928U/mL.重组酶最适温度为70℃,最适pH为5.0.     

源于Paecilomyces sp. FLH30内切β-1,3(4)葡聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

[目的]β-1,3(4)-葡聚糖酶是一种重要的工业用酶,广泛地应用于饲料业、酿造业及纺织业.[方法]以来源于Paecilomyces sp.FLH30的葡聚糖酶基因为研究对象.据毕赤酵母GS115对密码子的简并性和偏爱性,对来源于淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)β-1,3(4)-葡聚糖酶基因进行了优化,通过全基因技术合成了全长基因GLUnm并构建重组酵母表达载体pPIC9K-GLUnm,用SacI线性化重组质粒pHC9K-GLUnn,电击转化至毕赤酵母GS115中进行表达.[结果]通过表型筛选,遗传霉素抗性筛选,经PCR鉴定表明,葡聚糖酶基因整合至酵母染色体DNA中.在试管中经甲醇诱导表达,并测定葡聚糖酶酶活性.在试管水平表达的酶活性是0.68 IU/mL,即可以认为在摇瓶表达水平的初始酶活性为0.68 IU/mL,将此菌株在摇瓶水平表达,酶活性在表达84h为最高,是11.26 IU/mL.[结论]重组β-1,3(4)-葡聚糖酶的最适pH为5.0,最适反应温度为50℃,在pH 5.0 ～8.0,温度37～50℃的条件下较稳定.     

木霉T88 β-l,6-葡聚糖酶(BGN16.2)的基因克隆、表达及同源建模

利用RT-PCR方法克隆得到β-l,6-葡聚糖酶BGN16.2的cDNA序列,并采用半定量RT-PCR法,研究以茯苓粉及病原菌细胞壁为诱导物对该基因诱导表达的影响。构建该酶基因到酿酒酵母诱导型表达载体pYES2上,转化酿酒酵母,用CMC糖化力法对目的基因表达产物的酶活性进行检测。克隆得到BGN16.2的cDNA基因开放阅读框长度为1290bp,编码429个氨基酸,推测蛋白分子量为48kDa,预测的等电点pI为5.25。该基因能在酿酒酵母中表达有生物活性的β-l,6-葡聚糖酶并分泌到胞外。发酵液中的酶活在培养60h时达到最高(2.1U·mL-1),最适酶解温度为50℃,最适pH值为5.5。对该酶的一二级结构进行生物信息学分析的基础上,利用同源建模的方法完成了该酶的活性区域三级结构的建模。     

小麦β-1,3-葡聚糖酶性质及其对小麦根腐离蠕孢菌的抑菌作用

为了明确小麦根腐离蠕孢菌（Bipolaris sorokinianum）侵染小麦后被诱导表达的β-1,3-葡聚糖酶基因所编码的β-1,3-葡聚糖酶的性质及其与抗病性的关系,采用生物信息学的方法对β-1,3-葡聚糖酶的一级结构、信号肽和跨膜结构进行了预测分析。结果表明β-1,3-葡聚糖酶是一种分泌型碱性蛋白酶,主要存在于胞外。将克隆到的β-1,3-葡聚糖酶基因构建成重组质粒并转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后,分离纯化得到了原核表达的β-1,3-葡聚糖酶,对其在体外对小麦根腐离蠕孢菌生长的抑制作用的研究发现,β-1,3-葡聚糖酶对小麦根腐离蠕孢具较强抑菌活性。     

耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

【目的】研究耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达,并检测其酶学性质,为耐热β-半乳糖苷酶的应用和工业化生产奠定基础。【方法】利用基因工程的原理和方法,将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热β-半乳糖苷酶基因(bgaB)克隆到大肠杆菌pET表达系统(pET-28a(+)),并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。将构建的重组菌(pET28a-bgaB)在含硫酸卡那霉素的液体LB培养基中以IPTG为诱导剂,对表达产物的最适反应温度、最适反应时间I、PTG诱导浓度、热稳定性及酶促动力学进行检测。【结果】成功构建了表达载体pET28a-bgaB,并测得耐热β-半乳糖苷酶的最适反应温度为65℃,最适反应时间为6 h,IPTG的最佳诱导浓度为1 mmol/L,且具有良好的热稳定性;在诱导后6 h,耐热β-半乳糖苷酶的表达量占菌体总可溶性蛋白的20%,表达效率较高;对透析蛋白进行蛋白质定量,蛋白质量浓度为0.75 mg/mL,透析蛋白的耐热β-半乳糖苷酶活性为75 U/mL,比活性为100 U/mg;酶促动力学研究表明,耐热β-半乳糖苷酶的反应常数为0.398μmol/mL,最大反应速度为27.435μmol/(min.mL)。【结论】耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中得到成功表达,并且在很大程度上提高了耐热β-半乳糖苷酶的活性。     

地衣芽孢杆菌β-1,3-1,4葡聚糖酶基因的克隆及序列分析

β-葡聚糖是以β-1,3和β-1,4混合糖苷键连接形成的D-葡萄糖聚合物,主要存在于单子叶禾本科谷实中.有些微生物会产生降解β-葡聚糖的β-1,3-1,4-葡聚糖酶.将β-葡聚糖酶基因在食品级宿主菌中表达对动物饲料工业具有十分重要的应用价值.实验以地衣芽孢杆菌为材料,提取其总DNA,扩增其β-1,3-1,4葡聚糖酶基因序列,将该片段克隆到pMD 19-T载体进行测序,并将测序结果进行BLAST比对.发现其与GenBank中的两段基因序列具有较高的同源性.     

