表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白重组杆状病毒的构建与鉴定

本研究根据GenBank数据库中的猪圆环病毒2型全基因组序列设计并合成了1对能扩增完整Cap序列的引物,采用PCR扩增猪圆环病毒2型YZ株的Cap基因,并将其克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTA中,获得阳性质粒pFastBacHTA-Cap;测序后将该质粒转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,获得含有Cap基因的重组杆状病毒质粒Bacmid-Cap;最后将获得的重组杆状病毒质粒Bacmid-Cap转染sf9昆虫细胞并成功拯救了能稳定表达猪圆环病毒2型Cap蛋白的重组杆状病毒rBacmid-Cap,该重组病毒的成功拯救为研制猪圆环病毒2型的基因工程亚单位疫苗奠定了基础.     

PCV2b Cap蛋白重组杆状病毒的构建及鉴定

猪圆环病毒(PCV)能够引起多种综合征和疾病,给养猪业造成了较大的经济损失。PCV2毒株在2003年后以PCV2b取代PCV2a成为临床感染的猪群中最为流行的基因型。PCV基因组为单股负链环状DNA,其中ORF2编码病毒核衣壳蛋白Cap蛋白,Cap蛋白是主要的免疫原性蛋白。本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将PCV2b的Cap蛋白基因克隆到杆状病毒载体中,通过制备杆粒、转染sf9细胞,获得表达PCV2b Cap蛋白的重组杆状病毒毒株,从IFA、SDS-PAGE及Western-blotting分析结果可以看出,该重组杆状病毒毒株成功表达了PCV2b Cap蛋白,为制备PCV2b Cap蛋白亚单位疫苗打下基础。     

PCV-2和PCV-3 Cap蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中的表达和鉴定

为了实现猪圆环病毒2型(PCV-2)和3型(PCV-3)Cap蛋白在昆虫细胞-杆状病毒系统中表达,本试验利用刚性连接肽连接PCV-2和PCV-3 Cap基因,构建杆状病毒转移载体pFastBac-PCV-2-3-Cap,双酶切验证正确后,将其转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组杆粒。将重组杆粒转染SF9细胞(昆虫卵巢细胞),盲传3代,获得重组病毒。将重组病毒接种SF9细胞96 h后,通过细胞免疫荧光检测、Western blot和电镜观察对其进行验证,并利用噬斑法检测其效价。结果显示：成功构建重组质粒pFastBac-PCV-2-3-Cap,获得了重组杆粒rAcBacmid-PCV-2-3-Cap,并制备出重组杆状病毒rvAc-PCV-2-3-Cap。重组病毒感染SF9细胞后,目的蛋白成功表达,并可以形成病毒样颗粒,病毒效价为3.41×10⁶ PFU/mL。本试验成功在昆虫细胞-杆状病毒系统中共表达了PCV-2-3-Cap,为防治PCV-2和PCV-3混合感染的二联疫苗研究提供了数据支持。     

猪圆环病毒2a和2b双亚型Cap蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及对小鼠的免疫效果试验

试验通过PCR分别获得PCV2a和PCV2b的Cap基因,顺次克隆入pFast Bac-Dual载体质粒,获得携带2a和2b型Cap基因的重组质粒Cap-pFast Bac Dual,转化E.coli DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒Cap-Bacmid,以脂质体法将重组杆粒转染Sf9细胞,获得表达Cap蛋白的重组杆状病毒。PCR能从重组杆状病毒中扩增出相应大小的Cap基因片段,蛋白电泳和ELISA法鉴定表明,Cap蛋白成功表达。采用重组杆状病毒肌内注射免疫小鼠(每只相当于8μg Cap蛋白),免疫后14 d血清中产生PCV2抗体,免疫后28 d用PCV2a和PCV2b强毒株攻击,荧光定量PCR法检测结果显示,免疫组小鼠脾脏中PCV2基因组拷贝数极显著低于未免疫对照组。结果表明,PCV2a和PCV2b双亚型重组Cap蛋白能开发成猪圆环病毒防控的新型疫苗。     

猪圆环病毒3型Cap蛋白的表达与鉴定

为了表达猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3) Cap蛋白,按照昆虫细胞密码子偏嗜性对ORF2基因进行优化并在N端加上His标签基因,合成的ORF2基因片段克隆入pFastBac Dual杆状病毒穿梭载体;将重组质粒转化大肠杆菌DH10-Bac感受态后通过蓝白斑筛选获得重组杆粒Bacmid-C2;将重组杆粒转染至SF9细胞5 d后收集细胞上清液;连续传代3次观察细胞病变。将接毒后的SF9细胞样通过Western blot及间接免疫荧光(IFA)进行Cap蛋白表达的鉴定。利用蔗糖密度梯度离心对病毒样颗粒的Cap蛋白纯化后进行透射电镜观察。结果显示：SDS-PAGE和Western blot检测发现重组杆状病毒在昆虫细胞中能够有效表达Cap蛋白,且与His-tag单抗及PCV3阳性血清发生特异性反应;IFA进一步鉴定感染了重组病毒的昆虫细胞与His单抗产生特异性荧光;透射电镜可以明显观察到14～17 nm左右形态规则的病毒样颗粒(VLPs)。PCV3 Cap蛋白的成功表达和鉴定将为研究Cap蛋白的免疫原性和空间结构奠定基础,也为探讨开发PCV3的亚单...     

