利用CRISPR/Cas9敲除葡萄VviPDS1基因的研究

选择葡萄八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase)基因VviPDS1为靶标,利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除载体,瞬时转化葡萄叶片原生质体,检测到不同类型的突变。通过农杆菌介导转化‘无核白’葡萄胚性愈伤组织,筛选获得卡那霉素抗性植株71株。经PCR鉴定,其中53株为阳性植株,阳性率为74.64%。测序结果表明,共有20株在靶点发生不同类型的突变,编辑效率为37.74%;其中9株产生了双等位基因突变。对其进行氨基酸序列预测,在第202位氨基酸之后发生了不同程度的变异。利用CRISPR/Cas9系统敲除VviPDS1获得的突变体植株呈现整体矮化,其叶片出现不同程度白化。表明CRISPR/Cas9系统可以通过细胞中的瞬时或稳定表达进行基因编辑,可以实现在葡萄编辑植株中产生纯合敲除。     

苹果体细胞悬浮培养及植株再生研究

以苹果试管苗叶片的再生不定芽嫩叶为试材,对苹果体细胞悬浮系的建立及植株再生的影响因素进行了研究.结果表明:在MS+NAA 0.5 mg/L+BA 2.0 mg/L培养基上可诱导获得高活力的愈伤组织.将该愈伤组织转入MS+2,4-D 2.0 mg/L+BA 1.0 mg/L液体培养基中培养,采用无菌筛网分离获得含单个细胞和少于8～10个细胞的小细胞团进行继代培养,建立体悬浮细胞培养系.将悬浮细胞转到MS+2,4-D 2.0 mg/L+BA 1.0 mg/L的固体增殖培养基上暗培养25 d后,可形成微型愈伤组织,将该愈伤组织转到MS+BA 5.0 mg/L+IAA 0.5 mg/L的植株再生培养基上暗培养30 d后转入光下,光照培养30 d后53％的愈伤组织可再生植株.该研究建立的苹果体细胞悬浮培养技术,不仅可用于细胞融合及遗传转化过程中杂种细胞和转化细胞的分离及植株再生研究,而且对于利用组织培养技术筛选变异株系也具有重要意义.     

葡萄缺镁症的发生与防治

缺镁是葡萄生产中的常见病害，尤其在设施葡萄栽培中更为普遍。镁在葡萄的光合作用、氮代谢、糖的转化以及对磷的吸收与运输和消除钙过剩的毒害等方面起着较重要的作用。在果树中葡萄最容易发生缺镁症。若镁不足，植株光合作用受阻，生长发育不良，尤其对幼嫩组织的发育和种子成熟影响更大。     

中国野生葡萄醛脱氢酶基因在拟南芥中的过量表达

将质粒pWR306中包含ED35s启动子、Omega元件及TNOS终止子的一段核苷酸序列定向克隆到质粒pCAMBIA1300,构建了植物中间表达载体pWR-II;将重组质粒pGEM-T-ALDH的醛脱氢酶(ALDH)基因片段定向克隆到pWR-II,构建了葡萄ALDH基因的植物过量表达载体pWR-II-ALDH。采用改进冻融法将其导入农杆菌EHA105,采用花序浸蘸法转化拟南芥,获得了潮霉素抗性的转化拟南芥植株。PCR检测证明外源基因已整合进拟南芥基因组,Real-timePCR结果表明ALDH基因在转化植株的表达量远高于野生种。转化植株和野生植株在形态上有一定的差异,说明葡萄ALDH基因在拟南芥中表达对其生长发育有一定影响。     

葡萄抗病毒转基因研究进展

 迄今已发现63 种病毒侵染葡萄。利用转基因技术培育抗病品种是防控葡萄病毒病的重要手段之一。对葡萄再生体系和遗传转化方法及影响因素、葡萄抗病毒转基因研究进展,以及转基因植株检测、抗性评价和抗性机理等进行了综述,并对今后研究方向进行了讨论和展望。     

利用CRISPR/Cas9系统敲除葡萄中VviEDR2提高对白粉病的抗性

利用CRISPR/Cas9系统定点编辑葡萄白粉病感病基因VviEDR2（Enhanced disease resistance 2），在VviEDR2的DUF1336结构域设计靶位点VviEDR2-T1，构建CRISPR/Cas9敲除载体，通过农杆菌介导法转化‘无核白’葡萄胚性愈伤组织。对PCR阳性植株进行靶位点扩增测序，结果表明，共有8个转基因植株在靶位点处发生不同类型的双等位基因突变，编辑效率为32%；突变体植株生长势较弱，叶片较小，茎秆丛生、细弱。进一步对突变体植株进行抗病检测，结果表明，接种葡萄白粉菌（Erysiphe necator Schw.）5 d后，突变体植株叶片上白粉菌孢子仅能萌发出少量较短初级菌丝，表皮细胞产生大量明显的H2O2，而野生型叶片中白粉菌萌发出大量初级菌丝、次级菌丝和吸器，无明显H2O2产生。这些结果表明，可以利用CRISPR/Cas9技术编辑葡萄感病基因VviEDR2，提高葡萄白粉菌抗性。     

