敲低SQLE基因对奶牛乳腺上皮细胞增殖及凋亡的影响

为了探讨角鲨烯环氧酶（squalene epoxidase,SQLE）基因对体外培养奶牛乳腺细胞凋亡及增殖的影响,本研究用RNAi技术敲低奶牛乳腺上皮细胞中SQLE基因;用实时荧光定量PCR方法检测奶牛乳腺上皮细胞中SQLE基因及凋亡和周期相关基因的表达;用CCK-8法检测其对细胞增殖的影响;用周期和凋亡检测试剂盒筛选细胞,用流式细胞术准确计数处于不同周期的细胞数和凋亡细胞数。结果显示,奶牛乳腺上皮细胞转染siRNA后,SQLE基因相对表达量显著下降（P<0.05）,细胞增殖受到极显著抑制（P<0.01）;G1期细胞数量显著下降（P<0.05）,G2期细胞数量没有显著性改变,S期细胞数量显著上升（P<0.05）;肿瘤坏死因子超家族成员6（又称Fas或CD5）的相对表达量显著上升（P<0.05）,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B（cyclin dependent kinase inhibitor 1B,P27）相对表达量显著上升（P<0.05）,而细胞周期素D1（Cyclin D1）、B淋巴细胞瘤因子2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A,P21）、Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X,apoptosis regulator,Bax）显著下降（P<0.05）。综上所述,敲低SQLE基因通过调节相关基因的表达抑制乳腺上皮细胞的增殖。     

热应激造成奶牛乳腺上皮细胞损伤并影响乳合成相关载体的基因表达

本试验以奶牛乳腺上皮细胞为模型,旨在寻找热应激下调奶牛泌乳功能的相关因素。42℃高温处理奶牛乳腺上皮细胞0、0.5、1、1.5、2、4、8及12h,检测其对细胞活率,线粒体膜电位,热休克分子及蛋白基因、氧化应激相关基因以及氨基酸和葡萄糖转运载体基因表达的影响。结果显示,不同时间热处理显著降低乳腺上皮细胞活率(P0.05),损伤细胞线粒体膜电位。HSP27基因表达显著下降(P0.05),HSP70基因表达显著上调(P0.05),HSP90基因表达在前4h显著上调(P0.05),后恢复至正常水平,HSF-1基因表达在某些时间点显著上调(P0.05)。氧化应激相关基因Keach样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)表达无显著变化(P0.05),核因子E2相关因子2(Nrf2)表达显著上调(P0.05),NAD(P)H脱氢酶醌-1(NQO1)表达显著上调(P0.05)。跨膜氨基酸转运载体SLC7A7基因表达在1h和4h显著上调(P0.05)。葡萄糖转运载体GLUT1及GLUT8基因表达显著下调(P0.05)。葡萄糖转运载体GLUT12在热处理0~2h表达显著上调,4~12h显著下调(P0.05)。热应激能够显著降低奶牛乳腺上皮细胞活率,引起氧化应激,改变热休克蛋白和分子及跨膜转运载体的基因表达。     

雌激素调控奶牛乳腺上皮细胞凋亡及生长周期作用机制的研究

试验旨在研究雌激素对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)凋亡及生长周期的影响。通过添加MAPK/ERK信号通路阻断剂探索雌激素调控BMECs凋亡及生长周期具体的作用机制,采用流式细胞仪检测细胞凋亡及周期的变化情况,实时荧光定量PCR检测Bcl-2、Caspase3及CyclinD1基因mRNA的表达丰度。结果显示,对照组BMECs凋亡率极显著低于BMECs+PD98059、BMECs+E_2+PD98059组(P0.01),Bcl-2 mRNA表达丰度极显著高于BMECs+PD98059组(P0.01),Caspase3 mRNA表达丰度显著低于BMECs+PD98059组(P0.05);对照组细胞比例在G1期显著高于BMECs+E_2组(P0.05),极显著低于BMECs+E_2+PD98059组(P0.01),S期细胞比例极显著高于BMECs+PD98059、BMECs+E_2+PD98059组(P0.01),G2期细胞比例极显著低于BMECs+PD98059、BMECs+E_2+PD98059组(P0.01);对照组CyclinD1 mRNA的表达丰度极显著高于BMECs+PD98059组(P0.01);BMECs+E_2+PD98059组的Bcl-2 mRNA的表达量极显著高于BMECs+PD98059组(P0.01),Caspase3 mRNA的表达量显著低于BMECs+PD98059组(P0.05)。结果表明,MAPK/ERK信号通路参与BMECs的增殖及细胞生长周期调节的过程,且雌激素可通过MAPK/ERK信号通路抑制BMECs的凋亡,MAPK/ERK信号通路可能参与由雌激素调控的细胞生长周期的进程。     