重组杆状病毒表达鸭圆环病毒Cap蛋白及活性检测

为了获得具有活性的鸭圆环病毒Cap蛋白,笔者通过PCR方法获得鸭圆环病毒I型完整Cap基因片段,将其克隆到昆虫杆状病毒基因组中,获得重组杆状病毒qBac-P-Cap,其病毒效价TCID_(50)可以达到9.25。重组杆状病毒可在悬浮Sf9细胞中表达具有活性的鸭圆环病毒Cap蛋白。研究表明蛋白表达最佳收获时间为120 h,纯化后蛋白表达量可以达到200μg/mL。这为进一步研究Cap蛋白功能和大规模制备鸭圆环疫苗奠定了基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白家蚕表达体系的构建与鉴定

为了用家蚕杆状病毒表达系统表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白,将不同株系的PCV2 Cap蛋白基因、人工改造的Cap蛋白突变体基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体,用共转染技术成功构建了重组杆状病毒.将重组杆状病毒感染家蚕,成功获得了大量Cap蛋白的表达产物.结果表明,纯化蛋白主要为病毒空衣壳粒子,推算PCV2空衣壳在...     

新疆天康将推出三款猪用疫苗

<正>猪圆环病毒2型重组杆状病毒亚单位灭活疫苗由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司技术中心研制的猪圆环病毒2型重组杆状病毒亚单位灭活疫苗,是应用分子生物学技术将猪圆环病毒2型Cap基因重组于杆状病毒内,在昆虫细胞上培养表达PCV2-r Cap蛋白而制成的亚单位疫苗。该疫苗与市场使用的猪圆环病毒2型全病毒灭活疫苗相比,具有极其显著的特点:(1)以当前的优势基因型毒株PCV2b基因序列做参考,经杆状病毒系统表达出类似病毒样颗粒(VLPs)的蛋白,抗原的     

猪圆环病毒Cap蛋白的分泌表达及其免疫原性研究

探索利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac expression system)分泌表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白及将其作为亚单位疫苗的应用价值。将PCV2 Cap基因克隆到已插入蜂毒信号肽(Melittin)的转移载体pFastBacⅠ中,将鉴定正确的重组质粒(pFastBAC-Cap)转化至DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经抗性及蓝白斑筛选得到含Cap基因的重组杆状病毒DNA(Bacmid-Cap),转染提取的Bacmid-Cap DNA转染至sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBac-Cap),应用无血清培养的High Five细胞进行重组蛋白的表达及条件优化。重组蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)证明:在重组杆状病毒感染的High Five昆虫细胞中获得分泌表达,并可产生较高浓度的重组蛋白;Western blotting结果显示:重组蛋白可被猪PCV2的特异性抗体所识别,表明重组蛋白具有反应原性;应用重组蛋白免疫BALB/C小鼠试验结果显示:该蛋白可刺激小鼠产生较高水平的特异性抗体。该研究成功分泌表达了PCV2 Cap蛋白,该蛋白能够刺激机体产生免疫应答,为PCV2亚单位疫苗的研制打下基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白在杆状系统中的表达与纯化

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)基因有两个主要的开放阅读框(open reading frame,ORF)。其中,ORF2编码病毒的主要结构蛋白核衣壳蛋白(Cap)。为了在昆虫细胞中表达Cap蛋白,本研究将重组穿梭质粒Bacmid-iel-ORF2经脂质体转染至昆虫细胞中,获得重组杆状病毒。经过噬斑克隆实验,获得稳定、高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒,病毒滴度可达到1×109 pfu/m L。免疫印迹实验表明重组Cap蛋白可与PCV2阳性血清发生特异性反应,证明该重组蛋白具有良好的免疫活性反应。本研究为提高PCV2灭活疫苗病毒滴度及免疫原性奠定了基础。     

癸氧喹酯干混悬剂含量测定的改进

采用高效液相色谱法测定癸氧喹酯干混悬剂的含量,在2-250μg/mL范围内,峰面积的常用对数与进样量浓度的常用对数呈良好的线性关系,R^2=1(n=5),平均回收率为99.24%~99.51%,RSD在0.05%~0.28%。此方法分析时间短,样品前处理简便、定量结果准确,重现性好,结果满意,为其质量控制提供了依据。     

商会自治的基石——商会自治规范研究

在现代法律秩序中,商会自治规范是制定法的基础和必要的补充,甚至在某些方面替代了制定法;商会自治规范主要包括商会组织规范、行为规范、惩罚规范以及争端解决规范等;其效力仅及于其内部成员;商会自治规范和制定法之间存在冲突,但也存在整合的基础。     

