不同玉米自交系中导入SAMS基因的转化与检测

以优良玉米自交系丹598、郑58、昌7-2、掖478的茎尖为受体,采用农杆菌介导法将抗旱基因SAMS转入玉米,对转化植株进行PCR检测,共获得阳性植株35株,表明SAMS基因已经整合到玉米基因组中.同时对影响茎尖转化效率的主要因素进行研究.结果表明,侵染时间、菌液浓度、共培养时间和乙酰丁香酮对转化率影响显著.菌液OD600值为0.5～0.7,侵染15 min,共培养3d,乙酰丁香酮浓度为100 μmol/L时,有利于提高玉米茎尖转化率,其中昌7-2转化率最高.     

转GhGST基因的棉花植株的获得

谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)受黄萎病菌诱导表达,对黄萎病具有抗性。为明确该基因在棉花中抗黄萎病功能,本研究在前期工作基础上,以陆地棉Coker312为受体,利用农杆菌介导的茎尖转化法对GhGST基因进行遗传转化,共获得132株卡那霉素抗性植株,利用PCR检测以及胶回收测序进一步确定了11株稳定的转基因阳性棉植株。转基因植株的获得为后续GhGST基因功能研究及棉花新品种培育提供了基础材料。     

大白菜(Brassica chinensis)的雄性不育基因转化

用共培养法,以根癌农杆菌质粒为载体,携带雄性不育基因和抗卡那霉素基因作报告基因,另以该农杆菌携带的抗利福平基因作为农杆菌的筛选培养。以大白菜幼苗的茎尖作为受体,转化后的幼苗,用卡那霉素进行筛选。筛选得到的转化苗经ＰＣＲ检测,证明雄性不育基因已转入大白菜。     

甘薯悬浮细胞系的建立及对抗草甘膦基因的遗传转化

选取8个四川主栽甘薯品种为材料,剥离茎尖诱导胚性愈伤组织,建立胚性细胞悬浮培养系。以烟草叶片和川薯20悬浮细胞为受体材料,利用农杆菌浸染方法转化抗除草剂基因EPSPS。结果表明,经PCR检测及草甘膦喷施试验后,获得了抗草甘膦阳性甘薯植株13株、阳性烟草植株25株,此实验为以EPSPS基因作为遗传转化的标记基因提供了帮助。     

利用玉米茎尖技术转化TR1-EPSPS

茎尖转化法是目前发展较快的农杆菌转化技术。本研究利用茎尖转化法将载体pCambia-35S-TR1-EPSPS转入玉米的自交系中,通过草甘膦除草剂筛选得到46株抗除草剂的玉米幼苗,通过PCR验证,这些幼苗中有9株含有外源载体片段。     

大豆铁蛋白基因GmFerritin在玉米中的遗传转化

使用In-Fusion试剂盒构建表达载体pCUB-Zein::ferritin-35s::bar,以玉米自交系齐319茎尖分生组织为受体,采用农杆菌介导法,将玉米胚乳特异启动子基因15 kDβ-Zein驱动的大豆铁蛋白ferritin基因转入玉米,共筛选出272株除草剂(草铵膦)抗性植株,其中108株PCR检测呈阳性,转化率达3.6%,初步判断Zein::ferritin基因已转入玉米基因组中。     

棉花茎尖农杆菌转化体系的建立

[目的]建立高效的以草甘膦为选择剂的棉花茎尖农杆菌遗传转化体系。[方法]以中棉35号、中棉27号、石远321和珂字312号4个陆地棉品种茎尖为遗传转化受体材料,采用农杆菌介导转化法,结合草甘膦筛选,探讨了影响棉花茎尖遗传转化效率的几个重要因素。[结果]棉花茎尖对草甘膦极为敏感,所有品种棉花茎尖均在60μmol／L草甘膦浓度下停止生长。对茎尖用OD600=1．0菌液浸染20min、预培养2d、恢复培养1周和共培养72h的处理能显著提高棉花遗传转化效率。对所有成活转基因棉株进行PCR检测的结果表明,所有植株均能扩增出目的基因aroA—M1 1．3kh的特定条带。[结论]该研究为进一步加速转基因棉花的产业化进程奠定基础。     