FADS2基因在奶牛乳腺细胞中的过表达和干扰研究

为了研究脂肪酸脱氢酶2(fatty acid desaturases 2,FADS2)基因在奶牛乳腺细胞脂肪酸代谢中的作用,本研究在奶牛乳腺上皮细胞中对FADS2基因进行过表达和干扰,研究FADS2基因表达对脂肪酸合成相关基因的调控及对奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯含量的影响。针对FADS2基因的CDS序列设计siRNA和过表达载体pcDNA3.1-FADS2-EGFP,转染奶牛乳腺细胞检测FADS2基因过表达和干扰对脂肪酸代谢相关基因表达的影响及细胞中甘油三酯含量的变化。结果显示,试验成功获得过表达载体pcDNA3.1-FADS2-EGFP和干扰片段,转染细胞后具有良好的过表达和干扰效果。FADS2基因过表达后,1-酰基甘油磷酸酰基转移酶(AGPAT1)、固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)、3-磷酸甘油转移酶(GPAM)、脂肪酸延长链5(ELOVL5)、乙酰辅酶A酰基转移酶1(ACAA1)、脂肪酸脱氢酶1(FADS1)、二酰基甘油转酰基酶1(DGAT1)和过氧化物酶体增殖激活受体α(PPARα)基因显著下调(P0.05),脂滴蛋白2(PLIN2)基因极显著上调(P0.01)。FADS2基因干扰过后可引起AGPAT1、GPAM、ELOVL5、ACAA1、PLIN2和FADS1基因显著上调(P0.05),脂肪酸合成胰岛素诱导基因1(INSIG1)极显著上调(P0.01),DGAT1和PPARα基因显著下调(P0.05)。甘油三酯检测结果显示,FADS2基因过表达和干扰均可降低奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯的含量。综上所述,在奶牛乳腺上皮细胞中,FADS2基因能调控脂质合成相关基因的表达,对乳腺脂质合成具有调控作用。     

漏芦乙醇提取物对奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路的影响

为了探讨漏芦乙醇提取物对奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路的影响,试验以体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型,先利用CASY细胞活力分析仪检测漏芦乙醇提取物(质量浓度分别为25,50,100,200,400μg/mL)作用于奶牛乳腺上皮细胞后乳腺上皮细胞的活力和增殖能力,选择添加对细胞生长增殖不受抑制即对细胞无毒性的漏芦乙醇提取物浓度来研究其对奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路信号分子表达的影响。采用确定浓度的漏芦乙醇提取物处理细胞,然后用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路关键信号分子信号转导与转录激活因子5(STAT5)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、胆固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)、过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)、丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)和葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)基因的mRNA表达水平,以及采用Western-blot技术检测奶牛乳腺上皮细胞泌乳信号通路关键信号分子的蛋白质表达水平。结果表明:较高剂量(200,400μg/mL)的漏芦乙醇提取物显著抑制了奶牛乳腺上皮细胞活力及增殖能力(P0.05),因此选择25,50,100μg/mL的漏芦乙醇提取物来研究其对乳腺上皮细胞泌乳信号通路信号分子表达的影响;25,50,100μg/mL的漏芦乙醇提取物可显著提高细胞泌乳信号通路信号分子STAT5、mTOR、SREBP1、AKT1、GLUT1基因的mRNA表达水平(P0.05)及p-STAT5、p-mTOR、SREBP1、p-AKT1、GLUT1蛋白质表达水平(P0.05),但对PPARγ基因的mRNA表达及蛋白质的表达无显著影响(P0.05)。说明漏芦乙醇提取物能通过调节泌乳信号通路关键信号分子的表达,进而促进奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白、乳脂和乳糖的合成。     