枯草芽孢杆菌高效表达系统的构建

【目的】优化枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)启动子和表达宿主,构建其高效的表达系统,为重组枯草芽孢杆菌的研究和应用奠定基础。【方法】以β-半乳糖苷酶编码基因为报告基因,以诱导型的枯草芽孢杆菌麦芽糖操纵元启动子为调控元件、大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒为载体骨架,构建枯草芽孢杆菌高效表达载体pGJ222,将其电转化到B.subtilis 1A747菌株后进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。利用同源重组的方法,用枯草芽孢杆菌组成型启动子P43替换了B.subtilis野生型菌株1A747麦芽糖操纵元的上游调控序列,得到优化重组表达宿主菌B.subtilis BCYL,将pGJ222转入B.subtilis BCYL后,对优化的表达系统进行诱导表达试验和葡萄糖抑制试验。分别用PCR扩增大肠杆菌和枯草芽孢杆菌维生素B12合成前期途径的谷氨酰-tRNA合成酶编码基因hemA,构建其表达载体,并将其转化B.subtilis BCYL中进行诱导表达检测。【结果】成功构建了枯草芽孢杆菌高效表达载体pGJ222,并实现了β-半乳糖苷酶的高效表达,其表达量占总可溶性蛋白的18%;质量分数5%的麦芽糖诱导24hβ-半乳糖苷酶活达到16U/mL。成功获得了优化重组表达宿主菌B.subtilis BCYL,其可使β-半乳糖苷酶活性有大幅度提高,在质量分数5%麦芽糖诱导24hβ-半乳糖苷酶活达到21U/mL,葡萄糖的抑制作用明显减弱。【结论】通过对启动子和表达宿主的优化,获得了枯草芽孢杆菌高效表达系统,为枯草芽孢杆菌基因工程研究提供了有力工具。     

Bacillus subtilis LC-9产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质与催化特性研究

[目的]系统研究Bacillus subtilis LC-9所产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质,探讨其在催化应用上的可行性。[方法]采用两步阴离子交换层析法对B.subtilis LC-9发酵液中的β-1,3-1,4-葡聚糖酶进行纯化,用SDS-PAGE检测其纯度,研究纯酶的酶学性质及该酶对β-葡聚糖和地衣多糖的降解特性,并采用TLC法检测其水解液中糖的成分。[结果]从自行筛选的糖苷酶产生菌B.subtilis LC-9的发酵液中经两步纯化,得到电泳纯的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,其比活力达3 502 U/mg,表观分子量为28 kDa;酶的最适反应pH和温度分别为6.5和45℃,且在45℃下稳定;该酶催化地衣多糖的Km值和Vmax分别为4.13 mg/ml和1 238μmol/min/mg,催化大麦β-葡聚糖的Km值和Vmax分别为3.84 mg/ml和1 427μmol/min/mg;该酶降解大麦β-葡聚糖产生寡聚糖,最终产物主要为三糖和四糖,而降解地衣多糖终产物主要为三糖。[结论]从Bacillus subtilis LC-9发酵液中纯化获得了电泳纯的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,性质研究表明该酶是专一性的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,有望用于啤酒、饲料等领域。     

报告基因在柞蚕幼虫体内表达的研究

利用柞蚕核型多角体病毒 (Antheraea pernyi Nuclear Polyhedrosis Virus, ApNPV)作为载体研究了报告基因 (β-半乳糖苷酶基因 )在柞蚕幼虫体内的表达.结果表明重组 ApNPV能够使柞蚕幼虫产生典型的脓病病症,但不形成多角体.柞蚕核型多角体病毒作为表达载体能够使β-半乳糖苷酶基因在柞蚕幼虫体内得到高效表达.雌性幼虫个体的表达量为 2.4× 107u,雄性幼虫个体的表达量为 1.8× 107U;雌性个体较雄性个体在表达时相上早 96h;对于同一个体,组织细胞中β-半乳糖苷酶的含量较血淋巴上清液中β-半乳糖苷酶的含量高. SDS- PAGE结果显示 ,所表达的β-半乳糖苷酶分子量为 116kD.     