通过玉米茎尖转化耐草甘膦基因2mG2-epsps及抗性鉴定

以X2211、78599等10个优良玉米自交系的茎尖为受体材料,采用农杆菌介导和真空负压法将抗除草剂基因2mG2-epsps转入玉米茎尖生长点分生组织细胞,转化后的茎尖经共培养3 d,植入花盆,3叶1心经除草剂(glyphosate,草甘膦)筛选,产生耐草甘膦1‰~1.25‰植株,移栽大田。从种子萌发准备茎尖到转化苗喷施除草剂筛选、移栽大田,整个周期只需30 d左右。同时,经特异PCR检测表明:2mG2-epsps基因已整合进部分植株。     

农杆菌介导的海岛棉茎尖再生体系及其遗传转化影响因子的研究

采用根癌农杆菌LBA4404和EHA105介导,对海岛棉的茎尖再生体系及其转化影响因子进行了研究。茎尖培养与棉花体细胞胚胎发生相比,不同基因型的茎尖再生频率差异不明显;在9种不同的激素组合中,以6-BA0.5 mg/L NAA0.1 mg/L与1/2MSB5 IBA 0.1 mg/L对茎尖的再生效果较好;获得较高转化频率的海岛棉培养条件为:海岛苗茎尖在OD600值为0.6~0.8农杆菌菌液中感染20~30 min,共培养3 d后进行转接,在含有不同激素和抗生素的各类培养基中进行抑菌和筛选继代培养,选择压以50~150 mg/L梯度进行;农杆菌以EHA105菌株的转化效果较好;抗性苗用SDS-CTAB法提取其总DNA,进行PCR扩增检测,有7株PCR检测呈阳性反应。由此,初步证明外源抗虫基因已经进入到再生植株的细胞核中。     

绿色棉花再生体系建立的研究

[目的]对农杆菌法介导的绿色棉花茎尖转化体系进行筛选优化,为基因工程辅助彩棉育种提供参考。[方法]以天然绿色棉的茎尖作为受体,采用农杆菌介导的转化方法,筛选绿棉茎尖再生体系的最佳条件。[结果]3日龄的绿棉茎尖为最佳转化外植体;在OD600值为0.5的农杆菌菌液中侵染10 min,同时辅助真空渗透的侵染效果最佳;在茎尖最适培养基MS＋l mg/LKT,pH值5.8上共培养24 h,转至Kan浓度梯度为30-50-70 mg/L的筛选培养基上选择培养,茎尖分化苗阳性率达34.6%,并获得了绿棉9804的Kan阳性苗。[结论]绿色棉花比白色棉花更有利于进行遗传转化。     

农杆菌介导TLPD34基因的玉米遗传转化及检测

以玉米优良自交系郑58为受体材料,将抗真菌病害的水稻类甜蛋白基因(TLPD34)转入玉米,获得451株转化植株,经200mg/L草胺磷有效质量浓度筛选,得到57株抗性苗,T0代检测后,最终获得13株阳性植株,转化率达2.9%。对T0代PCR检测呈阳性的植株进行RT-PCR发现,部分植株能够进行正常转录。表明该方法能将外源基因TLPD34整合到玉米自交系郑58基因组中并进行正常转录。     

纤维素酶基因(BGLⅠ、CBHⅡ)与DREB1A基因双价植物表达载体的构建

本研究以pAHC17、pCD29A质粒为基础,分别构建了玉米泛蛋白(Ubi)启动子调控的纤维素酶基因(BGLⅠ、CBHⅡ)与rd29A启动子调控的DREB1A基因的双价植物表达载体pBDB,pBDC。其植物选择标记基因为乙酰CoA转移酶基因(BAR),该载体适用于单子叶植物的遗传转化。并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为利用农杆菌介导法进行BGLⅠ,CBHⅡ和DREB1A基因对单子叶植物的基因工程研究奠定了基础。     

纤维素酶基因（BGLI、CBHⅡ）与DREBIA基因双价植物表达载体的构建

本研究以pAHCl7、pCD29A质粒为基础，分别构建了玉米泛蛋白（Ubi）启动子调控的纤维素酶基因（BGLI、CBHII）与rd29A启动子调控的DREBlA基因的双价植物表达载体pBDB，pBDC。其植物选择标记基因为乙酰CoA转移酶基因（BAR），该载体适用于单子叶植物的遗传转化。并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中，为利用农杆菌介导法进行BGLI，CBHlI和DREBlA基因对单子叶植物的基因工程研究奠定了基础。     

