一株大凉疣螈肠道弗氏柠檬酸杆菌的分离及其药敏试验

首次从大凉疣螈（Tylototriton taliangensis）肠道分离获得弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）,利用分子生物学方法对其16SrD—NA进行了扩增测序,并与GenBank中已有的有关序列进行比较,进行了系统发育分析．．测序结果表明,16SrDNA与GenBank中序列同源率在98％～99％,分离的菌株与GUl26681（C．freundii MRB0903）处于同一分支中;序列同源性及系统发育树表明,此菌为弗氏柠檬酸杆菌;药敏试验表明,弗氏柠檬酸杆菌对氨苄西林及头孢噻吩中介,对其余药物均敏感。     

加州鲈源弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及耐药性分析

【目的】明确引起佛山市三水某水产种苗有限公司育种基地加州鲈（Micropterus salmonoides）体表出血和溃烂的病原菌,并进行药物敏感性分析,为该病的临床诊断及科学防控提供科学依据。【方法】采用常规细菌分离方法从患病加州鲈的肝脏、脾脏和肾脏等组织中分离病原菌,经革兰氏染色和磷钨酸负染后,使用光学显微镜和透射电子显微镜观察菌体形态及其染色特性;通过ATB Expression生化鉴定仪和Biolog微生物自动鉴定系统进行生理生化特性鉴定,基于16S rRNA序列和gyrB基因序列进行分子生物学鉴定,经人工回归感染试验和组织病理学观察进一步确定病原菌的致病性及其对组织细胞的损伤,同时以K-B纸片扩散法测定其药敏特性。【结果】从患病加州鲈肝脏中分离获得1株优势菌株（180803bj_jzl）,为周鞭毛的革兰氏阴性杆菌,Biolog微生物系统自动鉴定其为弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacter freundii）的可能性高达99.4%;基于16S rRNA序列和gyrB基因序列相似性构建的系统发育进化树均显示,分离菌株180803bj_jzl与弗氏柠檬酸杆菌聚类为一支,与GenBank已公布弗氏柠檬酸杆菌参考菌株的16S rRNA序列相似性均在99.00%以上,gyrB基因序列相似性则在91.00%以上。人工回归感染7 d内的累积死亡率达60%,临床症状与自然发病加州鲈的症状基本相同;其肝脏组织中央静脉和肝窦有红细胞淤积,肝细胞质内有大量空泡,呈散在变性坏死;脾脏的白髓与红髓分界不清,脾窦和脾小血管内有嗜铁血红素中心;鳃小片上皮细胞与毛细血管分离,呈球拍状,部分上皮细胞坏死脱落,只残存少量鳃小片骨架。分离菌株180803bj_jzl对氟罗沙星、氧氟沙星、大观霉素、新霉素、庆大霉素、恩诺沙星和诺氟沙星等7种抗菌药物敏感,对多西环素、四环素、乙酰螺旋霉素、罗红霉素、头孢氨苄和阿莫西林等15种抗菌药物已产生耐药性。【结论】弗氏柠檬酸杆菌感染可引起加州鲈体表出血和溃疡,且具有较强的毒力,致使肝脏、脾脏和鳃等组织病理损伤,实际生产中可选用新霉素和恩诺沙星等渔用抗菌药物进行防治。     

巴西龟弗氏柠檬酸杆菌病的临床症状及组织病理观察

为观察巴西龟弗氏柠檬酸杆菌病的临床症状及其组织病理学特征,采用人工感染试验、石蜡切片和HE染色方法进行组织病理研究。结果表明,感染发病龟主要表现为眼结膜发炎、口鼻皮肤溃烂,解剖可见肺部发黑,肠道淡黄色,无内容物、水样黏液增多等临床症状;组织病理学观察显示眼睑上皮组织色素细胞增多,胃和肠上皮细胞变性、坏死、脱落,心脏心肌纤维间隙变宽、坏死且有大量炎性细胞浸润,肺脏肺泡细胞与血管内皮细胞界限不清、肺泡壁毛细血管淤血,肝脏肝细胞坏死、中央静脉淤血、肝细胞索紊乱,肾脏肾小管上皮细胞坏死,肾小球出血,肌肉肌纤维间隙有大量炎性细胞浸润。以上结果为阐明龟类弗氏柠檬酸杆菌病的致病机理提供一定参考。     