中国野生毛葡萄芪合酶基因VqSTS11和VqSTS23调控抗白粉病的研究

利用同源克隆法得到抗白粉病的中国野生毛葡萄‘丹凤–2’芪合酶基因VqSTS11和VqSTS23的开放阅读框，并构建过表达载体；通过器官发生途径诱导不抗白粉病的欧洲葡萄‘无核白’分生愈伤组织并采用农杆菌介导法对其进行转化；经过PCR检测和Western blot鉴定，获得了5株VqSTS11超量表达植株和3株VqSTS23超量表达植株；人工接种白粉菌发现，转基因植株中白粉菌菌丝生长速度慢，孢子萌发受到一定的抑制，并且转基因植株中芪合酶基因相对表达量升高，抗病相关基因表达上调，芪类物质含量积累增多。本研究结果进一步证明中国野生毛葡萄‘丹凤–2’芪合酶基因VqSTS11和VqSTS23对白粉菌具有抗性，‘丹凤–2’可以为改良欧洲葡萄品种抗病性提供抗病基因，作为抗病育种的资源。     

四川‘竹根姜’胚性细胞悬浮系的建立与植株再生

 选用四川省地方品种‘竹根姜’的茎尖组织建立了体细胞胚性细胞悬浮系, 并通过悬浮培养获得了姜再生植株。结果表明悬浮细胞干质量受pH影响。接种量和AgNO₃ 对悬浮细胞的生长都有影响:最佳接种量为1.0% , 最适AgNO₃浓度为6.0 mg·L ^{- 1}。胚性细胞悬浮系增殖后, 接种到前期筛选的成熟分化培养基上获得了再生植株。     

葡萄叶片植株再生及基因导入研究

葡萄不同组织的植株再生已多有研究 ,然而 ,葡萄的外源基因转移相对于其组织再生的难度大得多。迄今 ,大多限于砧木和酿造品种。国内 ,黄学森首次报道了葡萄外源基因转移工作 ,以后再未见报导。我们研究了不同品种的植株再生、抗生素对其再生植株的影响及外源基因转导 ,结果如下。1　材料和方法葡萄无病毒试管苗按常规方法进行快繁 ,苗高5cm左右、长有 3～ 5片展开叶时 ,切取完全展开的嫩叶 ,沿主脉横切数个伤口 ,远轴面接触培养基 ,置培养室进行再生植株诱导。培养基 :植株再生诱导培养基为NN 69 蔗糖 2 0 .0 g/L 琼酯 4 .5g/L附加 BA …     

枣愈伤组织培养及其应用研究进展

愈伤组织是进行植物离体培养与生物技术研究的常用材料。近年来，枣愈伤组织培养及其应用研究取得了重要进展。对枣茎段、叶片、花药和胚等不同组织的愈伤诱导培养体系及其在植株离体再生、多倍体诱导、遗传转化、悬浮细胞系建立、原生质体培养等领域的应用研究进展进行了综述，对今后的相关研究工作进行了展望，以期为枣愈伤组织培养的技术优化和科学利用提供借鉴和参考。     

葡萄根系腐解物的化感效应及酚酸类化感物质的分离鉴定

为探讨葡萄根系腐解物的化感作用,采用室内红地球葡萄（Vitis vinifera）组培苗和室外贝达葡萄（V.ri-paria×V.labrusca）盆栽苗相结合的方法,研究了葡萄根系腐解物的化感效应,并利用LC-MS技术对根系腐解物中的化感物质进行了分离鉴定。室内试验表明,0.01、0.05、0.1 g.mL-1（根系...     

葡萄试管苗在移栽过程中叶解剖和根系活力的变化

葡萄试管苗通过分步驯化后,能够高频率的成活。观察和测定了各驯化阶段叶解剖结构和根系活力的变化,结果表明,试管苗叶片薄,组织稀疏,气孔突起,开口大,根系活力极低。通过分步炼苗,叶片逐渐向旱生结构变化,根系活力迅速增强。这是试管苗逐渐适应低湿和自然光照的解剖和生理变化。     

葡萄试管苗根系修剪及药剂处理对其移栽成活率的影响

通过研究葡萄试管苗的剪根与不剪根,结合不同的催根剂及环境处理,研究其对移栽成活率的影响。结果表明:在葡萄试管苗进行移栽时,修剪根系的同时结合使用ASP 600 mg/kg可代替ABT 100 mg/kg。适当催根,有利于提高葡萄试管苗的根系生长,提高移栽成活率,降低葡萄试管苗工厂化育苗的生产成本。     