白藜芦醇缓解NEFA诱导的奶牛乳腺上皮细胞的周期阻滞和凋亡

围产期奶牛能量负平衡(negative energy balance, NEB)可引起高非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acids, NEFA)血症。大量NEFA被乳腺组织吸收,可诱发细胞凋亡。白藜芦醇(resveratrol, RES)是一种非黄酮类多酚有机化合物,具有抗炎抗凋亡等作用。目前,尚不清楚RES对高NEFA处理的乳腺上皮细胞(MAC-T)的周期阻滞和凋亡的影响。因此本研究主要探讨NEFA对MAC-T细胞周期阻滞和凋亡的影响以及RES是否能改善高浓度NEFA对MAC-T的病理作用。添加不同浓度的NEFA处理MAC-T,利用CCK-8细胞活力检测试剂盒检测细胞活力,通过Western blot检测细胞凋亡相关分子Caspase-3、Bcl-2、Bax和细胞周期调节因子Cyclin D1的蛋白表达水平,采用qRT-PCR法检测细胞凋亡相关因子Caspase-3、Bcl-2、Bax的mRNA转录水平,利用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡。结果显示,NEFA剂量依赖性地诱导MAC-T细胞凋亡,降低细胞活力,阻滞细胞周期。高NEFA显著增加Bax、Caspas...     

DDR1对奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡的调控作用

旨在通过干扰或过表达盘状蛋白结构域受体1（DDR1）基因,探讨其对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡及周期的影响。本研究将DDR1基因小干扰RNA片段和过表达载体pcDNA3.1-DDR1转染奶牛乳腺上皮细胞,采用qRT-PCR和Western blot检测细胞中DDR1的干扰和过表达效果;利用CCK-8法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡（早凋、晚凋）的变化;利用qRT-PCR检测增殖与凋亡相关基因的表达情况。结果,在奶牛乳腺上皮细胞中干扰DDR1基因后,其mRNA和蛋白表达分别下调94%和30%,而过表达DDR1基因后,其mRNA和蛋白表达分别上调68.24和1.38倍;干扰DDR1极显著抑制细胞的增殖（P<0.01）,细胞早凋与晚凋比例极显著上升（P<0.01）;干扰组G1期细胞比例极显著上升（P<0.01）,S期细胞比例极显著下降（P<0.01）,G2期细胞比例显著下降（P<0.05）,提示细胞阻滞在G0/G1期。相反,过表达DDR1能显著促进细胞增殖（P<0.05）,显著抑制细胞晚期凋亡（P<0.05）,G1期细胞比例极显著下降（P<0.01）,S期细胞比例极显著上升（P<0.01）,促进细胞由G1期向S期的转换。qRT-PCR检测结果显示,干扰DDR1后显著上调BAX、Caspase9基因的表达（P<0.05）,极显著上调P53、FAS基因的表达（P<0.01）,且显著下调PCNA、CyclinB1基因的表达（P<0.05）;过表达DDR1后,分别显著和极显著下调Cytc与BAX基因的表达（P<0.05,P<0.01）,并极显著上调CyclinB1基因的表达（P<0.01）。综上可见,DDR1能够调控奶牛乳腺上皮细胞的增殖、凋亡和周期,可为阐明DDR1参与奶牛乳腺上皮细胞生长发育的分子机制提供参考。     