大鲵源弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及胞外酶活性研究

为了确定重庆武隆大鲵养殖场患病大鲵的病原菌,并进行菌种鉴定及胞外酶活性研究,从具有典型症状的病鲵肝脏分离出一株菌株TNL12,根据形态学特征、生理生化特性及16SrDNA分析对菌株进行种类鉴定,通过人工感染试验确定病原菌株的致病性,利用平板法检测胞外酶活性.结果显示,所获菌株为革兰氏阴性短杆菌,无芽孢,其生理生化特性与弗氏柠檬酸杆菌一致.16SrDNA分析表明,TNL12与弗氏柠檬酸杆菌的同源性为99%,在系统发育树上与弗氏柠檬酸杆菌聚为一支.该病原菌可引起健康青蛙、大鲵出现感染症状,且感染症状与自然发病症状相似.胞外酶活性检测发现该菌可产卵磷脂酶、淀粉酶,但不产脂酶、蛋白酶、明胶酶、脲酶等胞外酶.这些研究结果表明,从患病大鲵中分离出的病原菌为弗氏柠檬酸杆菌,且对大鲵有较强的致病性.     

湛江水产品中大肠菌群的分离鉴定与分类研究

水产品中大肠菌群超标现象较为常见,为了更好地控制水产品中微生物安全,对湛江部分水产品中的大肠菌群进行分离、鉴定和分类研究。2012 年11 月耀2013 年1 月,从湛江地区采集及获得的55 份大肠菌群阳性水产品样品中分离纯化得到65 株菌,通过常规生化鉴定和VITEK2 系统鉴定,最终确定63 株分别属于8 种大肠菌群,其中弗氏柠檬酸杆菌24 株、大肠埃希氏菌14 株、阴沟肠杆菌13 株、肺炎克雷伯氏菌7 株、其他大肠菌类型5 株,分别占菌株鉴定总数的38.10%、22.22%、20.63%、11.11%、7.93%,另有2 株细菌未鉴定出所属大肠菌类型。不同种类水产品均检出弗氏柠檬酸杆菌;冻罗非鱼片大肠菌群主要为弗氏柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌,占本样品检出菌株的77.27%;而鲜活对虾和贝类大肠菌群类型主要为弗氏柠檬酸杆菌和大肠埃希氏菌,占本类样品检出菌株的65.79%;对于冷冻水产品,均未检出大肠埃希氏菌,未经加工的水产品较加工水产品大肠菌群种类多。     

中华绒螯蟹致病性弗氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及其药敏特性

[目的]明确中华绒螯蟹黑鳃病的病原菌及其药敏特性,为该病的临床诊断和防控提供科学依据.[方法]采用传统方法从患黑鳃病的中华绒螯蟹肝胰腺组织中分离病原菌,通过人工回归感染试验确定病原菌的致病性,利用API 20E细菌鉴定系统和16S rRNA序列分析对病原菌进行鉴定,并以K-B药敏纸片扩散法测定其药敏特性.[结果]从患黑鳃病的中华绒螯蟹肝胰腺中共分离获得4株疑似病原菌株(C1、C2、C3和C4),人工回归感染试验结果表明,仅C1菌株感染中华绒螯蟹后出现死亡,死亡率达90%,且试验中华绒螯蟹出现黑鳃、肝胰腺呈浅黄色的病症,与自然发病的症状基本一致.依据C1菌株的生理生化特性及16S rRNA序列分析结果,可确定C1菌株为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii),其对健康中华绒螯蟹的半数致死剂量(LD50)为2.85×105 CFU/mL.药敏试验结果表明,C1菌株对新霉素、阿米卡星、庆大霉素、链霉素、多西环素、四环素、复方新诺明、氧氟沙星和恩诺沙星等9种抗生素高度敏感,对多粘菌素B中度敏感,对氨苄西林、羧苄青霉素和万古霉素3种抗生素已产生耐药性(不敏感).[结论]弗氏柠檬酸杆菌感染可引起中华绒螯蟹黑鳃病,且对中华绒螯蟹具有较强毒力,实际养殖生产中可选用新霉素、多西环素等渔用抗生素进行防治.     