中华人民共和国农业部公告 第267号

为贯彻落实《兽药生产质量管理规范》(简称《兽药GMP》),进一步推动兽药GMP实施进程,我部制定了《兽药生产质量管理规范检查验收办法》,现予公告。本公告自2003年6月1日起施行。附件:兽药生产质量管理规范检查验收办法二○○三年四月十日第一章 总则 第一条 为推动《兽药生产质量管理规范》(以下简称兽药GMP)的实施,规范兽药GMP检查验收工作,制定本办法。 第二条 农业部负责全国兽药GMP管理和检查验收工作;负责制修订兽药GMP检查验收管理规定;负责兽药GMP检查员队伍建设和监督管理工作,负责国际兽药贸易中GMP互认工作。 …     

鸡败血支原体垂直传播模式及其阻断方法

以国际标准强毒Ｒ株人工感染非免疫产蛋鸡,定时扑杀,分别从鼻窦、眶下孔、气管、肺、气囊、卵巢和输卵管分离ＭＧ,并收集感染鸡所产蛋分离ＭＧ。结果表明,人工感染４８小时后上、下呼吸道及肺已被全面感染,９６小时气囊已被感染,１２０小时输卵管已能分离到ＭＧ,卵巢始终分离不到ＭＧ。人工感染鸡自１４４小时便能在其所产蛋中分离出ＭＧ。药物治疗能在７２小时内消除感染,油乳剂苗则需２４天后逐渐降低蛋内ＭＧ分离率,药物卵内注射、种蛋药浴、高温处理均能杀死卵内ＭＧ,但以研制的种蛋浸泡剂药浴效果为最好。     

猪毛色遗传的研究进展

本文概述了猪的毛色类型、猪的毛色遗传模式,着重综述了猪毛色基因分子基础的研究进展,指出存在问题并就未来发展方向做了思考。     

Comparison of 2 methods of centesis of the bursa of the biceps brachii tendon of horses

REASONS FOR PERFORMING STUDY: Centesis of the bicipital bursa using an 8.9 cm long spinal needle has been reported but the alternative of employing a 3.8 cm long hypodermic needle requires validation. OBJECTIVE: To compare the efficacy of 2 different methods of centesis of the bicipital bursa and to evaluate the usefulness of ultrasonographic imaging to determine the location of solution administered when centesis of the bursa is attempted. METHODS: For Trial 1, 6 clinicians, who had no previous experience of centesis of the bicipital bursa, attempted to inject a solution composed of an aqueous radiopaque contrast medium and physiological saline solution (PSS) into the bicipital bursae of 2/12 horses using the previously described distal approach to inject one bursa and a proximal approach to inject the contralateral bursa. The bicipital tendon and bursa were examined ultrasonographically before and after injection; and both shoulders were examined radiographically to identify the location of the medium. In Trial 2, another 6 clinicians, also with no previous experience of centesis, repeated Trial 1, using 6 horses, but the radiopaque contrast medium was mixed with air instead of PSS. RESULTS: Accuracy of centesis using the proximal approach was 39% and that of the distal approach 28%. Ultrasonographic examination of the shoulder allowed the location of solution and air to be accurately predicted in all 12 shoulders examined. CONCLUSIONS: Clinicians who have had no previous experience performing centesis of the bicipital bursa are unlikely to be successful in centesis using either approach. Radiographic examination after injecting a radiopaque contrast medium may be necessary to assess the success of centesis especially if bursal fluid is not obtained during centesis. Injecting air along with the radiopaque contrast medium provides more accurate ultrasonographic confirmation of centesis and better radiographic definition than does injection without air.     

不同样本商品蜂蜜中硒含量的测定

用硝酸和高氯酸消化蜂蜜,使硒游离出来,在微酸性环境下,硒和2,3-二氨基萘(DAN)生成有较强荧光的物质,用环己烷萃取,在激发波长378nm,荧光波长518nm处测定其荧光强度。蜂蜜中硒含量范围:0.10～0.82μg/g。表明:蜂蜜应视为天然富硒营养品。     

乳酸杆菌益生作用机制的研究进展

乳酸杆菌作为益生菌广泛用于人和动物。本文综述了乳酸杆菌改善宿主健康的机制。乳酸杆菌可通过产生抗菌物质如乳酸、过氧化氢、细菌素,或者通过竞争营养或肠道黏附位点来抑制致病菌;通过诱导黏附素的分泌或阻止细胞凋亡而增强肠道的屏障功能,从而保护肠道。文章重点讨论了乳酸杆菌表面成分（表面蛋白、脂磷壁酸和肽聚糖）与肠道受体（Ｃ型凝集素受体、Ｔｏｌｌ样受体和 Ｎｏｄ样受体）,阐述了他们结合后启动免疫调节信号,调控肠道免疫功能以发挥改善健康作用的机制。