葡萄根系分泌物的化感效应及化感物质的分离鉴定

采用室内组培苗（‘晚红’葡萄,Vitis vinifera L.‘Red Globe’）和室外盆栽苗（‘贝达’葡萄, V. riparia × V. labrusca‘Beta’）,研究了葡萄根系分泌物的化感效应,并利用LC-MS技术对根系分泌物中的化感物质进行了分离鉴定。室内试验表明：0.01、0.10、0.50 g ∙ mL-1（根系干质量/培养基体积）浓度的根系分泌物显著抑制葡萄组培苗的生长,浓度越高抑制作用越强。盆栽试验显示葡萄根系分泌物在低浓度的情况下促进植株生长,叶片可溶性糖、淀粉及蛋白质含量增加,苯丙氨酸解氨酸（PAL）和超氧化物歧化酶（SOD）活性与对照差异不显著,丙二醛（MDA）含量减少;而在高浓度的情况下植株生长抑制显著,PAL和SOD活性被激活,分别比对照提高了69.16%和10.35%,MDA含量增加。LC-MS检测结果确定葡萄根系分泌物中含有对羟基苯甲酸和水杨酸两种酚酸类物质,推断含有软脂酸、1–二十一醇、柠檬酸、乌头酸、β–谷甾醇、邻苯二甲酸和没食子酸。采用‘山河二号’葡萄（V. amurensis × V. riparia ‘Shanhe 2’）组培苗检测证明对羟基苯甲酸和水杨酸对葡萄具有显著的化感抑制作用。     

葡萄LIM家族基因特征及表达模式分析

为了明确LIM家族基因在葡萄非生物胁迫下的表达特性，在生物信息分析的基础上，以‘黑比诺’葡萄（Vitis vinifera‘Pinot Noir’）试管苗为试验材料，利用qRT-PCR技术检测了不同逆境处理对葡萄LIM家族基因成员表达的影响。结果显示，葡萄LIM基因家族有14个成员，可分为4个亚族，各亚族编码蛋白氨基酸数量差异较大，但亚族内差异较小；分析葡萄基因和拟南芥基因间的选择压发现，二者存在钝化选择关系；多序列比对发现，该家族基因成员含有1或2个锌指结构的保守结构域；保守基序分析结果表明，所有基因均包含motif2；基因结构显示VvLIM含有4 ~ 15个外显子；14个基因中有11个编码蛋白存在互作关系。该家族基因存在大量的光诱导元件和水杨酸等逆境胁迫相关元件。基因芯片表达数据表明，高表达的基因主要存在生长旺盛的组织中。qRT-PCR分析发现，VvLIM1在100 mmol ? L-1 NaCl、10% PEG和50 mg ? L-1 SA胁迫下表达量与对照相比显著上调，且随处理时间的延长表达量显著增加。     

供氮对葡萄试管苗氮素利用及分布的影响

以维多利亚葡萄组培苗为材料,在改良B5培养基不同供氮水平下,研究了葡萄试管苗根、茎、叶对氮素的吸收、利用及对株高、茎粗、根数、根长的影响。结果表明:培养基中氮素越低试管苗氮的利用率越高,过量氮的供给并不能增加试管苗茎、叶对氮的利用。试管苗在不同发育阶段氮的分配不同,全氮含量在根中表现为前期高、后期低,而在茎、叶中则表现为先低后高。35d时减氮处理根中氮最高;标准氮、增氮处理叶中最高;氨态氮以增氮处理在各器官中含量为高;而蛋白质氮则以标准氮处理最高。     

三倍体葡萄种质创新及倍性快速鉴定

 以二倍体葡萄品种玫瑰香、红地球、摩尔多瓦、无核奥迪亚及四倍体葡萄品种巨峰为亲本进行杂交授粉,对杂种进行胚培养,成株率最高可达30.6%。对杂种后代用流式细胞仪初选,确定30个杂交后代为三倍体植株。组合不同,获得三倍体植株的比例不同,目前获得的225个胚培养的葡萄杂种后代全部栽入大田。     

肥城桃组培苗诱导、基因转化及其增殖

红里、白里是肥城桃的两个优良品种,但不耐贮藏。为试图利用基因工程解决这一问题,先通过组培将其胚、胚乳、子叶的愈伤组织分别诱导再生植株和芽剥离出茎尖培育成苗。再将肥城桃反义PG基因,通过农杆菌介导转化组培苗,转化苗在含卡那霉素培养基上筛选,获得抗卡那霉素的转基因苗。用研制的增殖培养基培养4～7周,一个苗可生长出14～18分枝的苗,解决了转基因苗获得率低的问题,也满足了对转基因株系进行检测和从组培室到温棚到田间果园过渡栽培和芽接的需求,提高了繁育速率。     

内39号葡萄株系的离体快繁技术研究

利用一个新育鲜食葡萄内39号株系,在原离体快繁技术基础上,改进取材时间和繁殖技术,同时配合试管苗绿枝扦插,经过9个月的繁殖,生产出2.32万株生产用苗。逐月统计了实际生产数,表明葡萄离体快繁技术确实可缩短育种年限,用于育种实践。