转Bt cry1Ah/cry1Ie双价基因抗虫玉米的研究

构建了含有人工改造的抗虫基因Bt cry1Ah、cry1Ie和耐除草剂基因2mG2-epsps的植物表达载体pMUHUESGM,利用基因枪法将表达盒片段转化玉米愈伤组织,以2mG2-epsps基因为筛选标记基因,经草甘膦异丙胺盐筛选获得24株T0代再生植株,其中PCR检测阳性植株有20株。T0和T1代植株的分子检测结果证明了外源基因已经整合到玉米基因组中并能够稳定遗传和表达,转基因株系在田间生物活性检测中表现出较好的抗虫性,这为培育抗虫玉米新品种提供了参考,同时本研究中采用了基因枪片段转化法,提高了转基因的生物安全性。     

转cry1Ab13基因玉米新种质的创制

【目的】构建包含抗鳞翅目害虫基因cry1Ab13的重组植物表达载体,并利用其创制对玉米螟Ostrinia furnacalis具有优良抗性的转基因玉米Zea may L.新种质。【方法】利用同源重组法将cry1Ab13基因连接到表达载体pCAMBIA3300-Bar上,获得以抗除草剂Bar基因为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA3300-cry1Ab13-Bar。通过农杆菌介导法转化玉米自交系H99幼胚,对再生植株进行逐代除草剂筛选、PCR检测及T2代植株的Southern blotting检测、实时荧光定量PCR检测,并对转基因植株进行田间及室内抗虫性鉴定。【结果】构建了cry1Ab13基因的植物表达载体,转化玉米获得3株高抗玉米螟和1株抗玉米螟的T2代转基因植株。Southern blotting证明cry1Ab13基因已经整合到玉米基因组中,实时荧光定量PCR结果表明cry1Ab13基因已经在玉米植株内表达。抗虫性鉴定结果表明,与对照相比转基因植株对玉米螟的抗性显著提高。【结论】将cry1Ab13基因导入玉米并成功表达,显著提高了转基因玉米对玉米螟的抗性,为抗虫玉米新种质的创制奠定了基础。     

玉米ZmERD4基因的分离及转基因株系的获得

为了获得转ZmERD4基因玉米植株,验证ZmERD4在玉米育种中的应用价值,通过同源克隆的方法在抗旱性强的玉米自交系CN165中克隆了ZmERD4基因全长cDNA,该基因全长2 073 bp,包含一个编码591个氨基酸的开放阅读框;推导的氨基酸序列和水稻中的OsERD4(XP476646)有82％的相似性,与拟南芥中的...     

利用花粉管通道法将耐草甘膦基因mG2-epsps 导入玉米自交系的研究初报

构建了含有耐草甘膦基因mG2-epsps的植物表达载体pUmG2,采用花粉管通道法将其导入优良玉米自交系X90中,对Tn代1542株植株进行草甘膦喷洒实验,共得到32株能够耐受0．25％草甘膦药液的抗性植株;对这32株抗性植株的PCR检测结果表明,其中29株为PCR阳性植株,平均转化率为1．88％;Southern杂交和Western杂交检测结果证明mG2-epspps基因已整合至玉米基因组并正确表达。     

Acquisition of Insect-Resistant Transgenic Maize Harboring a Truncated cry1Ah Gene via Agrobacterium-Mediated Transformation

A novel insecticidal gene cry1Ah was cloned from Bacillus thuringiensis isolate BT8 previously for plant genetic engineering improvement. Truncated active Cry1Ah toxin has a toxicity level similar to that of the full-length Cry1Ah toxin. In this study, plant expression vector pMhGM harboring truncated cry1Ah gene was transformed into maize (Zea mays L.) immature embryos by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation at which maize alcohol dehydrogenase matrix attachment regions (madMARs) were incorporated on both sides of the gene expression cassette to improve gene expression. A total of 23 PCR positive events were obtained with a transformation efficiency of 5% around. Bioassay results showed that events 1-4 and 1-5 exhibited enhanced resistance to the Asian corn borer (Ostrinia furnacalis). These two events were further confirmed by molecular analysis. Southern blot suggested that a single copy of the cry1Ah gene was successfully integrated into the maize genome. Western blot and ELISA showed that the foreign gene cry1Ah was expressed stably at high level in maize and could be inherited stably over generations. The results of a bioassay of T1-T4 transgenic maize plants indicated that the transgenic plants were highly toxic to the Asian corn borer and their resistance could be inherited stably from generation to generation. Thus, events 1-4 and 1-5 are good candidates for the breeding of insect-resistant maize.