脐带间充质干细胞通过类胰岛素样生长因子-Ⅰ介导的Janus激酶/信号转导及转录活化因子信号通路抑制奶牛乳腺上皮细胞凋亡的体外研究

本试验旨在探究Janus激酶/信号转导及转录活化因子(JAK/STAT)信号通路是否参与脐带间充质干细胞(UC-MSCs)通过类胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)抑制奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)凋亡的调节。将UC-MSCs和BMECs利用TranswellTM小室双层共培养,以BMECs单纯培养为对照,给予类胰岛素样生长因子-Ⅰ受体(IGF-ⅠR)抑制剂AG1024进行干预,并用信号阻断剂AG490处理细胞,24 h后采用实时荧光定量PCR检测各组细胞B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、B细胞淋巴瘤/白血病基因伴随蛋白x(Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)基因的相对表达丰度,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果表明:UC-MSCs和BMECs共培养组BMECs的凋亡率极显著低于其他各组(P0.01);UC-MSCs和BMECs共培养组Bcl-2基因的相对表达丰度较BMECs组极显著上调(P0.01),Caspase-3、Bax基因的相对表达丰度则显著或极显著下调(P0.05或P0.01);AG1024和AG490单独处理或二者共同处理升高了单独培养的BMECs和与UC-MSCs共培养的BMECs的凋亡率,并上调了Bax、Caspase-3基因的相对表达丰度,下调了Bcl-2基因的相对表达丰度,均具有统计学意义(P0.05或P0.01)。由此得出,UC-MSCs能够通过IGF-Ⅰ介导JAK/STAT信号通路调节BMECs凋亡相关基因的表达,降低BMECs的凋亡率。     

中药制剂抗肉鸡热应激作用机理的研究

50只1日龄艾维茵肉仔鸡饲养于人工气候室内,高温条件下饲养。随机分成对照组、试验组,试验组7日龄开始在日粮中添加0.1%的中药,连用7天。然后分别于14、21日龄分别取法氏囊,用流式细胞仪检测应激状态下法氏囊细胞凋亡率、细胞周期时相变化,Western blot方法检测法氏囊中Bcl-2和Caspase-3基因的蛋白表达水平。结果表明:试验组14、21日龄法氏囊细胞凋亡率明显低于对照组,差异显著(P0.05)。细胞周期时相发生变化,G1期细胞百分比数量明显减少,G2期细胞百分比数量明显增加,差异均显著(P0.05),S期细胞百分比变化不大,差异不显著(P0.05)。试验组法氏囊中Bcl-2的蛋白表达量高于对照组,差异显著(P0.05),而Caspase-3基因的蛋白表达水平与Bcl-2相反,对照组表达量明显高于试验组,差异显著(P0.05)。这表明中药对缓解热应激造成的法氏囊细胞凋亡的作用可能是通过上调Bcl-2基因、下调Caspase-3基因表达来完成的。     

L型氨基酸转运载体1对奶牛乳腺中β-酪蛋白表达的影响

为研究L型氨基酸转运载体1(L type amino acid transporter 1,LAT1)对奶牛乳腺中β-酪蛋白表达的作用,本试验采用PCR技术体外扩增奶牛LAT1基因并构建LAT1真核表达载体,采用脂质体转染技术将LAT1真核表达载体转染奶牛乳腺上皮细胞,并于转染48h后采用Western blotting技术检测LAT1过表达后乳腺上皮细胞中LAT1、4F2hc和β-酪蛋白的表达变化。荧光显微镜检测结果显示,LAT1真核表达载体成功转染奶牛乳腺上皮细胞;Western blotting检测结果显示,LAT1过表达的奶牛乳腺上皮细胞中LAT1极显著增加(P0.01),β-酪蛋白的表达显著升高(P0.05),4F2hc表达变化不显著(P0.05)。这些结果提示LAT1对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成具有促进作用。     

大豆异黄酮对高温下体外培养奶牛乳腺上皮细胞增殖和抗氧化能力的影响

本文旨在研究大豆异黄酮对高温下体外培养奶牛乳腺上皮细胞增殖和抗氧化能力的影响,采用细胞培养方法,将奶牛乳腺上皮细胞分为4组,分别在细胞基础培养基中添加0、10、100μg/m L和1000μg/mL的大豆异黄酮,各组细胞正常(37℃、5%CO2)培养48 h后,在42℃下处理1.5 h,再正常培养12 h检测相关指标。结果发现:(1)与0μg/mL组相比,100μg/mL和1000μg/mL大豆异黄酮组奶牛乳腺上皮细胞活性显著升高(P 0.05)。(2)与0μg/m L组相比,10～1000μg/mL大豆异黄酮组细胞活性氧(ROS)的浓度显著降低(P 0.05)。(3)与0μg/mL组相比,100μg/m L和1000μg/mL大豆异黄酮组细胞的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性显著升高(P 0.05),而乳酸脱氢酶(LDH)活性和一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)含量显著下降(P 0.05)。(4)与0μg/m L组相比,100μg/mL和1000μg/mL大豆异黄酮组细胞内Caspase3和Bax基因的相对表达显著降低(P 0.05),而Bcl-2基因的相对表达显著升高((P 0.05)。综上所述,大豆异黄酮能够通过增强奶牛乳腺上皮细胞的抗氧化能力,抑制细胞凋亡,进而促进细胞增殖。     