绿色木霉AS3.3711的葡聚糖内切酶Ⅰ基因的克隆与表达

采用RTPCR方法克隆到绿色木霉AS3.3711的葡聚糖内切酶Ⅰ(EGⅠ)的cDNA序列,测序后构建到酿酒酵母诱导型表达载体pYES2上,转化酿酒酵母,转化子用2%的βD半乳糖进行诱导,用Northern杂交、刚果红染色法和CMC糖化力法分别对目的基因的转录和表达产物的葡聚糖内切酶活性进行检测.结果表明,EGⅠ的cDNA基因开放阅读框长度为1377bp,编码459个氨基酸,推测蛋白质分子量为48.1kD.刚果红染色显示,转化子可产生明显的水解圈;CMC酶活检测显示该基因能在酿酒酵母中表达有生物活性的EGⅠ并分泌到胞外.发酵液中的酶活在培养60h达到最高0.06UmL,最适酶解温度为50℃,最适pH值为5.4.     

1株产α-半乳糖苷酶乳球菌的分离鉴定及酶学特性

从湘西富含豆粕下脚料土壤中筛选鉴定出1株产α-半乳糖苷酶细菌,对其进行显微形态观察、分子生物学鉴定及酶学特性分析.结果表明,该细菌为球形细菌,革兰氏染色阳性,16S rDNA序列与乳球菌有98%的同源性,可以确定为乳球菌属.细菌产分泌性α-半乳糖苷酶,其胞外α-半乳糖苷酶摇瓶发酵液初酶活为6.21 U/mL,在45℃、...     

β-1, 3-葡聚糖酶与植物的抗病性

综述了β-1,3-葡聚糖酶在植物抗病性方面的研究进展。β-1,3-葡聚糖酶在体外抑制病原物的生长;病 原物的侵染诱导植物β-1,3-葡聚糖酶活性升高和产生新的β-1,3-葡聚糖酶同工酶,这些高活性的β-1,3-葡聚糖 酶或特异性的同工酶提高了植物的抗病性;组成型表达β-1,3-葡聚糖酶基因的转基因植物,可有效地抵抗病 原物的侵袭。由于β-1,3-葡聚糖酶和病原菌的多样性及其它们在植物体内分布的不同,使得各种β-1,3-葡聚糖 酶在植物抗病性中的作用也不尽一样。     

产β-半乳糖苷酶芽孢杆菌的筛选及产酶条件的优化

[目的]筛选产β-半乳糖苷酶的芽孢杆菌并对其产酶条件进行优化。[方法]从土壤中筛选出一株具有β-半乳糖苷酶活性的菌株,对其进行鉴定并对其发酵产酶条件进行优化。[结果]该菌株被初步鉴定为巨大芽孢杆菌。该菌株的最佳碳源是乳糖,最佳氮源是牛肉膏和蛋白胨,Na+对产酶有明显的促进作用。当乳糖含量为1.20%,牛肉膏含量为0.63%,蛋白胨含量为1.04%时,该菌株所产β-半乳糖苷酶酶活可达3.68 U/ml。初始pH值为8.0,培养温度为45℃,接种量为2%,振荡培养17 h,该菌株所产β-半乳糖苷酶的酶活最高,为5.49 U/ml。[结论]该菌株在高温条件下生长旺盛,适宜生长pH值范围广,在生产实践中具有一定的应用价值。     

条锈菌诱导的小麦β-1,3-葡聚糖酶基因编码区的克隆及原核表达

为研究小麦与条锈菌互作过程中β-1,3-葡聚糖酶基因的功能,根据小麦β-1,3-葡聚糖酶cDNA全长序列设计合成引物,通过RT-PCR方法获得小麦β-1,3-葡聚糖酶基因编码区,将其克隆至pGEM T-easy Vector,经HindⅢ和BamHⅠ双酶切回收目的片断,并将其定向克隆到pET-32a(+)Vector中构建表达载体GLU-pET-32a(+),转化E.coliBL21(DE3),用IPTG进行诱导表达。结果表明,小麦β-1,3-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中得到了高效表达,获得了分子量约为49 ku的融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的19%。最佳诱导条件为:0.3 mmol/LIPTG,37℃诱导4 h。     

产酶溶杆菌OH11菌株β-1,3-葡聚糖酶基因的克隆与表达

利用PCR方法从OH11菌株中克隆到β-1,3-葡聚糖酶基因,通过同源性比较发现其推测产物与产酶溶杆菌C3菌株和N4-7菌株的β-1,3-葡聚糖酶有90%以上的同源性。该基因经NdeⅠ、XhoⅡ或HindⅢ酶切后连接到含T7启动子的高表达载体pET21a( )和载体pET30a( )上构建重组质粒,并分别转化宿主菌BL21(AI)和BL21(DE3)产生表达菌株。表达菌株BLGluA和BLGluC经IPTG诱导后分别产生相对分子量约为29 000(GluA蛋白)和44 000(GluC蛋白)的蛋白。酶活性和抑菌活性测定结果表明,GluA蛋白和GluC蛋白能将海带多糖水解,在海带多糖培养基上产生透明的水解圈,并对立枯丝核菌菌丝的生长有抑制作用,具有一定的生物防治作用。