草鱼肠道不动杆菌的分离鉴定及药敏试验

从草鱼肠道中分离获得1株细菌,编号为CAX1,进行细菌形态学观察、理化特征、16S r DNA序列分析及药敏试验等研究。结果表明CAX1菌株为革兰氏阴性短杆菌,进一步采用PCR方法扩增其16S r DNA,测序显示其大小为1 531 bp,序列比对表明CAX1分离株与厦门不动杆菌新种(Acinetobacter xiamenensis)16S r DNA同源性达97.1%,系统进化树分析显示CAX1菌株与不动杆菌亲缘关系最近,自然聚类为1支;药敏试验结果显示CAX1菌株对庆大霉素、阿莫西林、氨苄西林、头孢哌酮等药物敏感。     

弗氏柠檬酸杆菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR诊断方法的建立及耐药性分析

根据GenBank中弗氏柠檬酸杆菌ompA基因序列,设计1对特异性引物,PCR扩增弗氏柠檬酸杆菌ompA基因片段,T克隆到pMD-18T载体上构建标准阳性质粒。通过SYBR GreenⅠ荧光定量PCR反应条件优化,建立弗氏柠檬酸杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR诊断方法,结果显示重复性好、特异性高,灵敏度可达1.0×10~1拷贝/μL,说明建立的弗氏柠檬酸杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法适合于弗氏柠檬酸杆菌病临床疑似病料样品的快速诊断。对分离得到的83株弗氏柠檬酸杆菌进行药敏试验,结果表明冷水鱼养殖中耐药性问题日益严重。     

蟹源弗氏柠檬酸杆菌拮抗菌PNB3的分离鉴定与安全性分析

摘 要：筛选和鉴定抗水产致病性弗氏柠檬酸杆菌的优良芽孢杆菌,并分析其安全性。以一株蟹源致病性弗氏柠檬酸杆C1作为筛选指示菌、抑菌圈直径和抑菌效果作为指标进行抗菌芽孢杆菌优良菌株的分离与筛选,综合生理生化鉴定与16S rRNA序列分析对抗菌芽孢杆菌优良菌株进行鉴定,并参照《HJ/T 415—2008 环保用微生物菌剂环境安全评价导则》、《NY/T1444-2007微生物饲料添加剂评价通则》等国家标准,从毒力基因、耐药性、对小球藻生长的影响以及对斑马鱼和中华绒螯蟹的致病性等方面分析抗菌芽孢杆菌优良菌株的安全性。结果显示,从养殖淤泥中分离并筛选出一株抗菌芽孢杆菌优良菌株PNB3,其在1.0×105 CFU/mL时与蟹源致病性弗氏柠檬酸杆菌C1共培养处理120 h的最高抑菌率达到了99.99%。结合生理生化鉴定以及16S rRNA序列分析,菌株PNB3被鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),不含溶血素BL基因、肠毒素Nhe基因、肠毒素T基因、肠毒素FM 基因、细胞毒素 K 基因、呕吐基因、多效调控因子等毒力基因,对复方新诺明、氨苄西林、诺氟沙星、卡那霉素、多粘菌素B、氟苯尼考、庆大霉素、依诺沙星、头孢拉定、青霉素等10种抗生素高度敏感,对多西环素、四环素等2种抗生素中度敏感,对链霉素耐药,在终浓度为2.0×104~2.0×108 CFU/mL时对小球藻的生长有促进作用,对斑马鱼的半数致死浓度（LC50）大于2.0×108 CFU/mL,对中华绒螯蟹的半数致死浓度（LC50）大于2.0×108 CFU/g。地衣芽孢杆菌PNB3是一株具有潜在安全性的弗氏柠檬酸杆菌拮抗菌,具备应用于中华绒螯蟹弗氏柠檬酸杆菌病生物防控的安全基础。     

3株产β-甘露聚糖酶菌株的分离和鉴定

从新疆极端干燥环境土壤样品中,以葡甘露聚糖(魔芋精粉)为唯一碳源,利用水解圈筛选法筛选到3株具有β-甘露聚糖酶活性的菌株.分别提取3株细菌基因组并经16S rRNA序列比对分析,确定3株菌分别属于芽孢杆菌(Bacillus sp.)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa).     