FADS2基因在奶牛乳腺细胞中的过表达和干扰研究

为了研究脂肪酸脱氢酶2(fatty acid desaturases 2,FADS2)基因在奶牛乳腺细胞脂肪酸代谢中的作用,本研究在奶牛乳腺上皮细胞中对FADS2基因进行过表达和干扰,研究FADS2基因表达对脂肪酸合成相关基因的调控及对奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯含量的影响。针对FADS2基因的CDS序列设计siRNA和过表达载体pcDNA3.1-FADS2-EGFP,转染奶牛乳腺细胞检测FADS2基因过表达和干扰对脂肪酸代谢相关基因表达的影响及细胞中甘油三酯含量的变化。结果显示,试验成功获得过表达载体pcDNA3.1-FADS2-EGFP和干扰片段,转染细胞后具有良好的过表达和干扰效果。FADS2基因过表达后,1-酰基甘油磷酸酰基转移酶(AGPAT1)、固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)、3-磷酸甘油转移酶(GPAM)、脂肪酸延长链5(ELOVL5)、乙酰辅酶A酰基转移酶1(ACAA1)、脂肪酸脱氢酶1(FADS1)、二酰基甘油转酰基酶1(DGAT1)和过氧化物酶体增殖激活受体α(PPARα)基因显著下调(P<0.05),脂滴蛋白2(PLIN2)基因极显著上调(P<0.01)。FADS2基因干扰过后可引起AGPAT1、GPAM、ELOVL5、ACAA1、PLIN2和FADS1基因显著上调(P<0.05),脂肪酸合成胰岛素诱导基因1(INSIG1)极显著上调(P<0.01),DGAT1和PPARα基因显著下调(P<0.05)。甘油三酯检测结果显示,FADS2基因过表达和干扰均可降低奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯的含量。综上所述,在奶牛乳腺上皮细胞中,FADS2基因能调控脂质合成相关基因的表达,对乳腺脂质合成具有调控作用。     

奶牛乳腺炎差异表达lncRNA BCL2对炎症及凋亡相关mRNA表达的影响

本研究旨在探讨长链非编码RNA BCL2(lncRNA BCL2)对奶牛乳腺上皮细胞炎症及凋亡中的调控作用。利用RNAhybrid、Targetscan和miRwalk软件分析lncRNA BCL2海绵吸附的miRNAs及其所靶向的mRNAs,并对这些靶基因进行KEGG通路富集分析；采用qPCR和lncRNA超表达技术研究了lncRNA BCL2在乳腺组织和乳腺上皮细胞炎症中的表达情况及其对乳腺上皮细胞炎症和凋亡相关基因表达的影响。结果发现，与对照组相比，lncRNA BCL2在临床乳腺炎奶牛的乳腺组织和LPS诱导炎症的乳腺上皮细胞中的表达量均显著下调(P<0.05);在lncRNA BCL2超表达的情况下，乳腺上皮细胞内炎症因子IL-1β与IL-8及炎症信号通路关键基因NF-κB(p65/p50)的表达量均显著上调(P<0.05);细胞凋亡相关的CASP3和CASP9基因的表达显著下降(P<0.05),BCL2表达量显著上调(P<0.001),且BCL2与BAX比值大于2。该结果与生物信息学分析结果相符，表明lncRNA BCL2可能通过lncRNA BCL2...     

苜蓿源miR168b通过靶向肉碱棕榈酰转移酶1A对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡和脂滴积累的调控研究北大核心CSCD

本试验旨在探究苜蓿源miRNAs(mtr-miRNAs)对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)增殖和凋亡的影响。试验首先通过CCK8、5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EdU)、流式细胞术、基因和蛋白定量等方法检测苜蓿源-miR168b(mtr-miR168b)对BMECs增殖、凋亡和周期的影响。然后,敲低mtr-miR168b靶基因肉碱棕榈酰转移酶1A(CPT1A)表达后,检测了BMECs的活力和凋亡。通过诱导转染后细胞,用氟硼二吡咯(Bodipy)染色和油红O染色检测mtr-miR168b和CPT1A基因干扰对BMECs脂滴合成的影响。结果表明:1)mtr-miR168b高表达极显著降低了BMECs活力(P<0.01)。2)mtr-miR168b高表达极显著抑制了BMECs增殖(P<0.01),延长了细胞G1~S期进程,极显著促进了细胞凋亡(P<0.01)。3)mtr-miR168b在BMECs中高表达极显著抑制了细胞增殖基因周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和细胞周期蛋白D2(Cyclin D2)的基因的表达水平(P<0.01),极显著增加了凋亡标志基因Bcl2关联X蛋白(BAX)基因的表达水平(P<0.01),极显著抑制了PCNA蛋白表达水平(P<0.01),极显著增加了BAX蛋白表达水平(P<0.01),并且mtr-miR168b显著抑制了蛋白激酶B(AKT)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)基因的表达水平(P<0.05)。4)mtr-miR168b高表达抑制了BMECs中脂滴的积累。5)干扰mtr-miR168b的靶基因CPT1A,对BMECs脂滴积累也有抑制作用。综上所述,mtr-miR168b可通过抑制BMECs增殖,促进细胞凋亡,并通过靶向CPT1A基因抑制BMECs中脂滴的生成。试验结果可为mtr-miRNAs调控牛奶乳脂合成提供分子层面的技术支撑。     

奶牛乳腺上皮细胞中miR-224靶基因的初步验证

利用生物信息学方法预测出miR-224可能的靶基因为ACADM、ACAT1、ALDH2和LPL,然后用实时荧光定量法检测了miR-224与其靶基因在奶牛乳腺上皮细胞中的表达量。结果显示:(1)miR-224的相对表达量。转染shNc组表达量低于转染mimics组而高于inhibitor组。(2)靶基因荧光定量结果表明,ACADM、ALDH2和LPL基因转染shNc组表达量低于转染inhibitor组而高于mimics组。(3)经SPSS22.0相关性分析表明:在乳腺上皮细胞中,ACADM、ALDH2和LPL基因的表达量与miR-224的表达量呈显著负相关,ACAT1基因与miR-224没有显著联系。初步验证说明,ACADM、ALDH2和LPL基因可能是miR-224的靶基因,为进一步探索miR-224在奶牛乳牛乳腺上皮细胞发挥的作用提供了一定的理论依据和研究基础。     

RNA干扰水牛MTPN基因对颗粒细胞增殖、凋亡及激素分泌的影响

本研究旨在探讨敲低MTPN基因对体外培养水牛颗粒细胞增殖、凋亡及雌激素、孕酮分泌的影响。应用RNAi技术敲低颗粒细胞中MTPN基因的表达水平,通过实时荧光定量PCR方法检测体外培养水牛颗粒细胞中MTPN基因及增殖和周期相关基因的表达情况,CCK-8法检测细胞增殖,借助流式细胞仪检测细胞周期的分布,采用ELISA试剂盒检测细胞培养液中雌激素与孕酮含量。结果显示,经siRNA(si-MTPN)转染颗粒细胞后,MTPN基因相对表达量下降60%(P0.01);细胞增殖受到显著抑制(P0.05),G1期细胞数量下降,S期细胞数量上升,G2期细胞数量极显著上升(P0.01),细胞被阻滞在G2期;增殖与周期相关基因Cyclin D2、Cytochrom C表达量显著上升(P0.05),Caspase9、Fas基因表达量极显著上升(P0.01);ELISA检测雌激素和孕酮分泌水平均显著下降(P0.05)。综上表明,敲低MTPN基因能通过调控相关基因的表达抑制体外培养水牛颗粒细胞的增殖及雌激素、孕酮的分泌水平,为阐明MTPN基因参与家畜卵泡发生的分子机制提供参考。     