棘胸蛙柠檬酸杆菌的分子鉴定及防治技术

为确定导致棘胸蛙烂皮病的病原菌及其防治方法,从病死的棘胸蛙头部、腿部和肝部分离得到3株病原菌,分别命名为LJ10201、LJ10202、LJ10203。经形态学观察、生理生化实验、16SrDNA基因序列测定及系统发育学分析鉴定,确认LJ10201、LJ10203菌株为弗氏柠檬酸杆菌,LJ10202菌株为布氏柠檬酸杆菌,分离得到的菌株感染健康棘胸蛙可使棘胸蛙出现烂皮病症状。分离得到的LJ10201菌株对新霉素、头孢拉定(先锋Ⅵ)等9种药物敏感,LJ10202菌株对头孢拉定(先锋Ⅵ)、氯霉素敏感,菌株LJ10203对新霉素、阿奇霉素等8种药物敏感。本研究为棘胸蛙柠檬酸杆菌的分离鉴定及防治提供了理论基础。     

克氏原螯虾源布氏柠檬酸杆菌的分离鉴定及药敏试验

为确定湖北省某养殖场致克氏原螯虾死亡的病原,从克氏原螯虾中分离得到1株优势菌,命名为X2016。药敏试验结果表明,分离菌株X2016对氟苯尼考、恩诺沙星、盐酸多西环素、硫酸新霉素、氯霉素和环丙沙星敏感,对红霉素、阿莫西林、庆大霉素、阿奇霉素耐药。经形态学观察、生化试验、16S rRNA基因序列测定及系统发育学分析,鉴定为布氏柠檬酸杆菌。通过动物回归试验,可分离到与自然发病克氏原螯虾相同的细菌,且患病症状一致,本研究为克氏原螯虾源布氏柠檬酸杆菌的防治提供了科学依据。     

中华鳖弗氏柠檬酸杆菌的鉴定及病理组织观察

为了确定重庆地区仿生态养殖中华鳖(Pelodiscus sinensis)患病死亡的原因,从患病鳖的肠道分离得到一株优势菌PS01,对该菌进行了形态学观察、人工感染、生理生化特性测定、16S rRNA和gyrB基因序列分析、病理切片观察以及药敏试验。结果表明:人工感染中华鳖患病症状同自然发病症状;16S rRNA和gyrB序列构建的进化树表明,该菌与弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)同为一枝,相似性分别为99.7%、98.7%;病理组织观察发现,患病中华鳖的肝、脾、肾、胰和肠均有不同程度病变,其中以肠、肝脏、脾脏3个组织病变最为严重,肠绒毛大部分坏死脱落、肝细胞肿胀、胞核空泡化、脾脏红白髓混合分布、胰脏和肾脏轻度病变、胰腺细胞与肾小管上皮细胞肿大,其余组织未观察到明显变化。药敏试验表明,菌株PS01对多西环素等18种抗菌药物高度敏感,对氟苯尼考等3种抗菌药物中度敏感,对复方新诺明等18种抗菌药物表现为耐药。研究结果表明,弗氏柠檬酸杆菌为中华鳖的致病菌,其对30 g左右的中华鳖半致死浓度为9.3×10⁴ CPU·g^-1,有较强的致病性,可造成中华鳖多个组织病变。     

鲫鱼鳃中迟钝爱德华氏菌的分离与鉴定

以市售鲫鱼(Carassius auratus)为研究对象,从鳃中分离获得一株细菌,编号为Et-1,通过细菌形态学观察、理化特征鉴定、16S rDNA克隆测序及系统发育进化树构建等方法进行系统鉴定,结果表明Et-1菌株为革兰阴性杆菌,进一步PCR扩增Et-1菌株的16S rDNA序列为1 508 bp;系统进化树分析表明,Et-1菌株与迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)亲缘关系最近,自然聚为一支,序列同源性达98.7％～100％,最终确定Et-1为迟钝爱德华氏菌.     

鲢鱼肠道细菌的分离鉴定及药敏试验

从鲢鱼肠道中分离得到2株细菌,菌株编号为SC-1、SC-2,并进行细菌形态学、生理生化特性、药敏试验等研究。结果表明:2株细菌均为革兰氏阴性菌,氧化酶阴性,过氧化氢酶阳性,吲哚和VP试验阴性,均不产生苯丙氨酸脱氨酶,均能利用枸橼酸盐、葡萄糖、山梨醇、木糖等;采用数值编码鉴定,SC-1为费氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii),SC-2为罗氏耶尔森氏菌(Yersinia rohdei)。进一步的药敏试验分析显示,2株菌均对青霉素类(氨苄青霉素、氧哌嗪青霉素)、头孢菌素类(头孢孟多、头孢氨噻肟、先锋必素)、氨基苷类(庆大霉素、卡那霉素、乙基西梭霉素)等抗生素敏感。以上研究结果对揭示鱼类肠道菌群结构及鱼病防治等具有重要参考价值。     

圈养高山兀鹫肠道微生物分离、鉴定与抗生素耐药性分析

高山兀鹫(Gyps himalayensis)是国家Ⅱ级保护鸟类,被世界自然保护联盟(IUCN)列入濒危物种红色名录。本试验对圈养高山兀鹫粪便细菌进行分离与培养、16S rRNA基因扩增与测序、细菌耐药性测试。经鉴定,分离出的菌株隶属于2门、8属、9种,分别是弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、太平洋芽孢杆菌(Bacillus pacificus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、蜂房哈夫尼亚菌(Hafnia alvei)、豪氏变形杆菌(Proteus hauseri)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)、运动肉杆菌(Carnobacterium mobile)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)。这9种菌株对3到11种不等的抗生素表现出耐药性。其中,运动肉杆菌、粪肠球菌和普通变形杆菌可耐受大多数的抗生素。福氏志贺氏菌可耐受的抗生素种类较少。本研究为圈养高山兀鹫的肠道微生物及其抗生素耐药性提供了相关数据,进一步为高山兀鹫的保护性人工养殖提供参考。     

紫茎泽兰乙醇提取物对五龄思茅松毛虫肠道细菌的抑制作用

以思茅松毛虫五龄幼虫肠道细菌为供试菌,采用牛津杯法测定紫茎泽兰不同部位乙醇提取物的抑菌效果。结果表明:紫茎泽兰不同部位乙醇提取物除茎提取物外,对5种思茅松毛虫肠道细菌(共10株)均有不同程度的抑制作用,抑制作用大小顺序为叶>根>茎。在相同质量浓度下,叶提取物对5种肠道细菌的抑菌作用大小顺序为雷金斯堡约克氏菌(Yokenella regensburgei)>弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)>产酸克雷伯氏杆菌(Klebsiella oxytoca)>克雷伯氏杆菌(Klebsiella peneumoniae)>苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis),其对雷金斯堡约克氏菌、产酸克雷伯氏杆菌以及弗氏柠檬酸杆菌的最低抑菌质量浓度为0.125g/mL,对其余2种细菌的最低抑菌质量浓度分别为0.25g/mL、0.5g/mL。根提取液对雷金斯堡约克氏菌和克雷伯氏杆菌无抑制作用,在相同质量浓度下,其对其余3种细菌的抑制作用大小顺序与叶提取液相同,最低抑菌质量浓度为0.25g/mL。紫茎泽兰乙醇提取物具有良好的抑菌效果,可用于开发新型的植物源生物农药。     

自然发酵东北酸菜中乳杆菌的分离与鉴定

文章从15份自然发酵的东北酸菜样品中分离乳杆菌,并对其种属进行鉴定。通过形态学观察及H2O2酶、糖发酵等生理生化试验对所分离菌株进行初步鉴定,再利用16S rDNA序列同源性分析的方法对所分离菌株进行16S rDNA基因扩增与测序,并将测序结果与GenBank中该属内菌株的16S rDNA基因序列进行同源性比较分析。结果表明,从15份自然发酵的东北酸菜中分离获得21株菌,其中6株为植物乳杆菌,8株为短乳杆菌,6株为罗伊氏乳杆菌,1株为米酒乳杆菌。本研究为从多角度开发利用东北酸菜中的微生物资源提供依据。     

猪大肠杆菌性腹泻病的病原分离鉴定及药敏试验

通过对天津市某规模化猪场腹泻病猪实质脏器及肠道内容物的细菌分离培养、染色镜检、生化试验、PCR检测及药敏试验,对腹泻病的病原进行分离鉴定。结果表明:分离菌株在显微镜下呈革兰氏阴性短杆菌,生化反应特性与大肠杆菌一致;PCR扩增16S rRNA基因得到1 373 bp的目的条带,经同源性分析,该分离菌株与WTPii241菌株同源性为99.9%,最终确定该分离菌株为大肠杆菌。药敏试验显示该菌株对头孢哌酮和哌拉西林敏感,对头孢曲松、头孢呋辛、卡那霉素、氯霉素中度敏感,对氨苄西林、头孢唑林等8种药物耐药,上述试验结果为猪大肠杆菌性腹泻病的临床用药提供了理论依据。