L-茶氨酸对过氧化氢诱导山羊瘤胃上皮细胞凋亡的保护作用

本试验旨在研究L-茶氨酸对过氧化氢(H_2O_2)诱导山羊瘤胃上皮细胞凋亡的保护作用。采集42日龄的湘东黑山羊的瘤胃组织进行原代细胞分离、培养、纯化。对照组采用完全培养基,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别在完全培养基中添加800μmol/L H_2O_2、4 mmol/L L-茶氨酸+800μmol/L H_2O_2、8 mmol/L L-茶氨酸+800μmol/L H_2O_2和16 mmol/L L-茶氨酸+800μmol/L H_2O_2,每组3个重复。培养12 h后,采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率,采用流式细胞术检测细胞周期,采用实时定量PCR法和蛋白质印迹(Western blot)法检测Bax和Bcl-2基因及其蛋白的表达。结果表明:L-茶氨酸能显著提高H_2O_2损伤的瘤胃上皮细胞存活率(P0.05),显著增加S期细胞比例(P0.05),显著降低Bax基因和蛋白表达量(P0.05),显著提高Bcl-2基因和蛋白表达量(P0.05),显著提高Bcl-2和Bax基因和蛋白表达量的比值(P0.05)。结果提示,L-茶氨酸能通过抑制细胞凋亡来有效地保护由H_2O_2导致的瘤胃上皮细胞损伤;体外条件下,培养液中添加的L-茶氨酸浓度高于8 mm/L时能有效发挥抗凋亡作用。对瘤胃上皮细胞损伤有一定的治疗和保护作用。     

TGF-β1对奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡的影响

应用特异性方法检测转化生长因子(TGF-β1)对奶牛乳腺上皮细胞增殖和凋亡的作用,用不同浓度的TGF-β1作用于体外培养的奶牛乳腺上皮细胞,在不同时间收集培养细胞及其培养液,应用MTT法检测细胞增殖、应用分光度法检测caspase-3活性、测定DNA片段化率法检测细胞凋亡。结果表明,1、5、10ng/mL TGF-β1试验组与对照组比较细胞增殖差异显著(P<0.05),随TGF-β1浓度增大抑制细胞增殖作用增强。细胞凋亡检测显示,1、5、10ng/mL TGF-β1试验组与对照组比较细胞凋亡差异均显著(P<0.05),随TGF-β1浓度增大促进细胞凋亡作用增强。TGF-β1可以抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖,促进奶牛乳腺上皮细胞凋亡。     

奶牛乳腺中4F2hc基因的表达模式及亮氨酸对其表达的调控研究

为了研究4F2hc在奶牛乳腺中的表达模式及调控方式,进一步明确氨基酸在奶牛乳腺上皮细胞中的跨膜转运过程,本研究采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测了4F2hc在泌乳期和干奶期奶牛乳腺组织中的表达变化;在体外培养的泌乳期奶牛乳腺上皮细胞中添加亮氨酸,采用Western blotting和实时荧光定量PCR技术检测其对奶牛乳腺上皮细胞中4F2hc表达的影响;采用雷帕霉素抑制剂抑制mTOR信号通路,使用Western blotting方法检测mTOR信号抑制后奶牛乳腺上皮细胞中4F2hc表达以及乳蛋白合成的变化。结果显示,在泌乳期的奶牛乳腺组织中4F2hc的mRNA和蛋白表达水平均显著或极显著高于干奶期(P0.05,P0.01);在体外培养的奶牛乳腺上皮细胞中添加亮氨酸可以极显著提高乳腺上皮细胞中4F2hc的mRNA和蛋白质表达水平(P0.01);亮氨酸刺激可以激活细胞内的mTOR信号通路(P0.05),而雷帕霉素处理则可以显著抑制mTOR信号分子的磷酸化并极显著抑制亮氨酸诱导的4F2hc的表达(P0.05,P0.01),进而极显著抑制β-Casein的合成(P0.01)。以上研究结果表明,4F2hc基因的表达与奶牛乳腺的泌乳活性之间呈正相关,亮氨酸可以通过激活mTOR信号通路来调节4F2hc基因的表达,进而影响乳蛋白的合成。